eng
Выпуск #3-4/2024
С.В.Замалутдинова,П.А.Петрова, А.А.Рамонова, Д.В.Багров
ОРИГИНАЛЬНОСТЬ БЕЗ ПРИВИЛЕГИЙ: СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭЛЕКТРОФОРМОВАННЫХ И СТАНДАРТНЫХ НИТРОЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ МЕМБРАН В ИММУНОАНАЛИЗЕ НА МЕЛАТОНИН
ОРИГИНАЛЬНОСТЬ БЕЗ ПРИВИЛЕГИЙ: СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭЛЕКТРОФОРМОВАННЫХ И СТАНДАРТНЫХ НИТРОЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ МЕМБРАН В ИММУНОАНАЛИЗЕ НА МЕЛАТОНИН
Просмотры: 1094
DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.3-4.220.229
Электроформование позволяет создавать полимерные мембраны, состоящие из нановолокон. Эти мембраны находят применение в различных задачах фильтрации, изготовления раневых покрытий и тканеинженерных конструкций, а кроме того, их рассматривают как перспективные подложки для иммуноанализа. Несмотря на активный интерес научного сообщества к применению электроформованных мембран для иммуноанализа, на настоящий момент не проведено их прямого сопоставления с мембранами, сформированными с помощью других технологий. В данной работе мы провели такое сопоставление и показали, что детекция мелатонина методом иммуноферментного анализа происходит практически одинаково на мембранах, изготовленных методом электроформования, и обычных коммерчески доступных мембранах.
Электроформование позволяет создавать полимерные мембраны, состоящие из нановолокон. Эти мембраны находят применение в различных задачах фильтрации, изготовления раневых покрытий и тканеинженерных конструкций, а кроме того, их рассматривают как перспективные подложки для иммуноанализа. Несмотря на активный интерес научного сообщества к применению электроформованных мембран для иммуноанализа, на настоящий момент не проведено их прямого сопоставления с мембранами, сформированными с помощью других технологий. В данной работе мы провели такое сопоставление и показали, что детекция мелатонина методом иммуноферментного анализа происходит практически одинаково на мембранах, изготовленных методом электроформования, и обычных коммерчески доступных мембранах.
Получено: 25.03.2024 г. | Принято: 30.03.2024 г. | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.3-4.220.229
Научная статья
ОРИГИНАЛЬНОСТЬ БЕЗ ПРИВИЛЕГИЙ: СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭЛЕКТРОФОРМОВАННЫХ И СТАНДАРТНЫХ НИТРОЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ МЕМБРАН В ИММУНОАНАЛИЗЕ НА МЕЛАТОНИН
С.В.Замалутдинова1, мл. науч. сотр., ORCID: 0009-0006-9510-1868 / podgorodova.sofya@yandex.ru
П.А.Петрова1, мл. науч. сотр., ORCID: 0009-0004-7933-0594
А.А.Рамонова1, мл. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-3081-4721
Д.В.Багров1, к.ф.-м.н., вед. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-6355-7282
Аннотация. Электроформование позволяет создавать полимерные мембраны, состоящие из нановолокон. Эти мембраны находят применение в различных задачах фильтрации, изготовления раневых покрытий и тканеинженерных конструкций, а кроме того, их рассматривают как перспективные подложки для иммуноанализа. Несмотря на активный интерес научного сообщества к применению электроформованных мембран для иммуноанализа, на настоящий момент не проведено их прямого сопоставления с мембранами, сформированными с помощью других технологий. В данной работе мы провели такое сопоставление и показали, что детекция мелатонина методом иммуноферментного анализа происходит практически одинаково на мембранах, изготовленных методом электроформования, и обычных коммерчески доступных мембранах.
Ключевые слова: нитроцеллюлозные мембраны, иммуноанализ, мелатонин, иммуноферментный анализ
Для цитирования: С.В. Замалутдинова, П.А. Петрова, А.А. Рамонова, Д.В. Багров. Оригинальность без привилегий: сравнительный анализ электроформованных и стандартных нитроцеллюлозных мембран в иммуноанализе на мелатонин. НАНОИНДУСТРИЯ. 2024. Т. 17, № 3–4. С. 220–229. https://doi.org/
10.22184/1993-8578.2024.17.3-4.220.229
Received: 25.03.2024 | Accepted: 30.03.2024 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.3-4.220.229
Original paper
ORIGINALITY WITHOUT PRIVILEGE: COMPARATIVE ANALYSIS OF ELECTROFORMED AND STANDARD NITROCELLULOSE MEMBRANES IN MELATONIN IMMUNOASSAYS
S.V.Zamalutdinova1, Junior Researcher, ORCID: 0009-0006-9510-1868 / podgorodova.sofya@yandex.ru
P.A.Petrova1, Junior Researcher, ORCID: 0009-0004-7933-0594
A.A.Ramonova1, Junior Researcher, ORCID: 0000-0002-3081-4721
D.V.Bagrov1, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Lead Researcher, ORCID: 0000-0002-6355-7282
Abstract. Electrospinning enables manufacturing of polymer membranes composed of nanofibres. These membranes find application as filters, wound coatings, and tissue engineering scaffolds. They are also considered promising substrates for immunoassays. Despite the scientific community’s keen interest in the immunoassays based on electrospun membranes, a direct comparison with membranes formed through alternative technologies has not been conducted to date. In this study, we performed such a comparison and demonstrated that the detection of melatonin via enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is virtually identical on the electrospun membranes and the conventional commercially available membranes.
Keywords: nitrocellulose membranes, immunoassay, melatonin, enzyme immunoassay
For citation: S.V. Zamalutdinova, P.A. Petrova, A.A. Ramonova, D.V. Bagrov. Originality without privilege: comparative analysis of electroformed and standard nitrocellulose membranes in melatonin immunoassays. NANOINDUSTRY. 2024. Vol. 17. No. 3–4. PP. 220–229. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.3-4.220.229.
ВВЕДЕНИЕ
Иммуноанализ является неотъемлемой частью клинической лабораторной диагностики и научных исследований. В его основе лежит специфическое взаимодействие между антигеном и антителом; константа диссоциации этого взаимодействия обычно лежит в диапазоне ~0,1–1 нМ [1]. Любая молекула из пары "антиген-антитело" может быть аналитом – при измерении уровня антител в крови их улавливают с помощью антигенов, а для обнаружения антигенов, наоборот, их улавливают с помощью антител.
Развитие нанотехнологий позволило значительно усовершенствовать многие виды иммуноанализа. Например, в лабораторную практику вошли наночастицы, модифицированные антителами [2], и аффинные биосенсоры, созданные с использованием нанотехнологий [3]. Были разработаны уникальные рекордно чувствительные иммуноаналитические системы на основе кремниевых "наноколодцев", способные зарегистрировать аналит в концентрации ~0,1 фМ [4]. В целом, наноматериалы стали неотъемлемым компонентом многих иммуноаналитических систем и позволили выполнять анализы быстрее, точнее и дешевле. На этом фоне особый интерес представляет использование электроформованных мембран в качестве подложек для иммуносенсоров.
Электроформованные мембраны – это полимерные нетканые материалы, состоящие из волокон субмикронного диаметра. Большинство коммерчески доступных нетканых материалов, изготовленных с помощью традиционных подходов, состоят из волокон с диаметрами порядка ~1–100 мкм, а для электроформованных мембран диаметры волокон лежат в диапазоне ~100 нм – 1 мкм, а иногда ~10 нм [5]. Малый диаметр волокон обеспечивает мембране высокую удельную поверхность (~10 м2/г) и возможность иммобилизовать большое количество молекул рецепторного слоя, которые будут связывать аналит из пробы [6]. Ряд работ утверждает, что электроформованные мембраны могут использоваться как перспективный элемент в системах для дот-блоттинга и аналогичных лабораторных анализов. Например, это было продемонстрировано в экспериментах с вирусом Денге – его обычно обнаруживают методом иммуноферментного анализа (ИФА), и предел обнаружения может быть снижен приблизительно в 10 раз, если реакция проводится не на донышке полистирольного планшета, а на поверхности волокон электроформованной мембраны [7, 8].
В основе электроформования (электроспиннинга) лежит идея о том, что струя раствора полимера становится тоньше, если на ней есть сильный электрический заряд. Действительно, отталкивание между одноименными близко расположенными участками струи приводит к ее растяжению и уменьшению ее диаметра. Лабораторное электроформование работает следующим образом (рис.1). Раствор полимера помещают в шприц и выдавливают через иглу, расположенную напротив проводящего элемента – коллектора. Между коллектором и иглой прикладывают высокое напряжение, порядка ~10–40 кВ. Заряженная струя раствора полимера движется к коллектору, при этом она обычно деформируется и становится тоньше. Растворитель испаряется, и при этом формируется полимерное волокно, диаметр которого оказывается на несколько порядков меньше диаметра иглы шприца. Волокно хаотическим образом осаждается на коллектор, где и собирается электроформованная мембрана.
Метод электроформования был предложен в середине 20 века академиком Петряновым-Соколовым, и с его помощью производили воздушные фильтры для удаления аэрозольных частиц из воздуха [9, 10]. В начале 21 века интерес к электроформованию резко вырос, и это, по-видимому, можно связать с двумя факторами. Во-первых, широкое распространение получили сканирующие электронные микроскопы, которые являются необходимым инструментом для контроля структуры электроформованных мембран и измерения диаметров волокон. Во-вторых, возникла тканевая инженерия и стало ясно, что электроформованные мембраны, изготовленные из биоразлагаемых полимеров, могут использоваться, чтобы имитировать структуру внеклеточного матрикса [5]. Таким образом, технология электроформования была адаптирована для биологических задач, и на этом фоне возникла гипотеза о применимости изготовленных с ее помощью мембран в биосенсорах.
В недавнем обзоре [6] было показано, что электроформованные мембраны могут быть использованы в биологических и химических сенсорах, предназначенных для обнаружения широкого класса аналитов – от ионов металлов и взрывчатых веществ до цельных вирусов и бактерий. Среди биологических сенсоров особое место занимают иммуносенсоры, в которых рецепторный слой иммобилизован на поверхности электроформованных волокон (с молекулами рецепторного слоя связывается аналит). В некоторых случаях такие сенсоры позволяют радикально снизить время анализа. Например, с использованием сенсора на основе электроформованной мембраны, антитела против вируса MERS-CoV могут быть обнаружены менее, чем за 6 мин – это несравненно меньше, чем типичное время проведения ИФА (~8 ч) [11]. В основе такого радикального сокращения времени лежит идея о пропускании пробы через пористую мембрану, на которой происходит аффинное связывание аналита. Аналогичное, хотя и не столь радикальное, сокращение времени анализа, иногда достигается при использовании дот-блоттинга [12, 13]. В этом методе в качестве подложки используют пористую нитроцеллюлозную мембрану, а большинство растворов и реагентов наносят с помощью вакуумного насоса.
В связи с этим возникает вопрос: верно ли, что электроформованная мембрана, состоящая из тонких нановолокон, обладает преимуществами перед обычными, серийно выпускаемыми пористыми мембранами? Для ответа на этот вопрос необходимо сравнить результаты ИФА, выполненного на мембранах двух типов, причем они должны быть изготовлены из одного и того же материала. Для того чтобы эксперимент был наиболее показательным, необходимо использовать зажим для мембран с вакуумным насосом, который предназначен для дот-блоттинга. Такой эксперимент был выполнен с мембранами из нитроцеллюлозы (НЦ); в качестве системы для ИФА был использован набор реагентов для обнаружения мелатонина. Было показано, что электроформованная мембрана и коммерчески доступная пористая НЦ обеспечивают практически идентичные результаты – одинаковые значения чувствительности и динамического диапазона.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Мембраны. В работе использовали два типа мембран из НЦ – коммерчески доступные, выпускаемые серийно мембраны Bio-rad (номер 1620115), и оригинальные, электроформованные. Их изготавливали следующим образом. Мембрану Bio-rad растворяли в ацетоне, диметилформамиде (ДМФА) или их смеси. Концентрация НЦ составляла 100 мг/мл. Электроформование проводили на установке Nanofiber Electrospinning Unit (Китай) при следующих условиях: напряжение 38–40 кВ, расстояние до коллектора 15 см, внутренний диаметр иглы 0,514 мм (калибр 21g), скорость подачи раствора 1 мл/ч.
Сканирующая электронная микроскопия. Для исследования методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) образцы покрывали тонким слоем золота с толщиной 20 нм с помощью распылителя Eiko IB3 (Япония). Структуру исследовали с помощью СЭМ TM3000 (Hitachi, Япония) при ускоряющем напряжении 15 кВ. Изображения обрабатывали с использованием программного обеспечения Fiji.
Иммуноанализ. Для определения КО мелатонина методом ИФА использовали коммерческий набор KSA908Gel1 компании Cloude-Clone Corp (USA). Реакции проводили в ячейках 96-луночного планшета или на поверхности НЦ мембран. В обоих случаях анализ включал в себя ряд шагов, которые обычно используют при конкурентном ИФА (табл.1). После каждого шага поверхность, на которой проводились реакции, отмывали.
В основе анализа лежит идея о том, что в каждый исследуемый раствор необходимо внести специальный реагент – биотинилированный конкурент. Это конъюгат альбумина с МТ и биотином, и он конкурирует с содержащимся в исследуемом растворе МТ за связывание с антителами, иммобилизованными на поверхности. Биотин, входящий в состав этого конъюгата, позволяет проявить его с помощью стандартных реагентов, таких как стрептавидин с пероксидазой хрена и субстраты для оптической детекции (колориметрической или хемилюминесцентной).
Для разведения реагентов использовали три буфера: фосфатно-солевой буфер (PBS, pH 7.4), фосфатно-солевой буфер с добавлением 0,075% Tween-20 (PBST), а также проприетарный буфер с pH 9,5 для разведения антител (Coating buffer, Cloud-clone).
Для блокировки неспецифических сайтов связывания использовали раствор Blocking buffer (Cloud-clone). Между инкубациями для удаления не связавшихся молекул твердый носитель отмывали в буфере PBST.
В случае экспериментов в 96-луночном планшете все инкубации проводили в термостате при 37 °С и покачивании с частотой 130 об/мин. Содержимое лунок удаляли декантацией. На заключительном этапе анализа в качестве субстрата пероксидазы хрена в каждую лунку вносили по 90 мкл тетраметилбензидина, инкубировали 15 мин, затем реакцию останавливали внесением 50 мкл 0,5 М серной кислоты. Оптическую плотность содержимого лунок планшета измеряли на ридере Hidex Chameleon (Великобритания) при длине волны 450 нм.
В случае проведения анализа на мембранах инкубации проводили при комнатной температуре без покачиваний. Содержимое лунок удаляли, протягивая жидкость через мембрану с помощью насоса. На заключительном этапе результаты визуализировали с помощью хемилюминесцентного субстрата Affinity ECL (ООО "БелкиАнтитела", Россия). Интенсивность хемилюминесценции измеряли на приборе ChemiDoc (BioRad, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Морфология мембран. Метод электроформования применим к очень широкому классу полимеров – полиолефинам, полиамидам, полиэфирам и др. При этом количество статей, посвященных электроформованию НЦ, относительно мало [14, 15]. Это представляется особенно странным с учетом того, что именно в экспериментах с НЦ процесс электроформования был осуществлен впервые [9, 10].
Для выполнения данной работы были выбраны условия электроформования, которые позволили создать мембраны, состоящие из волокон со средним диаметром 280 ± 60 нм (рис.2а, b). В целом это близко к размеру границ между порами в коммерчески доступных мембранах (рис.2c, d). Оптимальные результаты достигались при использовании двухкомпонентного растворителя, состоящего из смеси ацетона и ДМФА в соотношении 7 : 3 или 8 : 2 по объему. Аналогичный подход использовали в работе [16]. При попытке делать электроформование НЦ из раствора в ацетоне игла шприца быстро забивалась, и нам не удавалось получить нетканую мембрану, хотя такие эксперименты описаны в работах [14, 15]. При использовании раствора НЦ в ДМФА возникала иная проблема: ДМФА имеет сравнительно высокую температуру кипения 153 °C и относится к нелетучим растворителям, он недостаточно быстро испарялся, и на коллекторе формировалась сплошная пленка.
В результате оказалось, что двухкомпонентный растворитель был оптимальным и позволил получить тонкие волокна из НЦ.
Мембраны двух описанных типов (рис.2) были использованы в экспериментах по дот-блоттингу.
Результаты иммуноанализа. Для оценки применимости электроформованных мембран в дот-блоттинге необходимо выбрать аналит и набор биохимических реагентов для его обнаружения. В качестве аналита был выбран мелатонин (N-ацетил-5-метокситриптамин, молекулярная масса 232 г/моль) – гормон, который отвечает за регуляцию цикла сна и бодрствования. Обычно измерение мелатонина (МТ) проводят с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС), именно этот метод используют клинико-диагностические лаборатории в России. В то же время существуют коммерчески доступные наборы для определения МТ методом ИФА. МТ является низкомолекулярным веществом, поэтому улавливающие антитела направлены не против него, а против его конъюгата с бычьим сывороточным альбумином, и этот же конъюгат используется в качестве стандарта. Анализ проводится конкурентным способом – в исследуемую пробу вносят биотинилированный конкурент, и МТ, находящийся в пробе, конкурирует с ним за связывание с антителами. Затем биотин можно детектировать конъюгатом стрептавидина с пероксидазой хрена. Типичная калибровочная кривая такого анализа, полученная в обычном 96-луночном планшете, представлена на рис.3a – по мере увеличения концентрации МТ, сигнал снижается.
Реагенты из описанного набора были использованы для дот-блоттинга, с применением вакуумного зажима (рис.3b). Когда в нем размещена мембрана, он аналогичен 96-луночному планшету с проницаемым дном. Жидкость, внесенная в ячейки, не протекает через пористое дно спонтанно, так как ее задерживает сила поверхностного натяжения. Однако при включении насоса возникает перепад давления, который заставляет жидкость просачиваться сквозь мембрану и собираться в резервуар, расположенный под ней.
Скорость протекания жидкости через мембрану зависит не только от перепада давления, созданного насосом, но и от расположения ячейки в пределах зажима. Вероятно, вблизи патрубка для подключения насоса перепад давления выше, чем вдали от него. Поэтому, чтобы сравнение двух типов мембран было корректно, их располагали в соседних рядах в центральной части зажима, причем ряд ячеек, закрытых электроформованной мембраной располагался между двумя рядами, закрытыми фабричной мембраной (рис.3b, d). Такое размещение мембран позволило свести к минимуму вариации условий нанесения реагентов и сосредоточиться на свойствах мембран.
Калибровочные кривые, полученные с помощью обычной и электроформованной мембраны, сопоставлены на рис.3c. Это убывающие кривые, аналогичные той, которая получена при обычном ИФА (рис.3a). Калибровочные кривые, полученные с помощью мембран двух типов, хорошо совпадают. Нам не удалось выявить явных различий ни в чувствительности, ни в ширине динамического диапазона. По-видимому, в данном случае структура нановолокон и имеющийся на них электростатический заряд слабо влияют на результаты анализа.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В данной работе мы провели конкурентный ИФА для детекции мелатонина; ИФА проводили в варианте дот-блоттинга с использованием нитроцеллюлозных мембраны двух типов – стандартных коммерческих и электроформованных, состоящих из нановолокон. Оказалось, что мембраны этих двух типов проявили себя практически одинаково, без явной разницы в чувствительности или ширине динамического диапазона. Наноструктурированные ЭФ-мембраны могут представлять интерес в других приложениях, например в очистке воздуха или тканевой инженерии, но по нашим данным они не имеют явных преимуществ в иммуноанализе. Возможности улучшения аналитических характеристик ИФА, достигаемые за счет электроформованных мембран, требуют дальнейшего изучения.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа выполнена при поддержке РНФ, проект № 21-74-10042.
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Kim B.B., Dikova E.B., Sheller U., Dikov M.M., Gavrilova E.M., Egorov A.M. Evaluation of dissociation constants of antigen-antibody complexes by ELISA. Journal of Immunological Methods. 1990. Vol. 131(2). PP. 213–222.
Hui L., Chen W., Najlah M. The challenges to develop antibody-conjugated nanomedicine products. Nano TransMed. 2023. Vol. 2(4). P. 100018.
Reimhult E., Höök F. Design of Surface Modifications for Nanoscale Sensor Applications. Sensors. 2015. Vol. 15(1). PP. 1635–1675.
Rissin D.M., Kan C.W., Campbell T.G., Howes S.C., Fournier D.R., Song L. et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat Biotechnol. 2010. Vol. 28(6). PP. 595–599.
Pavlova E.R., Bagrov D.V., Kopitsyna M.N., Shchelokov D.A., Bonartsev A.P., Zharkova I.I. et al. Poly(hydroxybutyrate‐ co ‐hydroxyvalerate) and bovine serum albumin blend prepared by electrospinning. J of Applied Polymer Sci. 2017. Vol. 134(29). P. 45090.
Pavlova E., Maslakova A., Prusakov K., Bagrov D. Optical sensors based on electrospun membranes principles, applications, and prospects for chemistry and biology. New J Chem. 2022. Vol. 46(18). PP. 8356–8380.
Hosseini S., Azari P., Aeinehvand M., Rothan H., Djordjevic I., Martinez-Chapa S. et al. Intrant ELISA: A Novel Approach to Fabrication of Electrospun Fiber Mat-Assisted Biosensor Platforms and Their Integration within Standard Analytical Well Plates. Applied Sciences. 2016. Vol. 6(11). P. 336.
Hosseini S., Azari P., Farahmand E., Gan S.N., Rothan H.A., Yusof R. et al. Polymethacrylate coated electrospun PHB fibers: An exquisite outlook for fabrication of paper-based biosensors. Biosensors and Bioelectronics. 2015. Vol. 69. PP. 257–264.
Басманов П.И., Кириченко В.Н., Филатов Ю.Н., Юров Ю.Л. Высокоэффективная очистка газов от аэрозолей фильтрами Петрянова. М.: Наука, 2003. 272 c.
Филатов Ю.Н. Электроформование волокнистых материалов (ЭФВ-процесс) / Под ред. Кириченко В.Н. М., 2001. 231 c.
Hoy C.F.O., Kushiro K., Yamaoka Y., Ryo A., Takai M. Rapid multiplex microfiber-based immunoassay for anti-MERS-CoV antibody detection. Sensing and Bio-Sensing Research. 2019. Vol. 26. P. 100304.
Ramachandran S., Singhal M., McKenzie K., Osborn J., Arjyal A., Dongol S. et al. A Rapid, Multiplexed, High-Throughput Flow-Through Membrane Immunoassay: A Convenient Alternative to ELISA. Diagnostics. 2013. Vol. 3(2). PP. 244–260.
Петрова П.А., Замалутдинова С.В., Внукова А.А., Алексеева Д.А., Багров Д.В. Обработка нитроцеллюлозных мембран в тлеющем разряде повышает чувствительность иммуноанализа. Биофизика. 2023. Vol. 68(3). PP. 435–441.
Nartker S., Drzal L.T. Electrospun Cellulose Nitrate Nanofibers. J Nanosci Nanotech. 2010. Vol. 10(9). PP. 5810–5813.
Manis A.E., Bowman J.R., Bowlin G.L., Simpson D.G. Electrospun nitrocellulose and nylon: Design and fabrication of novel high performance platforms for protein blotting applications. J Biol Eng. 2007. Vol. 1(1). P. 2.
Keaswejjareansuk W., Wang X.D. Sisson R., Liang J. Electrospinning process control for fiber-structured poly(Bisphenol A-co-Epichlorohydrin) membrane. AIMS Materials Science. 2020. Vol. 7(2). PP. 130–43.
Научная статья
ОРИГИНАЛЬНОСТЬ БЕЗ ПРИВИЛЕГИЙ: СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭЛЕКТРОФОРМОВАННЫХ И СТАНДАРТНЫХ НИТРОЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ МЕМБРАН В ИММУНОАНАЛИЗЕ НА МЕЛАТОНИН
С.В.Замалутдинова1, мл. науч. сотр., ORCID: 0009-0006-9510-1868 / podgorodova.sofya@yandex.ru
П.А.Петрова1, мл. науч. сотр., ORCID: 0009-0004-7933-0594
А.А.Рамонова1, мл. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-3081-4721
Д.В.Багров1, к.ф.-м.н., вед. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-6355-7282
Аннотация. Электроформование позволяет создавать полимерные мембраны, состоящие из нановолокон. Эти мембраны находят применение в различных задачах фильтрации, изготовления раневых покрытий и тканеинженерных конструкций, а кроме того, их рассматривают как перспективные подложки для иммуноанализа. Несмотря на активный интерес научного сообщества к применению электроформованных мембран для иммуноанализа, на настоящий момент не проведено их прямого сопоставления с мембранами, сформированными с помощью других технологий. В данной работе мы провели такое сопоставление и показали, что детекция мелатонина методом иммуноферментного анализа происходит практически одинаково на мембранах, изготовленных методом электроформования, и обычных коммерчески доступных мембранах.
Ключевые слова: нитроцеллюлозные мембраны, иммуноанализ, мелатонин, иммуноферментный анализ
Для цитирования: С.В. Замалутдинова, П.А. Петрова, А.А. Рамонова, Д.В. Багров. Оригинальность без привилегий: сравнительный анализ электроформованных и стандартных нитроцеллюлозных мембран в иммуноанализе на мелатонин. НАНОИНДУСТРИЯ. 2024. Т. 17, № 3–4. С. 220–229. https://doi.org/
10.22184/1993-8578.2024.17.3-4.220.229
Received: 25.03.2024 | Accepted: 30.03.2024 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.3-4.220.229
Original paper
ORIGINALITY WITHOUT PRIVILEGE: COMPARATIVE ANALYSIS OF ELECTROFORMED AND STANDARD NITROCELLULOSE MEMBRANES IN MELATONIN IMMUNOASSAYS
S.V.Zamalutdinova1, Junior Researcher, ORCID: 0009-0006-9510-1868 / podgorodova.sofya@yandex.ru
P.A.Petrova1, Junior Researcher, ORCID: 0009-0004-7933-0594
A.A.Ramonova1, Junior Researcher, ORCID: 0000-0002-3081-4721
D.V.Bagrov1, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Lead Researcher, ORCID: 0000-0002-6355-7282
Abstract. Electrospinning enables manufacturing of polymer membranes composed of nanofibres. These membranes find application as filters, wound coatings, and tissue engineering scaffolds. They are also considered promising substrates for immunoassays. Despite the scientific community’s keen interest in the immunoassays based on electrospun membranes, a direct comparison with membranes formed through alternative technologies has not been conducted to date. In this study, we performed such a comparison and demonstrated that the detection of melatonin via enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is virtually identical on the electrospun membranes and the conventional commercially available membranes.
Keywords: nitrocellulose membranes, immunoassay, melatonin, enzyme immunoassay
For citation: S.V. Zamalutdinova, P.A. Petrova, A.A. Ramonova, D.V. Bagrov. Originality without privilege: comparative analysis of electroformed and standard nitrocellulose membranes in melatonin immunoassays. NANOINDUSTRY. 2024. Vol. 17. No. 3–4. PP. 220–229. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.3-4.220.229.
ВВЕДЕНИЕ
Иммуноанализ является неотъемлемой частью клинической лабораторной диагностики и научных исследований. В его основе лежит специфическое взаимодействие между антигеном и антителом; константа диссоциации этого взаимодействия обычно лежит в диапазоне ~0,1–1 нМ [1]. Любая молекула из пары "антиген-антитело" может быть аналитом – при измерении уровня антител в крови их улавливают с помощью антигенов, а для обнаружения антигенов, наоборот, их улавливают с помощью антител.
Развитие нанотехнологий позволило значительно усовершенствовать многие виды иммуноанализа. Например, в лабораторную практику вошли наночастицы, модифицированные антителами [2], и аффинные биосенсоры, созданные с использованием нанотехнологий [3]. Были разработаны уникальные рекордно чувствительные иммуноаналитические системы на основе кремниевых "наноколодцев", способные зарегистрировать аналит в концентрации ~0,1 фМ [4]. В целом, наноматериалы стали неотъемлемым компонентом многих иммуноаналитических систем и позволили выполнять анализы быстрее, точнее и дешевле. На этом фоне особый интерес представляет использование электроформованных мембран в качестве подложек для иммуносенсоров.
Электроформованные мембраны – это полимерные нетканые материалы, состоящие из волокон субмикронного диаметра. Большинство коммерчески доступных нетканых материалов, изготовленных с помощью традиционных подходов, состоят из волокон с диаметрами порядка ~1–100 мкм, а для электроформованных мембран диаметры волокон лежат в диапазоне ~100 нм – 1 мкм, а иногда ~10 нм [5]. Малый диаметр волокон обеспечивает мембране высокую удельную поверхность (~10 м2/г) и возможность иммобилизовать большое количество молекул рецепторного слоя, которые будут связывать аналит из пробы [6]. Ряд работ утверждает, что электроформованные мембраны могут использоваться как перспективный элемент в системах для дот-блоттинга и аналогичных лабораторных анализов. Например, это было продемонстрировано в экспериментах с вирусом Денге – его обычно обнаруживают методом иммуноферментного анализа (ИФА), и предел обнаружения может быть снижен приблизительно в 10 раз, если реакция проводится не на донышке полистирольного планшета, а на поверхности волокон электроформованной мембраны [7, 8].
В основе электроформования (электроспиннинга) лежит идея о том, что струя раствора полимера становится тоньше, если на ней есть сильный электрический заряд. Действительно, отталкивание между одноименными близко расположенными участками струи приводит к ее растяжению и уменьшению ее диаметра. Лабораторное электроформование работает следующим образом (рис.1). Раствор полимера помещают в шприц и выдавливают через иглу, расположенную напротив проводящего элемента – коллектора. Между коллектором и иглой прикладывают высокое напряжение, порядка ~10–40 кВ. Заряженная струя раствора полимера движется к коллектору, при этом она обычно деформируется и становится тоньше. Растворитель испаряется, и при этом формируется полимерное волокно, диаметр которого оказывается на несколько порядков меньше диаметра иглы шприца. Волокно хаотическим образом осаждается на коллектор, где и собирается электроформованная мембрана.
Метод электроформования был предложен в середине 20 века академиком Петряновым-Соколовым, и с его помощью производили воздушные фильтры для удаления аэрозольных частиц из воздуха [9, 10]. В начале 21 века интерес к электроформованию резко вырос, и это, по-видимому, можно связать с двумя факторами. Во-первых, широкое распространение получили сканирующие электронные микроскопы, которые являются необходимым инструментом для контроля структуры электроформованных мембран и измерения диаметров волокон. Во-вторых, возникла тканевая инженерия и стало ясно, что электроформованные мембраны, изготовленные из биоразлагаемых полимеров, могут использоваться, чтобы имитировать структуру внеклеточного матрикса [5]. Таким образом, технология электроформования была адаптирована для биологических задач, и на этом фоне возникла гипотеза о применимости изготовленных с ее помощью мембран в биосенсорах.
В недавнем обзоре [6] было показано, что электроформованные мембраны могут быть использованы в биологических и химических сенсорах, предназначенных для обнаружения широкого класса аналитов – от ионов металлов и взрывчатых веществ до цельных вирусов и бактерий. Среди биологических сенсоров особое место занимают иммуносенсоры, в которых рецепторный слой иммобилизован на поверхности электроформованных волокон (с молекулами рецепторного слоя связывается аналит). В некоторых случаях такие сенсоры позволяют радикально снизить время анализа. Например, с использованием сенсора на основе электроформованной мембраны, антитела против вируса MERS-CoV могут быть обнаружены менее, чем за 6 мин – это несравненно меньше, чем типичное время проведения ИФА (~8 ч) [11]. В основе такого радикального сокращения времени лежит идея о пропускании пробы через пористую мембрану, на которой происходит аффинное связывание аналита. Аналогичное, хотя и не столь радикальное, сокращение времени анализа, иногда достигается при использовании дот-блоттинга [12, 13]. В этом методе в качестве подложки используют пористую нитроцеллюлозную мембрану, а большинство растворов и реагентов наносят с помощью вакуумного насоса.
В связи с этим возникает вопрос: верно ли, что электроформованная мембрана, состоящая из тонких нановолокон, обладает преимуществами перед обычными, серийно выпускаемыми пористыми мембранами? Для ответа на этот вопрос необходимо сравнить результаты ИФА, выполненного на мембранах двух типов, причем они должны быть изготовлены из одного и того же материала. Для того чтобы эксперимент был наиболее показательным, необходимо использовать зажим для мембран с вакуумным насосом, который предназначен для дот-блоттинга. Такой эксперимент был выполнен с мембранами из нитроцеллюлозы (НЦ); в качестве системы для ИФА был использован набор реагентов для обнаружения мелатонина. Было показано, что электроформованная мембрана и коммерчески доступная пористая НЦ обеспечивают практически идентичные результаты – одинаковые значения чувствительности и динамического диапазона.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Мембраны. В работе использовали два типа мембран из НЦ – коммерчески доступные, выпускаемые серийно мембраны Bio-rad (номер 1620115), и оригинальные, электроформованные. Их изготавливали следующим образом. Мембрану Bio-rad растворяли в ацетоне, диметилформамиде (ДМФА) или их смеси. Концентрация НЦ составляла 100 мг/мл. Электроформование проводили на установке Nanofiber Electrospinning Unit (Китай) при следующих условиях: напряжение 38–40 кВ, расстояние до коллектора 15 см, внутренний диаметр иглы 0,514 мм (калибр 21g), скорость подачи раствора 1 мл/ч.
Сканирующая электронная микроскопия. Для исследования методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) образцы покрывали тонким слоем золота с толщиной 20 нм с помощью распылителя Eiko IB3 (Япония). Структуру исследовали с помощью СЭМ TM3000 (Hitachi, Япония) при ускоряющем напряжении 15 кВ. Изображения обрабатывали с использованием программного обеспечения Fiji.
Иммуноанализ. Для определения КО мелатонина методом ИФА использовали коммерческий набор KSA908Gel1 компании Cloude-Clone Corp (USA). Реакции проводили в ячейках 96-луночного планшета или на поверхности НЦ мембран. В обоих случаях анализ включал в себя ряд шагов, которые обычно используют при конкурентном ИФА (табл.1). После каждого шага поверхность, на которой проводились реакции, отмывали.
В основе анализа лежит идея о том, что в каждый исследуемый раствор необходимо внести специальный реагент – биотинилированный конкурент. Это конъюгат альбумина с МТ и биотином, и он конкурирует с содержащимся в исследуемом растворе МТ за связывание с антителами, иммобилизованными на поверхности. Биотин, входящий в состав этого конъюгата, позволяет проявить его с помощью стандартных реагентов, таких как стрептавидин с пероксидазой хрена и субстраты для оптической детекции (колориметрической или хемилюминесцентной).
Для разведения реагентов использовали три буфера: фосфатно-солевой буфер (PBS, pH 7.4), фосфатно-солевой буфер с добавлением 0,075% Tween-20 (PBST), а также проприетарный буфер с pH 9,5 для разведения антител (Coating buffer, Cloud-clone).
Для блокировки неспецифических сайтов связывания использовали раствор Blocking buffer (Cloud-clone). Между инкубациями для удаления не связавшихся молекул твердый носитель отмывали в буфере PBST.
В случае экспериментов в 96-луночном планшете все инкубации проводили в термостате при 37 °С и покачивании с частотой 130 об/мин. Содержимое лунок удаляли декантацией. На заключительном этапе анализа в качестве субстрата пероксидазы хрена в каждую лунку вносили по 90 мкл тетраметилбензидина, инкубировали 15 мин, затем реакцию останавливали внесением 50 мкл 0,5 М серной кислоты. Оптическую плотность содержимого лунок планшета измеряли на ридере Hidex Chameleon (Великобритания) при длине волны 450 нм.
В случае проведения анализа на мембранах инкубации проводили при комнатной температуре без покачиваний. Содержимое лунок удаляли, протягивая жидкость через мембрану с помощью насоса. На заключительном этапе результаты визуализировали с помощью хемилюминесцентного субстрата Affinity ECL (ООО "БелкиАнтитела", Россия). Интенсивность хемилюминесценции измеряли на приборе ChemiDoc (BioRad, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Морфология мембран. Метод электроформования применим к очень широкому классу полимеров – полиолефинам, полиамидам, полиэфирам и др. При этом количество статей, посвященных электроформованию НЦ, относительно мало [14, 15]. Это представляется особенно странным с учетом того, что именно в экспериментах с НЦ процесс электроформования был осуществлен впервые [9, 10].
Для выполнения данной работы были выбраны условия электроформования, которые позволили создать мембраны, состоящие из волокон со средним диаметром 280 ± 60 нм (рис.2а, b). В целом это близко к размеру границ между порами в коммерчески доступных мембранах (рис.2c, d). Оптимальные результаты достигались при использовании двухкомпонентного растворителя, состоящего из смеси ацетона и ДМФА в соотношении 7 : 3 или 8 : 2 по объему. Аналогичный подход использовали в работе [16]. При попытке делать электроформование НЦ из раствора в ацетоне игла шприца быстро забивалась, и нам не удавалось получить нетканую мембрану, хотя такие эксперименты описаны в работах [14, 15]. При использовании раствора НЦ в ДМФА возникала иная проблема: ДМФА имеет сравнительно высокую температуру кипения 153 °C и относится к нелетучим растворителям, он недостаточно быстро испарялся, и на коллекторе формировалась сплошная пленка.
В результате оказалось, что двухкомпонентный растворитель был оптимальным и позволил получить тонкие волокна из НЦ.
Мембраны двух описанных типов (рис.2) были использованы в экспериментах по дот-блоттингу.
Результаты иммуноанализа. Для оценки применимости электроформованных мембран в дот-блоттинге необходимо выбрать аналит и набор биохимических реагентов для его обнаружения. В качестве аналита был выбран мелатонин (N-ацетил-5-метокситриптамин, молекулярная масса 232 г/моль) – гормон, который отвечает за регуляцию цикла сна и бодрствования. Обычно измерение мелатонина (МТ) проводят с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС), именно этот метод используют клинико-диагностические лаборатории в России. В то же время существуют коммерчески доступные наборы для определения МТ методом ИФА. МТ является низкомолекулярным веществом, поэтому улавливающие антитела направлены не против него, а против его конъюгата с бычьим сывороточным альбумином, и этот же конъюгат используется в качестве стандарта. Анализ проводится конкурентным способом – в исследуемую пробу вносят биотинилированный конкурент, и МТ, находящийся в пробе, конкурирует с ним за связывание с антителами. Затем биотин можно детектировать конъюгатом стрептавидина с пероксидазой хрена. Типичная калибровочная кривая такого анализа, полученная в обычном 96-луночном планшете, представлена на рис.3a – по мере увеличения концентрации МТ, сигнал снижается.
Реагенты из описанного набора были использованы для дот-блоттинга, с применением вакуумного зажима (рис.3b). Когда в нем размещена мембрана, он аналогичен 96-луночному планшету с проницаемым дном. Жидкость, внесенная в ячейки, не протекает через пористое дно спонтанно, так как ее задерживает сила поверхностного натяжения. Однако при включении насоса возникает перепад давления, который заставляет жидкость просачиваться сквозь мембрану и собираться в резервуар, расположенный под ней.
Скорость протекания жидкости через мембрану зависит не только от перепада давления, созданного насосом, но и от расположения ячейки в пределах зажима. Вероятно, вблизи патрубка для подключения насоса перепад давления выше, чем вдали от него. Поэтому, чтобы сравнение двух типов мембран было корректно, их располагали в соседних рядах в центральной части зажима, причем ряд ячеек, закрытых электроформованной мембраной располагался между двумя рядами, закрытыми фабричной мембраной (рис.3b, d). Такое размещение мембран позволило свести к минимуму вариации условий нанесения реагентов и сосредоточиться на свойствах мембран.
Калибровочные кривые, полученные с помощью обычной и электроформованной мембраны, сопоставлены на рис.3c. Это убывающие кривые, аналогичные той, которая получена при обычном ИФА (рис.3a). Калибровочные кривые, полученные с помощью мембран двух типов, хорошо совпадают. Нам не удалось выявить явных различий ни в чувствительности, ни в ширине динамического диапазона. По-видимому, в данном случае структура нановолокон и имеющийся на них электростатический заряд слабо влияют на результаты анализа.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В данной работе мы провели конкурентный ИФА для детекции мелатонина; ИФА проводили в варианте дот-блоттинга с использованием нитроцеллюлозных мембраны двух типов – стандартных коммерческих и электроформованных, состоящих из нановолокон. Оказалось, что мембраны этих двух типов проявили себя практически одинаково, без явной разницы в чувствительности или ширине динамического диапазона. Наноструктурированные ЭФ-мембраны могут представлять интерес в других приложениях, например в очистке воздуха или тканевой инженерии, но по нашим данным они не имеют явных преимуществ в иммуноанализе. Возможности улучшения аналитических характеристик ИФА, достигаемые за счет электроформованных мембран, требуют дальнейшего изучения.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа выполнена при поддержке РНФ, проект № 21-74-10042.
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Kim B.B., Dikova E.B., Sheller U., Dikov M.M., Gavrilova E.M., Egorov A.M. Evaluation of dissociation constants of antigen-antibody complexes by ELISA. Journal of Immunological Methods. 1990. Vol. 131(2). PP. 213–222.
Hui L., Chen W., Najlah M. The challenges to develop antibody-conjugated nanomedicine products. Nano TransMed. 2023. Vol. 2(4). P. 100018.
Reimhult E., Höök F. Design of Surface Modifications for Nanoscale Sensor Applications. Sensors. 2015. Vol. 15(1). PP. 1635–1675.
Rissin D.M., Kan C.W., Campbell T.G., Howes S.C., Fournier D.R., Song L. et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat Biotechnol. 2010. Vol. 28(6). PP. 595–599.
Pavlova E.R., Bagrov D.V., Kopitsyna M.N., Shchelokov D.A., Bonartsev A.P., Zharkova I.I. et al. Poly(hydroxybutyrate‐ co ‐hydroxyvalerate) and bovine serum albumin blend prepared by electrospinning. J of Applied Polymer Sci. 2017. Vol. 134(29). P. 45090.
Pavlova E., Maslakova A., Prusakov K., Bagrov D. Optical sensors based on electrospun membranes principles, applications, and prospects for chemistry and biology. New J Chem. 2022. Vol. 46(18). PP. 8356–8380.
Hosseini S., Azari P., Aeinehvand M., Rothan H., Djordjevic I., Martinez-Chapa S. et al. Intrant ELISA: A Novel Approach to Fabrication of Electrospun Fiber Mat-Assisted Biosensor Platforms and Their Integration within Standard Analytical Well Plates. Applied Sciences. 2016. Vol. 6(11). P. 336.
Hosseini S., Azari P., Farahmand E., Gan S.N., Rothan H.A., Yusof R. et al. Polymethacrylate coated electrospun PHB fibers: An exquisite outlook for fabrication of paper-based biosensors. Biosensors and Bioelectronics. 2015. Vol. 69. PP. 257–264.
Басманов П.И., Кириченко В.Н., Филатов Ю.Н., Юров Ю.Л. Высокоэффективная очистка газов от аэрозолей фильтрами Петрянова. М.: Наука, 2003. 272 c.
Филатов Ю.Н. Электроформование волокнистых материалов (ЭФВ-процесс) / Под ред. Кириченко В.Н. М., 2001. 231 c.
Hoy C.F.O., Kushiro K., Yamaoka Y., Ryo A., Takai M. Rapid multiplex microfiber-based immunoassay for anti-MERS-CoV antibody detection. Sensing and Bio-Sensing Research. 2019. Vol. 26. P. 100304.
Ramachandran S., Singhal M., McKenzie K., Osborn J., Arjyal A., Dongol S. et al. A Rapid, Multiplexed, High-Throughput Flow-Through Membrane Immunoassay: A Convenient Alternative to ELISA. Diagnostics. 2013. Vol. 3(2). PP. 244–260.
Петрова П.А., Замалутдинова С.В., Внукова А.А., Алексеева Д.А., Багров Д.В. Обработка нитроцеллюлозных мембран в тлеющем разряде повышает чувствительность иммуноанализа. Биофизика. 2023. Vol. 68(3). PP. 435–441.
Nartker S., Drzal L.T. Electrospun Cellulose Nitrate Nanofibers. J Nanosci Nanotech. 2010. Vol. 10(9). PP. 5810–5813.
Manis A.E., Bowman J.R., Bowlin G.L., Simpson D.G. Electrospun nitrocellulose and nylon: Design and fabrication of novel high performance platforms for protein blotting applications. J Biol Eng. 2007. Vol. 1(1). P. 2.
Keaswejjareansuk W., Wang X.D. Sisson R., Liang J. Electrospinning process control for fiber-structured poly(Bisphenol A-co-Epichlorohydrin) membrane. AIMS Materials Science. 2020. Vol. 7(2). PP. 130–43.
Отзывы читателей
