eng
Выпуск #5/2020
И.В.Яминский, А.И.Ахметова
Зондовая микроскопия в исследовании изменений роста, подвижности, метаболизма и секреции раковых клеток
Зондовая микроскопия в исследовании изменений роста, подвижности, метаболизма и секреции раковых клеток
Просмотры: 1399
DOI: 10.22184/1993-8578.2020.13.5.298.302
Современные методы СЗМ позволяют получить детальную картину топологии живых клеток, в том числе раковых, с нанометровым пространственным разрешением в процессе их роста. Развитие методов высокоскоростной атомно-силовой микроскопии дало возможность получать изображение клеток с миллисекундным пространственным разрешением. Сканирующая капиллярная (ион-проводящая) микроскопия позволяет исследовать шероховатую поверхность живых клеток за счет изменения протекающего ионного тока, практически исключая силовое воздействие на клетку. Использование сканирующей капиллярной микроскопии в исследовании раковых клеток открывает новые возможности для скрининга лекарств, получения новых данных о влиянии изменения внешних условий на кинетику роста опухоли и жизнедеятельности клеток.
Современные методы СЗМ позволяют получить детальную картину топологии живых клеток, в том числе раковых, с нанометровым пространственным разрешением в процессе их роста. Развитие методов высокоскоростной атомно-силовой микроскопии дало возможность получать изображение клеток с миллисекундным пространственным разрешением. Сканирующая капиллярная (ион-проводящая) микроскопия позволяет исследовать шероховатую поверхность живых клеток за счет изменения протекающего ионного тока, практически исключая силовое воздействие на клетку. Использование сканирующей капиллярной микроскопии в исследовании раковых клеток открывает новые возможности для скрининга лекарств, получения новых данных о влиянии изменения внешних условий на кинетику роста опухоли и жизнедеятельности клеток.
Теги: cancer cells high-speed atomic force microscopy scanning capillary microscopy (ion-conducting microscopy) screening of drugs высокоскоростная атомно-силовая микроскопия раковые клетки сканирующая капиллярная (ион-проводящая) микроскопия скрининг лекарств
ЗОНДОВАЯ МИКРОСКОПИЯ В ИССЛЕДОВАНИИ ИЗМЕНЕНИЙ РОСТА, ПОДВИЖНОСТИ,
МЕТАБОЛИЗМА И СЕКРЕЦИИ РАКОВЫХ КЛЕТОК
PROBE MICROSCOPY IN THE STUDY OF CHANGES
IN GROWTH, MOBILITY, METABOLISM
AND SECRETION OF CANCER CELLS
И.В.Яминский1, 2, 3 д.ф.-м.н., профессор МГУ имени М.В.Ломоносова, физический и химический факультеты, генеральный директор Центра перспективных технологий, директор Энергоэффективных технологий, вед. науч. сотр. ИНЭОС РАН, (ORCID: 0000-0001-8731-3947), А.И.Ахметова1, 2, 3, инженер НИИ ФХБ имени А.Н.Белозерского МГУ, ведущий специалист Центра перспективных технологий и Энергоэффективных технологий (ORCID: 0000-0001-6363-8202) / yaminsky@nanoscopy.ru
I.V.Yaminskiy1, 2, 3, Doctor of Sc. (Physics and Mathematics), Prof. of Lomonosov Moscow State University, Physical and Chemical departments, Director of Advanced Technologies Center, Director of Energy Efficient Technologies, Leading Sci. of INEOS RAS, А.I.Аkhmetova1, 2, 3, Engineer of A.N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Leading Specialist of Advanced Technologies Center and of Energy Efficient Technologies
DOI: 10.22184/1993-8578.2020.13.5.298.302
Получено: 21.08.2020 г.
В настоящее время существует множество вопросов в области антираковой медицины. В частности, среди нерешенных, но очень важных задач стоят следующие:
Появляющиеся данные свидетельствуют о том, что многие типы раковых клеток имеют повышенный уровень активных форм кислорода (АФК) по сравнению с нормальными клетками [1, 2]. Перекись водорода (H2O2) является одной из наиболее важных АФК и связана с различными патологическими и физиологическими процессами. Кроме того, чрезмерное количество H2O2 может вызвать повреждение белков, липидов и ДНК в клетках, вызывая различные заболевания, такие как рак, болезнь Альцгеймера, сердечные приступы и болезнь Паркинсона [3, 4]. Кроме того, из-за того, что раковые клетки генерируют чрезмерное количество H2O2 по сравнению с нормальными клетками, H2O2 может использоваться в качестве биомаркера для оценки способности окислительного стресса в различных клетках и выявления раковых клеток [5]. Следовательно, эффективное и точное обнаружение H2O2 необходимо для мониторинга его концентрации в живых клетках и понимания соответствующих биологических процессов.
Особенность капиллярной микроскопии заключается в неконтактном методе сканирования для получения топографии поверхности клеток, тем самым можно практически исключить влияние метода измерения на результаты эксперимента. В капиллярной микроскопии, в отличие от атомно-силовой, используется капилляр, который наполняется электролитом.
В него помещается Ag/AgCl электрод, второй электрод помещается в буфер с образцами клеток. С помощью прецизионной электроники осуществляется перемещение капилляра над поверхностью клетки, изменение ионного тока, проходящего через кончик капилляра, позволяет контролировать положение капилляра над образцом. Тем самым исключается вероятность касания клетки капилляром, поскольку, когда ионный ток минимален, капилляр располагается на максимально близком расстоянии от клетки. Благодаря данной методике возможно осуществлять сканирование живых объектов в естественной среде и получать изображения без опасения нанести вред образцу, особенно если это касается таких мягких образцов, как живые клетки.
В англоязычной литературе данный метод получил название ион-проводящая микроскопия (SICM). При использовании двухканальных капилляров можно получать не только данные о топографии, но и проводить электрохимический анализ. Второй канал может использоваться как сенсор или как средство доставки. В этом случае мы имеем дело с электрохимической микроскопией (scanning electrochemical microscopy, SECM).
Один канал заполняется электролитом и доставляемыми молекулами, через этот канал также осуществляется позиционирование капилляра над образцом. Второй канал представляет собой углеродный электрод, который измеряет локальную концентрацию и поток подаваемых через канал молекул [6]. Локальная доставка осуществляется за счет управления подаваемым напряжением, что позволяет увеличивать или уменьшать количество подаваемых через капилляр молекул. В работе [7] представлена методика изготовления углеродных наноэлектродов для внутриклеточных электрохимических исследований, в частности, модификация наноэлектрода с помощью платины позволила зарегистрировать концентрацию активных форм кислорода вблизи и внутри клеток гиппокампа. Изменения уровней активных форм кислорода (reactive oxygen species, ROS) и активных форм азота (reactive nitrogen species, RNS) являются индикаторами раковых клеток в популяции. Очевидно, что данная методика имеет большие перспективы для доставки лекарств и скрининга. Встречается применение углеродных капилляров, где ток, возникающий при электрохимическом окислении / восстановлении окислительно-восстановительных молекул на поверхности углерода, реагирует на перемещение частиц [8].
Ozel и коллеги [9] использовали капилляры, функционализированные в качестве сенсоров на глюкозу путем ковалентной иммобилизации глюкозооксидазы (GOx) на кончике капилляра. Взаимодействие глюкозы с GOx приводит к каталитическому окислению β-D-глюкозы до D-глюконовой кислоты, что может быть измерено как изменение импеданса из-за падения рН-среды на кончике капилляра. Сенсор на глюкозу количественно определял внутриклеточные уровни глюкозы в фибробластах человека, а также в метастатических линиях рака молочной железы MDA-MB-231 и MCF7. Было обнаружено, что раковые клетки демонстрировали воспроизводимое и точное повышение уровня глюкозы по сравнению с незлокачественными клетками. С помощью капиллярной микроскопии был разработан сенсор на pH для исследования окисления внеклеточного пространства обычными и раковыми клетками [10].
Капиллярная микроскопия может быть использована в качестве платформы для исследований рака и клинического скрининга, помочь объяснить роль гетерогенности в тканях первичной опухоли и систематически определить критические параметры в прогрессировании заболевания и потенциальных метастатических состояниях [11, 12].
Капиллярная микроскопия может быть использована для измерения плотности поверхностного заряда и электрохимической активности, а также для доставки веществ. Фаза переменного тока чувствительна к поверхностному заряду, поэтому сдвиг фазы может дать полезную информацию для визуализации заряда одновременно с топографией.
Визуализация in vitro морфологии раковых клеток в процессе их роста, подвижности, метаболизма и секреции дает прямую информацию о процессе развития раковых заболеваний. Силовое картирование поверхности с помощью механического воздействия со стороны зонда атомно-силового микроскопа или индуцированного механического давления на клетку, создаваемое потоком жидкости через капилляр ион-проводящего микроскопа, дает детальную информацию об изменении локальных механических свойств клеток под воздействием различных внешних факторов, в том числе химических и биомедицинских препаратов.
Успехи капиллярной микроскопии в исследовании живых клеток и их метаболизма подтверждают необходимость продолжения исследований влияния лекарств на единичные раковые клетки для разработки наиболее перспективной стратегии лечения. Благодаря трехмерной визуализации in vitro морфологии раковых клеток с нанометровой точностью и синхронным измерением локальных свойств: жесткости, способности к адгезии, метаболической активности и других – появляется новый актуальный и высшей степени информативный метод изучения раковых клеток.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 20-12-00389), и Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 20-32-90036).
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Trachootham D., Alexandre J., Huang P. Targeting cancer cells by ROS-mediated mechanisms: a radical therapeutic approach? Nat. Rev. Drug Disco. v.8. (2009) 579–591.
Alexandre J., Batteux F., Nicco C., Chereau C., Laurent A., Guillevin L. et al., Accumulation of hydrogen peroxide is an early and crucial step for paclitaxel-induced cancer cell death both in vitro and in vivo, Int. J. Cancer 119 (2006) 41–48.
Li Z., Xin Y., Zhang Z. New photocathodic analysis platform with quasi-core/shellstructured TiO2@Cu2O for sensitive detection of H2O2 release from living cells, Anal. Chem. 87 (2015) 10491–10497.
Gao C., Tian Y., Zhang R., Jing J., Zhang X. Endoplasmic reticulum-directed Ratiometric fluorescent probe for quantitive detection of basal H2O2, Anal. Chem. 89 (2017) 12945–12950.
Liu F., Bing T., Shangguan D., Zhao M., Shao N. Ratiometric fluorescent biosensing of hydrogen peroxide and hydroxyl radical in living cells with lysozyme-silver Nanoclusters: lysozyme as stabilizing ligand and fluorescence signal unit, Anal.Chem. 88 (2016) 10631–10638.
Page A., Kang M., Armitstead A., Perry D., and Unwin P.R. "Quantitative visualization of molecular delivery and uptake at living cells with self-referencing scanning ion conductance microscopy-scanning electrochemical microscopy," Analytical Chemistry. 89, (2017) 3021.
Paolo A., Sergiy T., Jan C. et al. Electrochemical nanoprobes for single-cell analysis. ACS Nano. V. 8, no. 1, pp. (2014) 875–884.
Resistive-Pulse Sensing Inside Single Living Cells. Rongrong Pan, Keke Hu, Rui Jia, Susan A. Rotenberg, Dechen Jiang, and Michael V. Mirkin. J. Am. Chem. Soc., Just Accepted Manuscript. https://doi.org /10.1021/jacs.9b13796.
Nascimento R.A.S., Ozel R.E., Mak W.H., Mulato M., Singaram B., Pourmand N. Single cell "glucose nanosensor" verifies elevated glucose levels in individual cancer cells. Nano Lett. 16, (2016) 1194–200.
Measurement of the Extracellular pH of Adherently Growing Mammalian Cells with High Spatial Resolution Using a Voltammetric pH Microsensor. Raluca-Elena Munteanu, Luciana Staanica, Mihaela Gheorghiu, and Szilveszter Gaspar. Anal. Chem. 90, (2018) 6899−6905.
Clark I.E., Dodson M.W., Jiang C., Cao J.H., Huh J.R., Seol J.H., Yoo S.J., Hay B.A., Guo M. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature, 441, (2006) 1162–1166.
Ståhlberg A., Thomsen C., Ruff D., Åman P. Quantitative PCR analysis of DNA, RNAs, and proteins in the same single cell. Clin. Chem. 58, (2012) 1682–1691.
МЕТАБОЛИЗМА И СЕКРЕЦИИ РАКОВЫХ КЛЕТОК
PROBE MICROSCOPY IN THE STUDY OF CHANGES
IN GROWTH, MOBILITY, METABOLISM
AND SECRETION OF CANCER CELLS
И.В.Яминский1, 2, 3 д.ф.-м.н., профессор МГУ имени М.В.Ломоносова, физический и химический факультеты, генеральный директор Центра перспективных технологий, директор Энергоэффективных технологий, вед. науч. сотр. ИНЭОС РАН, (ORCID: 0000-0001-8731-3947), А.И.Ахметова1, 2, 3, инженер НИИ ФХБ имени А.Н.Белозерского МГУ, ведущий специалист Центра перспективных технологий и Энергоэффективных технологий (ORCID: 0000-0001-6363-8202) / yaminsky@nanoscopy.ru
I.V.Yaminskiy1, 2, 3, Doctor of Sc. (Physics and Mathematics), Prof. of Lomonosov Moscow State University, Physical and Chemical departments, Director of Advanced Technologies Center, Director of Energy Efficient Technologies, Leading Sci. of INEOS RAS, А.I.Аkhmetova1, 2, 3, Engineer of A.N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Leading Specialist of Advanced Technologies Center and of Energy Efficient Technologies
DOI: 10.22184/1993-8578.2020.13.5.298.302
Получено: 21.08.2020 г.
В настоящее время существует множество вопросов в области антираковой медицины. В частности, среди нерешенных, но очень важных задач стоят следующие:
- обнаружение опухолевых маркеров в клетках или в жидкости, таких как микроРНК в сыворотке;
- выявление фенотипов раковых клеток в ответ на микроэнвирентальные стимулы in vitro, такие как рост клеток, подвижность клеток, метаболизм клеток, секреция клеток и т.д.;
- определение клеточного ответа на низкомолекулярные лекарственные средства, которые недавно были разработаны в соответствии с патологическими механизмами;
- изучение механизма лекарственной устойчивости при лечении рака.
Появляющиеся данные свидетельствуют о том, что многие типы раковых клеток имеют повышенный уровень активных форм кислорода (АФК) по сравнению с нормальными клетками [1, 2]. Перекись водорода (H2O2) является одной из наиболее важных АФК и связана с различными патологическими и физиологическими процессами. Кроме того, чрезмерное количество H2O2 может вызвать повреждение белков, липидов и ДНК в клетках, вызывая различные заболевания, такие как рак, болезнь Альцгеймера, сердечные приступы и болезнь Паркинсона [3, 4]. Кроме того, из-за того, что раковые клетки генерируют чрезмерное количество H2O2 по сравнению с нормальными клетками, H2O2 может использоваться в качестве биомаркера для оценки способности окислительного стресса в различных клетках и выявления раковых клеток [5]. Следовательно, эффективное и точное обнаружение H2O2 необходимо для мониторинга его концентрации в живых клетках и понимания соответствующих биологических процессов.
Особенность капиллярной микроскопии заключается в неконтактном методе сканирования для получения топографии поверхности клеток, тем самым можно практически исключить влияние метода измерения на результаты эксперимента. В капиллярной микроскопии, в отличие от атомно-силовой, используется капилляр, который наполняется электролитом.
В него помещается Ag/AgCl электрод, второй электрод помещается в буфер с образцами клеток. С помощью прецизионной электроники осуществляется перемещение капилляра над поверхностью клетки, изменение ионного тока, проходящего через кончик капилляра, позволяет контролировать положение капилляра над образцом. Тем самым исключается вероятность касания клетки капилляром, поскольку, когда ионный ток минимален, капилляр располагается на максимально близком расстоянии от клетки. Благодаря данной методике возможно осуществлять сканирование живых объектов в естественной среде и получать изображения без опасения нанести вред образцу, особенно если это касается таких мягких образцов, как живые клетки.
В англоязычной литературе данный метод получил название ион-проводящая микроскопия (SICM). При использовании двухканальных капилляров можно получать не только данные о топографии, но и проводить электрохимический анализ. Второй канал может использоваться как сенсор или как средство доставки. В этом случае мы имеем дело с электрохимической микроскопией (scanning electrochemical microscopy, SECM).
Один канал заполняется электролитом и доставляемыми молекулами, через этот канал также осуществляется позиционирование капилляра над образцом. Второй канал представляет собой углеродный электрод, который измеряет локальную концентрацию и поток подаваемых через канал молекул [6]. Локальная доставка осуществляется за счет управления подаваемым напряжением, что позволяет увеличивать или уменьшать количество подаваемых через капилляр молекул. В работе [7] представлена методика изготовления углеродных наноэлектродов для внутриклеточных электрохимических исследований, в частности, модификация наноэлектрода с помощью платины позволила зарегистрировать концентрацию активных форм кислорода вблизи и внутри клеток гиппокампа. Изменения уровней активных форм кислорода (reactive oxygen species, ROS) и активных форм азота (reactive nitrogen species, RNS) являются индикаторами раковых клеток в популяции. Очевидно, что данная методика имеет большие перспективы для доставки лекарств и скрининга. Встречается применение углеродных капилляров, где ток, возникающий при электрохимическом окислении / восстановлении окислительно-восстановительных молекул на поверхности углерода, реагирует на перемещение частиц [8].
Ozel и коллеги [9] использовали капилляры, функционализированные в качестве сенсоров на глюкозу путем ковалентной иммобилизации глюкозооксидазы (GOx) на кончике капилляра. Взаимодействие глюкозы с GOx приводит к каталитическому окислению β-D-глюкозы до D-глюконовой кислоты, что может быть измерено как изменение импеданса из-за падения рН-среды на кончике капилляра. Сенсор на глюкозу количественно определял внутриклеточные уровни глюкозы в фибробластах человека, а также в метастатических линиях рака молочной железы MDA-MB-231 и MCF7. Было обнаружено, что раковые клетки демонстрировали воспроизводимое и точное повышение уровня глюкозы по сравнению с незлокачественными клетками. С помощью капиллярной микроскопии был разработан сенсор на pH для исследования окисления внеклеточного пространства обычными и раковыми клетками [10].
Капиллярная микроскопия может быть использована в качестве платформы для исследований рака и клинического скрининга, помочь объяснить роль гетерогенности в тканях первичной опухоли и систематически определить критические параметры в прогрессировании заболевания и потенциальных метастатических состояниях [11, 12].
Капиллярная микроскопия может быть использована для измерения плотности поверхностного заряда и электрохимической активности, а также для доставки веществ. Фаза переменного тока чувствительна к поверхностному заряду, поэтому сдвиг фазы может дать полезную информацию для визуализации заряда одновременно с топографией.
Визуализация in vitro морфологии раковых клеток в процессе их роста, подвижности, метаболизма и секреции дает прямую информацию о процессе развития раковых заболеваний. Силовое картирование поверхности с помощью механического воздействия со стороны зонда атомно-силового микроскопа или индуцированного механического давления на клетку, создаваемое потоком жидкости через капилляр ион-проводящего микроскопа, дает детальную информацию об изменении локальных механических свойств клеток под воздействием различных внешних факторов, в том числе химических и биомедицинских препаратов.
Успехи капиллярной микроскопии в исследовании живых клеток и их метаболизма подтверждают необходимость продолжения исследований влияния лекарств на единичные раковые клетки для разработки наиболее перспективной стратегии лечения. Благодаря трехмерной визуализации in vitro морфологии раковых клеток с нанометровой точностью и синхронным измерением локальных свойств: жесткости, способности к адгезии, метаболической активности и других – появляется новый актуальный и высшей степени информативный метод изучения раковых клеток.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 20-12-00389), и Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 20-32-90036).
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Trachootham D., Alexandre J., Huang P. Targeting cancer cells by ROS-mediated mechanisms: a radical therapeutic approach? Nat. Rev. Drug Disco. v.8. (2009) 579–591.
Alexandre J., Batteux F., Nicco C., Chereau C., Laurent A., Guillevin L. et al., Accumulation of hydrogen peroxide is an early and crucial step for paclitaxel-induced cancer cell death both in vitro and in vivo, Int. J. Cancer 119 (2006) 41–48.
Li Z., Xin Y., Zhang Z. New photocathodic analysis platform with quasi-core/shellstructured TiO2@Cu2O for sensitive detection of H2O2 release from living cells, Anal. Chem. 87 (2015) 10491–10497.
Gao C., Tian Y., Zhang R., Jing J., Zhang X. Endoplasmic reticulum-directed Ratiometric fluorescent probe for quantitive detection of basal H2O2, Anal. Chem. 89 (2017) 12945–12950.
Liu F., Bing T., Shangguan D., Zhao M., Shao N. Ratiometric fluorescent biosensing of hydrogen peroxide and hydroxyl radical in living cells with lysozyme-silver Nanoclusters: lysozyme as stabilizing ligand and fluorescence signal unit, Anal.Chem. 88 (2016) 10631–10638.
Page A., Kang M., Armitstead A., Perry D., and Unwin P.R. "Quantitative visualization of molecular delivery and uptake at living cells with self-referencing scanning ion conductance microscopy-scanning electrochemical microscopy," Analytical Chemistry. 89, (2017) 3021.
Paolo A., Sergiy T., Jan C. et al. Electrochemical nanoprobes for single-cell analysis. ACS Nano. V. 8, no. 1, pp. (2014) 875–884.
Resistive-Pulse Sensing Inside Single Living Cells. Rongrong Pan, Keke Hu, Rui Jia, Susan A. Rotenberg, Dechen Jiang, and Michael V. Mirkin. J. Am. Chem. Soc., Just Accepted Manuscript. https://doi.org /10.1021/jacs.9b13796.
Nascimento R.A.S., Ozel R.E., Mak W.H., Mulato M., Singaram B., Pourmand N. Single cell "glucose nanosensor" verifies elevated glucose levels in individual cancer cells. Nano Lett. 16, (2016) 1194–200.
Measurement of the Extracellular pH of Adherently Growing Mammalian Cells with High Spatial Resolution Using a Voltammetric pH Microsensor. Raluca-Elena Munteanu, Luciana Staanica, Mihaela Gheorghiu, and Szilveszter Gaspar. Anal. Chem. 90, (2018) 6899−6905.
Clark I.E., Dodson M.W., Jiang C., Cao J.H., Huh J.R., Seol J.H., Yoo S.J., Hay B.A., Guo M. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature, 441, (2006) 1162–1166.
Ståhlberg A., Thomsen C., Ruff D., Åman P. Quantitative PCR analysis of DNA, RNAs, and proteins in the same single cell. Clin. Chem. 58, (2012) 1682–1691.
Отзывы читателей
