eng
Выпуск #7/2016
К.Мочалов, А.Чистяков, Д.Соловьева, А.Мезин, В.Олейников, И.Набиев, И. Агапов, А.Ефимов
Инструментальное объединение конфокальной микроспектроскопии и 3D сканирующей зондовой нанотомографии
Инструментальное объединение конфокальной микроспектроскопии и 3D сканирующей зондовой нанотомографии
Просмотры: 2781
Разработан инструментальный подход к объединению конфокальной микроспектроскопии и 3D сканирующей зондовой нанотомографии в одном устройстве.
DOI:10.22184/1993-8578.2016.69.7.60.70
DOI:10.22184/1993-8578.2016.69.7.60.70
Теги: optical microspectroscopy scanning probe microscopy; ultramicrotomy scanning probe nanotomography оптическая микроскопия сканирующая зондовая микроскопия сканирующая зондовая нанотомография ультрамикротомия
Трехмерный наномасштабный корреляционный анализ оптических, спектральных и морфологических свойств объектов эффективен при исследовании внутренней структуры и элементного анализа различных нанокомпозитов, полупроводниковых наноматериалов и устройств на их основе, а также широкого круга биологических материалов. Суть корреляционной микроскопии – совместное применение различного типа микро- и спектроскопий, дающих качественно различную и взаимодополняющую информацию на одном и том же участке исследуемого образца. Данный подход открывает возможность наномасштабного определения объемной морфологии, физических параметров и химического состава, а также взаимной корреляции получаемых характеристик образца [1–3].
Круг задач, решаемых с помощью корреляционной микроскопии, весьма широк. В качестве примера целесообразно привести два наиболее популярных направления: исследования в области наук о материалах, направленные на характеризацию и контроль качества наногибридных композитов [4], и биологические исследования, например, для определения объемного распределения флуоресцентных маркеров в живых тканях с измерением наномасштабной топографии исследуемых объектов [1].
Корреляционная микроскопия является комплементарным объединением различных методов микроскопии и / или спектроскопии, дающих качественно различную информацию об исследуемом объекте. При этом чаще всего используется объединение электронной микроскопии (ЭМ) и оптической микроспектроскопии (ОМ), а также различных подходов для получения 3D-информации этими методами [1, 2, 5, 6]. Однако, низкий контраст на биологических и полимерных образцах, повреждения образцов электронным пучком и необходимость использовать двумерные проекции ограничивают возможности ЭМ и ее применимость для анализа ряда биологических объектов и мягких материалов [7–9]. Во многих случаях предпочтительным оказывается использование сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ), поскольку она имеет неразрушающий характер и является в первую очередь методом характеризации поверхности. СЗМ дает информацию о расположении, архитектуре и различных свойствах (механических, электрических, магнитных) наноструктур непосредственно с поверхности образца, что делает этот метод чрезвычайно полезным для исследования ультраструктуры самых различных объектов [10]. Объединение зондовой и оптической микроскопии широко применяется в настоящее время для различных биологических приложений [3, 11], однако главным недостатком данного коррелятивного метода остается невозможность исследования наномасштабных трехмерных структур.
Значительным прорывом в области 3D-анализа с использованием СЗМ было создание уникальной аппаратной комбинации [12–14], объединяющей технику СЗМ и ультрамикротомии (УМТ), что позволило многократно выполнять сверхтонкие (до 20 нм) срезы с поверхности образца с последующим получением СЗМ-изображений, восстанавливая, таким образом, 3D-морфологию образца (подход "срез и вид"). Данная методика, названная сканирующей зондовой нано-томографией (СЗНТ), может быть использована для исследования 3D-распределения таких физических параметров, как модуль упругости, вязкость, магнитные свойства и электропроводность [13], при комнатной температуре или в криокамере микротома [14]. В отличие от электронной томографии, эта технология не имеет принципиальных ограничений по толщине анализируемого объекта.
Тем не менее, СЗНТ обладает существенным недостатком – отсутствием возможности наномасштабного анализа химического состава исследуемых наноструктур. Ранее авторами была предпринята попытка создания экспериментальной процедуры, предусматривающей попеременное использование установок СЗНТ и СЗМ / ОМ с согласованием полей зрения приборов через получение референсного СЗМ-изображения [15]. Недостатком указанной методики является отсутствие единой экспериментальной установки, позволяющей одновременно получать СЗМ- и ОМ-данные с последующим микротомированием образца и прецизионным приведением его в исходное положение, не вынимая из прибора. Создание такой установки требует существенной переработки всей разработанной ранее системы СЗНТ и создания специализированного конфокального блока.
СЗНТ / ОМ-УСТРОЙСТВО
В данной работе мы представляем объединенную систему СЗНТ / ОМ. Основой системы СЗНТ является ультрамикротом Reichert-Jung Ultracut E (Leica Microsystems, Австрия), адаптированный под использование специально разработанной СЗМ-головы. Подобной адаптации может быть подвергнут практически любой коммерчески доступный микротом. Для решения двух существенных проблем, препятствующих созданию комбинированной методики СЗНТ / ОМ – отсутствия оптического доступа для высокоапертурных объективов и высокого уровня шума, – была разработана специализированная сканирующая СЗМ-система, изображенная на рис.1.
Данная система (рис.1, слева) состоит из сканирующего устройства и устройства подвода с дефлектометром (СЗМ-голова). Сканирующее устройство состоит из плоско-параллельного быстродействующего XYZ-пьезопозиционера с диапазоном сканирования 50 × 50 × 5 мкм, снабженного оптическим сенсором для удержания и контроля перемещения в режиме линеаризации (close-loop). Пьезосканер позволяет использовать скорости сканирования до 5 Гц, так как имеет достаточно высокие резонансные частоты: 5 Гц по XY и 50 Гц по Z. Пьезопозиционер жестко закреплен на подвижной консоли УМТ и перемещается вместе с ней в процессе работы УМТ. В центре пьезосканера находится система жесткого крепления образца, не позволяющая ему смещаться в процессе среза УМТ. Подвижная консоль УМТ с образцом перемещается из верхней точки, где она фиксируется для проведения СЗМ / ОМ-измерений, в нижнюю точку, срезая образец алмазным ножом Ultra AFM 35 (Diatome, Швейцария). Таким образом, Z-координата XY-плоскости образца, являющейся как фокальной плоскостью ОМ-объектива, так и плоскостью СЗМ-сканирования, после среза полностью определяется положением ножа УМТ, что обуславливает необходимость разработки специализированного держателя для регулирования XY-плоскости образца. Ось Z в данной системе соосна подвижной консоли УМТ и в верхней точке совпадает с осью оптического тракта.
СЗМ-голова (рис.1, справа) представляет собой съемный держатель СЗМ-зонда и дефлектометр, состоящий из полупроводникового лазера и четырехсекционного фотодиода, разнесенные таким образом, чтобы дать возможность приблизить и сфокусировать на образце объектив (50X Mitutoyo Plan Apo Infinity Corrected Long WD Objective, Mitutoyo, Япония) с рабочим расстоянием 13 мм. Таким образом, решается первая из вышеуказанных проблем. С целью шумоподавления СЗМ-голова в момент СЗМ/OM-измерений закреплена непосредственно на подвижной консоли УМТ и находится в верхней "рабочей" точке. Для очередного УМТ-среза СЗМ-голова отводится, отсоединяется от консоли УМТ, оставаясь на опорах, а последняя, продолжая движение вниз, производит следующий срез образца. Такой подход обеспечивает значительное снижение веса механизма УМТ в процессе срезов и необходимую пространственную развязку между держателем кантилевера и ножом УМТ в момент среза. Разработанная нами система позволяет осуществлять XY-позиционирование СЗМ-головы с точностью менее 1 мкм между циклами срезов УМТ.
Схема объединения модернизированной СЗНТ-установки и оптической части разработанного устройства приведена на рис.2. Объединение заключается в добавлении к описанной схеме высокоапертурного объектива (рис.2, левая панель). Для удовлетворения всех требований к позиционированию, объектив устанавливается на плоскопараллельный XYZ-пьезопозиционер с отверстием в центре и специально разработанным переходником для горизонтального крепления, чтобы центр масс объектива находился в районе верхней плоскости сканера. Использовался сканер с диапазоном сканирования 100 × 100 × 50 мкм, снабженный емкостными датчиками для удержания и контроля перемещения. Таким образом, мы получили возможность прецизионного (0,1 нм) позиционирования центра поля зрения объектива и положения острия зонда СЗМ на участке 100 × 100 мкм. Диапазон Z-позиционирования объектива составляет 50 мкм с шагом 0,1 нм. Пьезопозиционер установлен на моторизированный 1D линейный ретранслятор 8MT177-100 (Standa, Литва) с диапазоном движения 100 мм и разрешением 1 мкм/шаг для возможности отводить его в автоматическом режиме и подводить обратно, не выходя из рабочей области прецизионной фокусировки объектива (50 мкм). Объектив совмещен с конфокальным модулем, входящим в состав флуоресцентной / рамановской / конфокальной системы (рис.2, справа). Как показано в нижней части рис.2, данная конфокальная часть объединена с монохроматором Andor Shamrock 750 с CCD-камерой Andor DU971P-BV (Andor Technology), а также с лазером (488 нм) GN-519M Ar+ (Plazma, Россия), который фильтруется краевым фильтром Semrock 488-nm RazorEdge (Rochester, США). Для возбуждения флуоресценции образца интенсивность лазерного излучения составляла 200 мкВт, что фиксировалось измерителем интенсивности LaserMate-Q (Coherent, США).
При исследовании СЗМ-топографии использовалась скорость сканирования 1 Гц при площади сканирования 512 × 512 точек, а для конфокальных флуоресцентных измерений площадь сканирования составляла 50 × 50 точек при времени накопления 0,3 с на точку.
Используемая конфигурация позволяет реализовать на данной установке практически все методики СЗМ: контактную и полуконтактную АСМ, латеральную силовую микроскопию (ЛСМ), магнитную силовую микроскопию (МСМ), фазовую визуализацию, электрические измерительные техники и др. [10]. Восстановление 3D-морфологии и распределения физических параметров в виде воксельных 3D-изображений проводилось с помощью программного обеспечения ImagePro Plus 6.0 с функцией построения 3D-изображений (Media Cybernetics, США).
ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ
В данной работе исследовались морфологические и оптические свойства наногибридного материала, основанного на внедрении флуоресцентных полупроводниковых квантовых точек (КТ) в полимерную сетку с эффектом памяти, которая образована путем фотополимеризации мономеров (diacrylate RM257, monoacrylate A4CB) и фотоинициатора (Irgacure 651) в присутствии смеси нематических жидких кристаллов (ЖК) E48 и хирального допанта HexSorb. Таким образом, создаются фотонные структуры КТ / полимерная сеть (КТ / ПС), где флуоресцентные КТ в концентрации до нескольких весовых процентов находятся в своеобразной брегговской решетке с шагом 200 нм. Пик брегговского селективного отражения света находится на 580 нм. В данной работе использовались флуоресцентные КТ с пиком флуоресценции 575 нм. Подробное описание синтеза данных структур приведено в работе [16].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Система СЗНТ / OM была использована для исследования гибридных систем КТ / ПС. Целью данного исследования являлось установление корреляции между особенностями морфологии образцов и пространственным распределением полупроводниковых флуоресцирующих КТ в этих структурах. В ходе исследований были получены 2D- и 3D-данные АСМ (рис.3a, 3 b), а также конфокальные флуоресцентные изображения на выбранных 2D АСМ-сканах.
На рис.3b приведено наиболее типичное из этих конфокальных флуоресцентных изображений, соответствующее 2D АСМ-скану, представленному на рис.3а. Из сравнения рис.3а и 3b явственно следует, что распределение флуоресцентной интенсивности далеко не во всех случаях соответствует топографическим особенностям. Общая неравномерность флуоресцентной интенсивности, усредненная по пяти флуоресцентным 2D-изображениям, составила около 500%. При этом важно, что образуемая ПС периодическая структура практически не имеет серьезных дефектов во всем объеме образца (рис.3с). Таким образом, для создания эффективных фотонных устройств на базе гибридных систем КТ/ПС, в которых реализуется эффективная модуляция флуоресценции КТ периодической решеткой на основе ПС [16], необходимо существенно улучшать стадию внедрения КТ в полимерную матрицу для обеспечения равномерного ее заполнения и равномерной пространственной светимости фотонных устройств.
Основным результатом данной работы является разработка и апробация в реальных исследованиях единого аппарата для реализации методики СЗНТ / ОМ. Многообразие возможностей СЗНТ / ОМ обусловлено эффектом сложения всего спектра возможностей СЗМ и оптической микроспектроскопии. Многообещающей выглядит потенциальная возможность адаптации разработанной системы для сочетания методов СЗНТ / ОМ и оптической микроскопии для преодоления дифракционного предела. Данное направление можно считать наиболее актуальным, поскольку основным недостатком современной реализации СЗНТ / ОМ является чрезвычайно низкое, по сравнению с СЗМ, пространственное разрешение OM, не позволяющее устанавливать точную корреляцию между морфологией и данными ОМ. Уже сейчас в разработанной системе без существенных модификаций ключевых блоков могут быть использованы такие прогрессивные методики высокоразрешающей ОМ, как стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (STORM) [17], фотоактивирующая локализационная микроскопия (PALM) [18] и микроскопия на основе подавления спонтанного испускания (STED) [19].
Нынешняя версия разработанной системы позволяет реализовать 3D-версии таких зондово-оптических методов как спектроскопия комбинационного рассеяния с усилением наконечника (TERS) [20] и рассеивающая ближнепольная оптическая микроскопия (s-SNOM) [21]. Незначительные изменения, связанные с системой лазерного возбуждения, потребуются для использования 3D-версии новейшей методики фотоиндуцированной силовой микроскопии (PiFM) [22]. Значительно более серьезные, но вполне реализуемые изменения потребуются в случае преобразования 2D в 3D АСМ–ИК [23].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Разработан и опробован в практических исследованиях единый комплексный аппарат для реализации методики СЗНТ / ОМ. Данная методика открывает широкие перспективы в области многопараметрического корреляционного объемного анализа композитных наноструктурированных материалов (включая биоматериалы) и объединяет в себе технику СЗМ, OM и УМТ. Такое объединение позволяет многократно производить сверхтонкие (до 20 нм) срезы с поверхности образца с последующим получением последовательного набора 2D-данных практически во всех режимах СЗМ и в большинстве режимов конфокальной микроспектроскопии (подход "срез и вид"). Объединение полученных данных в единый массив позволяет провести 3D-характеризацию морфологии, химического состава, межкомпонентных взаимодействий, механических, электрических, магнитных и других свойств в объеме многокомпонентных материалов.
Наиболее перспективным представляется возможность использования методики СЗНТ / ОМ для преобразования 2D в 3D с реализацией таких зондово-оптических техник, как TERS, s-SNOM, АСМ–ИК и других, позволяющих повысить разрешающую способность ОМ до уровня СЗМ.
Разработанная методика опробована для исследования морфологических и оптических свойств наногибридного материала, основанного на внедрении флуоресцентных полупроводниковых КТ в полимерную сетку с эффектом памяти, полученную путем фотополимеризации мономеров в присутствии смеси нематических ЖК и хирального допанта. Данные композитные структуры имеют значительный потенциал для получения фотонных устройств с эффективной модуляцией флуоресценции КТ периодической решеткой на основе ПС, что может быть использовано для создания однофотонных источников света, систем хранения и отображения информации, а также устройств с низкопороговой лазерной генерацией.
Исследование поддержано грантом Министерства образования и науки РФ (14.587.21.0021, RFMEFI58715X0021) и технологической платформой Nano’Mat Шампань-Арден, Франция.
ЛИТЕРАТУРА
Caplan J., Niethammer M., Taylor R.M., Czymmek K.J. Current Opinion in Structural Biology. 2011. 21(5). 686.
Timmermans F.J., Otto C. Rev. Sci. Instrum. 2015. 86(1). 011501.
Lucas M., Riedo E. Rev. Sci. Instrum. 2012. 83. 061101.
Mirzaei J., Reznikov M., Hegmann T. J. Mater. Chem. 2012. 22. 22350.
Mironov A.A., Beznoussenko G.V. Journal of microscopy. 2009. 235(3). 308.
Spiegelhalter C., Tosch V., Hentsch D., Koch M., Kessler P., Schwab Y., Laporte J. PLoS ONE. 2010. 5(2). e9014.
Pilhofer M., Ladinsky M.S., McDowall A.W., Jensen G.J. Methods Cell Biol. 2010. 96. 21.
Bouchet-Marquis C., Hoenger A. Micron. 2011. 42. 152.
Al-Abboodi A., Fu J., Doran P.M., Chan P.P.Y. Biotechnol. Bioeng. 2013. 110. 318.
Mironov V.L. Fundamentals of Scanning Probe Microscopy – The Russian academy of sciences institute for physics of microstructures: Nizhniy Novgorod, 2004. 97 p.
Bhushan B., Fuchs H. (Eds.) Applied Scanning Probe Methods XII: Characterization, Chapter 11: Applications of Scanning Near-Field Optical Microscopy in Life Science. 2009.
Efimov A.E., Tonevitsky A.G., Dittrich M., Matsko N.B. J. Microsc. 2007. 226. 207.
Alekseev A., Agapova O.I., Mochalov K.E., Agapov I.I. Advanced Materials. 2009. 21. 48.
Efimov A.E., Gnaegi H., Schaller R., Grogger W., Hoferde F., Matsko N.B. Soft Matter. 2012. 8. 9756.
Mochalov K.E., Efimov A.E., Bobrovsky A., Agapov I.I., Chistyakov A.A., Oleinikov V., Sukhanova A., Nabiev I. ACS Nano. 2013. 7(10). 8953.
Bobrovsky A., Samokhvalov P., Shibaev V. Advanced Optical Materials. 2014. 2. 1167.
Rust M.J., Bates M., Zhuang X. Nature Methods. 2006. 3. 793.
Betzig E.G., Patterson H., Sougrat R., Lindwasser O.W., Olenych S., Bonifacino J.S., Davidson M.W., Lippincott-Schwartz J.H., Hess F. Science. 2006. 313. 1642.
Westphal V., Rizzoli S.O., Lauterbach M.A., Kamin D., Jahn R., Hell S.W. Science. 2008. 320. 246.
Anderson N., Hartschuh A., Novotny L. Materials Today. 2005. 8. 50.
Specht M., Pedarning J.D., Heckl W.M., Hansch T.W. Phys.Rev.Lett. 1992. 68. 476.
Jahng J., Fishman D.A., Park S., Nowak D.B., Morrison W.A., Wickramasinghe H.K., Potma E.O. Acc. Chem. Res. 2015. 48. 2671.
Dazzi A., Prater C.B., Hu Q., Chase D.B., Rabolt J.F., Marcott C. Appl. Spectrosc. 2012. 66. 1365.
Круг задач, решаемых с помощью корреляционной микроскопии, весьма широк. В качестве примера целесообразно привести два наиболее популярных направления: исследования в области наук о материалах, направленные на характеризацию и контроль качества наногибридных композитов [4], и биологические исследования, например, для определения объемного распределения флуоресцентных маркеров в живых тканях с измерением наномасштабной топографии исследуемых объектов [1].
Корреляционная микроскопия является комплементарным объединением различных методов микроскопии и / или спектроскопии, дающих качественно различную информацию об исследуемом объекте. При этом чаще всего используется объединение электронной микроскопии (ЭМ) и оптической микроспектроскопии (ОМ), а также различных подходов для получения 3D-информации этими методами [1, 2, 5, 6]. Однако, низкий контраст на биологических и полимерных образцах, повреждения образцов электронным пучком и необходимость использовать двумерные проекции ограничивают возможности ЭМ и ее применимость для анализа ряда биологических объектов и мягких материалов [7–9]. Во многих случаях предпочтительным оказывается использование сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ), поскольку она имеет неразрушающий характер и является в первую очередь методом характеризации поверхности. СЗМ дает информацию о расположении, архитектуре и различных свойствах (механических, электрических, магнитных) наноструктур непосредственно с поверхности образца, что делает этот метод чрезвычайно полезным для исследования ультраструктуры самых различных объектов [10]. Объединение зондовой и оптической микроскопии широко применяется в настоящее время для различных биологических приложений [3, 11], однако главным недостатком данного коррелятивного метода остается невозможность исследования наномасштабных трехмерных структур.
Значительным прорывом в области 3D-анализа с использованием СЗМ было создание уникальной аппаратной комбинации [12–14], объединяющей технику СЗМ и ультрамикротомии (УМТ), что позволило многократно выполнять сверхтонкие (до 20 нм) срезы с поверхности образца с последующим получением СЗМ-изображений, восстанавливая, таким образом, 3D-морфологию образца (подход "срез и вид"). Данная методика, названная сканирующей зондовой нано-томографией (СЗНТ), может быть использована для исследования 3D-распределения таких физических параметров, как модуль упругости, вязкость, магнитные свойства и электропроводность [13], при комнатной температуре или в криокамере микротома [14]. В отличие от электронной томографии, эта технология не имеет принципиальных ограничений по толщине анализируемого объекта.
Тем не менее, СЗНТ обладает существенным недостатком – отсутствием возможности наномасштабного анализа химического состава исследуемых наноструктур. Ранее авторами была предпринята попытка создания экспериментальной процедуры, предусматривающей попеременное использование установок СЗНТ и СЗМ / ОМ с согласованием полей зрения приборов через получение референсного СЗМ-изображения [15]. Недостатком указанной методики является отсутствие единой экспериментальной установки, позволяющей одновременно получать СЗМ- и ОМ-данные с последующим микротомированием образца и прецизионным приведением его в исходное положение, не вынимая из прибора. Создание такой установки требует существенной переработки всей разработанной ранее системы СЗНТ и создания специализированного конфокального блока.
СЗНТ / ОМ-УСТРОЙСТВО
В данной работе мы представляем объединенную систему СЗНТ / ОМ. Основой системы СЗНТ является ультрамикротом Reichert-Jung Ultracut E (Leica Microsystems, Австрия), адаптированный под использование специально разработанной СЗМ-головы. Подобной адаптации может быть подвергнут практически любой коммерчески доступный микротом. Для решения двух существенных проблем, препятствующих созданию комбинированной методики СЗНТ / ОМ – отсутствия оптического доступа для высокоапертурных объективов и высокого уровня шума, – была разработана специализированная сканирующая СЗМ-система, изображенная на рис.1.
Данная система (рис.1, слева) состоит из сканирующего устройства и устройства подвода с дефлектометром (СЗМ-голова). Сканирующее устройство состоит из плоско-параллельного быстродействующего XYZ-пьезопозиционера с диапазоном сканирования 50 × 50 × 5 мкм, снабженного оптическим сенсором для удержания и контроля перемещения в режиме линеаризации (close-loop). Пьезосканер позволяет использовать скорости сканирования до 5 Гц, так как имеет достаточно высокие резонансные частоты: 5 Гц по XY и 50 Гц по Z. Пьезопозиционер жестко закреплен на подвижной консоли УМТ и перемещается вместе с ней в процессе работы УМТ. В центре пьезосканера находится система жесткого крепления образца, не позволяющая ему смещаться в процессе среза УМТ. Подвижная консоль УМТ с образцом перемещается из верхней точки, где она фиксируется для проведения СЗМ / ОМ-измерений, в нижнюю точку, срезая образец алмазным ножом Ultra AFM 35 (Diatome, Швейцария). Таким образом, Z-координата XY-плоскости образца, являющейся как фокальной плоскостью ОМ-объектива, так и плоскостью СЗМ-сканирования, после среза полностью определяется положением ножа УМТ, что обуславливает необходимость разработки специализированного держателя для регулирования XY-плоскости образца. Ось Z в данной системе соосна подвижной консоли УМТ и в верхней точке совпадает с осью оптического тракта.
СЗМ-голова (рис.1, справа) представляет собой съемный держатель СЗМ-зонда и дефлектометр, состоящий из полупроводникового лазера и четырехсекционного фотодиода, разнесенные таким образом, чтобы дать возможность приблизить и сфокусировать на образце объектив (50X Mitutoyo Plan Apo Infinity Corrected Long WD Objective, Mitutoyo, Япония) с рабочим расстоянием 13 мм. Таким образом, решается первая из вышеуказанных проблем. С целью шумоподавления СЗМ-голова в момент СЗМ/OM-измерений закреплена непосредственно на подвижной консоли УМТ и находится в верхней "рабочей" точке. Для очередного УМТ-среза СЗМ-голова отводится, отсоединяется от консоли УМТ, оставаясь на опорах, а последняя, продолжая движение вниз, производит следующий срез образца. Такой подход обеспечивает значительное снижение веса механизма УМТ в процессе срезов и необходимую пространственную развязку между держателем кантилевера и ножом УМТ в момент среза. Разработанная нами система позволяет осуществлять XY-позиционирование СЗМ-головы с точностью менее 1 мкм между циклами срезов УМТ.
Схема объединения модернизированной СЗНТ-установки и оптической части разработанного устройства приведена на рис.2. Объединение заключается в добавлении к описанной схеме высокоапертурного объектива (рис.2, левая панель). Для удовлетворения всех требований к позиционированию, объектив устанавливается на плоскопараллельный XYZ-пьезопозиционер с отверстием в центре и специально разработанным переходником для горизонтального крепления, чтобы центр масс объектива находился в районе верхней плоскости сканера. Использовался сканер с диапазоном сканирования 100 × 100 × 50 мкм, снабженный емкостными датчиками для удержания и контроля перемещения. Таким образом, мы получили возможность прецизионного (0,1 нм) позиционирования центра поля зрения объектива и положения острия зонда СЗМ на участке 100 × 100 мкм. Диапазон Z-позиционирования объектива составляет 50 мкм с шагом 0,1 нм. Пьезопозиционер установлен на моторизированный 1D линейный ретранслятор 8MT177-100 (Standa, Литва) с диапазоном движения 100 мм и разрешением 1 мкм/шаг для возможности отводить его в автоматическом режиме и подводить обратно, не выходя из рабочей области прецизионной фокусировки объектива (50 мкм). Объектив совмещен с конфокальным модулем, входящим в состав флуоресцентной / рамановской / конфокальной системы (рис.2, справа). Как показано в нижней части рис.2, данная конфокальная часть объединена с монохроматором Andor Shamrock 750 с CCD-камерой Andor DU971P-BV (Andor Technology), а также с лазером (488 нм) GN-519M Ar+ (Plazma, Россия), который фильтруется краевым фильтром Semrock 488-nm RazorEdge (Rochester, США). Для возбуждения флуоресценции образца интенсивность лазерного излучения составляла 200 мкВт, что фиксировалось измерителем интенсивности LaserMate-Q (Coherent, США).
При исследовании СЗМ-топографии использовалась скорость сканирования 1 Гц при площади сканирования 512 × 512 точек, а для конфокальных флуоресцентных измерений площадь сканирования составляла 50 × 50 точек при времени накопления 0,3 с на точку.
Используемая конфигурация позволяет реализовать на данной установке практически все методики СЗМ: контактную и полуконтактную АСМ, латеральную силовую микроскопию (ЛСМ), магнитную силовую микроскопию (МСМ), фазовую визуализацию, электрические измерительные техники и др. [10]. Восстановление 3D-морфологии и распределения физических параметров в виде воксельных 3D-изображений проводилось с помощью программного обеспечения ImagePro Plus 6.0 с функцией построения 3D-изображений (Media Cybernetics, США).
ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ
В данной работе исследовались морфологические и оптические свойства наногибридного материала, основанного на внедрении флуоресцентных полупроводниковых квантовых точек (КТ) в полимерную сетку с эффектом памяти, которая образована путем фотополимеризации мономеров (diacrylate RM257, monoacrylate A4CB) и фотоинициатора (Irgacure 651) в присутствии смеси нематических жидких кристаллов (ЖК) E48 и хирального допанта HexSorb. Таким образом, создаются фотонные структуры КТ / полимерная сеть (КТ / ПС), где флуоресцентные КТ в концентрации до нескольких весовых процентов находятся в своеобразной брегговской решетке с шагом 200 нм. Пик брегговского селективного отражения света находится на 580 нм. В данной работе использовались флуоресцентные КТ с пиком флуоресценции 575 нм. Подробное описание синтеза данных структур приведено в работе [16].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Система СЗНТ / OM была использована для исследования гибридных систем КТ / ПС. Целью данного исследования являлось установление корреляции между особенностями морфологии образцов и пространственным распределением полупроводниковых флуоресцирующих КТ в этих структурах. В ходе исследований были получены 2D- и 3D-данные АСМ (рис.3a, 3 b), а также конфокальные флуоресцентные изображения на выбранных 2D АСМ-сканах.
На рис.3b приведено наиболее типичное из этих конфокальных флуоресцентных изображений, соответствующее 2D АСМ-скану, представленному на рис.3а. Из сравнения рис.3а и 3b явственно следует, что распределение флуоресцентной интенсивности далеко не во всех случаях соответствует топографическим особенностям. Общая неравномерность флуоресцентной интенсивности, усредненная по пяти флуоресцентным 2D-изображениям, составила около 500%. При этом важно, что образуемая ПС периодическая структура практически не имеет серьезных дефектов во всем объеме образца (рис.3с). Таким образом, для создания эффективных фотонных устройств на базе гибридных систем КТ/ПС, в которых реализуется эффективная модуляция флуоресценции КТ периодической решеткой на основе ПС [16], необходимо существенно улучшать стадию внедрения КТ в полимерную матрицу для обеспечения равномерного ее заполнения и равномерной пространственной светимости фотонных устройств.
Основным результатом данной работы является разработка и апробация в реальных исследованиях единого аппарата для реализации методики СЗНТ / ОМ. Многообразие возможностей СЗНТ / ОМ обусловлено эффектом сложения всего спектра возможностей СЗМ и оптической микроспектроскопии. Многообещающей выглядит потенциальная возможность адаптации разработанной системы для сочетания методов СЗНТ / ОМ и оптической микроскопии для преодоления дифракционного предела. Данное направление можно считать наиболее актуальным, поскольку основным недостатком современной реализации СЗНТ / ОМ является чрезвычайно низкое, по сравнению с СЗМ, пространственное разрешение OM, не позволяющее устанавливать точную корреляцию между морфологией и данными ОМ. Уже сейчас в разработанной системе без существенных модификаций ключевых блоков могут быть использованы такие прогрессивные методики высокоразрешающей ОМ, как стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (STORM) [17], фотоактивирующая локализационная микроскопия (PALM) [18] и микроскопия на основе подавления спонтанного испускания (STED) [19].
Нынешняя версия разработанной системы позволяет реализовать 3D-версии таких зондово-оптических методов как спектроскопия комбинационного рассеяния с усилением наконечника (TERS) [20] и рассеивающая ближнепольная оптическая микроскопия (s-SNOM) [21]. Незначительные изменения, связанные с системой лазерного возбуждения, потребуются для использования 3D-версии новейшей методики фотоиндуцированной силовой микроскопии (PiFM) [22]. Значительно более серьезные, но вполне реализуемые изменения потребуются в случае преобразования 2D в 3D АСМ–ИК [23].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Разработан и опробован в практических исследованиях единый комплексный аппарат для реализации методики СЗНТ / ОМ. Данная методика открывает широкие перспективы в области многопараметрического корреляционного объемного анализа композитных наноструктурированных материалов (включая биоматериалы) и объединяет в себе технику СЗМ, OM и УМТ. Такое объединение позволяет многократно производить сверхтонкие (до 20 нм) срезы с поверхности образца с последующим получением последовательного набора 2D-данных практически во всех режимах СЗМ и в большинстве режимов конфокальной микроспектроскопии (подход "срез и вид"). Объединение полученных данных в единый массив позволяет провести 3D-характеризацию морфологии, химического состава, межкомпонентных взаимодействий, механических, электрических, магнитных и других свойств в объеме многокомпонентных материалов.
Наиболее перспективным представляется возможность использования методики СЗНТ / ОМ для преобразования 2D в 3D с реализацией таких зондово-оптических техник, как TERS, s-SNOM, АСМ–ИК и других, позволяющих повысить разрешающую способность ОМ до уровня СЗМ.
Разработанная методика опробована для исследования морфологических и оптических свойств наногибридного материала, основанного на внедрении флуоресцентных полупроводниковых КТ в полимерную сетку с эффектом памяти, полученную путем фотополимеризации мономеров в присутствии смеси нематических ЖК и хирального допанта. Данные композитные структуры имеют значительный потенциал для получения фотонных устройств с эффективной модуляцией флуоресценции КТ периодической решеткой на основе ПС, что может быть использовано для создания однофотонных источников света, систем хранения и отображения информации, а также устройств с низкопороговой лазерной генерацией.
Исследование поддержано грантом Министерства образования и науки РФ (14.587.21.0021, RFMEFI58715X0021) и технологической платформой Nano’Mat Шампань-Арден, Франция.
ЛИТЕРАТУРА
Caplan J., Niethammer M., Taylor R.M., Czymmek K.J. Current Opinion in Structural Biology. 2011. 21(5). 686.
Timmermans F.J., Otto C. Rev. Sci. Instrum. 2015. 86(1). 011501.
Lucas M., Riedo E. Rev. Sci. Instrum. 2012. 83. 061101.
Mirzaei J., Reznikov M., Hegmann T. J. Mater. Chem. 2012. 22. 22350.
Mironov A.A., Beznoussenko G.V. Journal of microscopy. 2009. 235(3). 308.
Spiegelhalter C., Tosch V., Hentsch D., Koch M., Kessler P., Schwab Y., Laporte J. PLoS ONE. 2010. 5(2). e9014.
Pilhofer M., Ladinsky M.S., McDowall A.W., Jensen G.J. Methods Cell Biol. 2010. 96. 21.
Bouchet-Marquis C., Hoenger A. Micron. 2011. 42. 152.
Al-Abboodi A., Fu J., Doran P.M., Chan P.P.Y. Biotechnol. Bioeng. 2013. 110. 318.
Mironov V.L. Fundamentals of Scanning Probe Microscopy – The Russian academy of sciences institute for physics of microstructures: Nizhniy Novgorod, 2004. 97 p.
Bhushan B., Fuchs H. (Eds.) Applied Scanning Probe Methods XII: Characterization, Chapter 11: Applications of Scanning Near-Field Optical Microscopy in Life Science. 2009.
Efimov A.E., Tonevitsky A.G., Dittrich M., Matsko N.B. J. Microsc. 2007. 226. 207.
Alekseev A., Agapova O.I., Mochalov K.E., Agapov I.I. Advanced Materials. 2009. 21. 48.
Efimov A.E., Gnaegi H., Schaller R., Grogger W., Hoferde F., Matsko N.B. Soft Matter. 2012. 8. 9756.
Mochalov K.E., Efimov A.E., Bobrovsky A., Agapov I.I., Chistyakov A.A., Oleinikov V., Sukhanova A., Nabiev I. ACS Nano. 2013. 7(10). 8953.
Bobrovsky A., Samokhvalov P., Shibaev V. Advanced Optical Materials. 2014. 2. 1167.
Rust M.J., Bates M., Zhuang X. Nature Methods. 2006. 3. 793.
Betzig E.G., Patterson H., Sougrat R., Lindwasser O.W., Olenych S., Bonifacino J.S., Davidson M.W., Lippincott-Schwartz J.H., Hess F. Science. 2006. 313. 1642.
Westphal V., Rizzoli S.O., Lauterbach M.A., Kamin D., Jahn R., Hell S.W. Science. 2008. 320. 246.
Anderson N., Hartschuh A., Novotny L. Materials Today. 2005. 8. 50.
Specht M., Pedarning J.D., Heckl W.M., Hansch T.W. Phys.Rev.Lett. 1992. 68. 476.
Jahng J., Fishman D.A., Park S., Nowak D.B., Morrison W.A., Wickramasinghe H.K., Potma E.O. Acc. Chem. Res. 2015. 48. 2671.
Dazzi A., Prater C.B., Hu Q., Chase D.B., Rabolt J.F., Marcott C. Appl. Spectrosc. 2012. 66. 1365.
Отзывы читателей
