eng
Выпуск #5/2024
Ю.Д.Иванов, И.Д.Шумов, А.Н.Аблеев, А.Ф.Козлов, Е.Е.Важенкова, В.С.Зиборов, А.Ю.Долгобородов, О.Ф.Петров, С.В.Будник, Р.С.Чурюкин, С.В.Новиков, А.М.Тереза, А.И.Арчаков
УСКОРИТЕЛЬ ЭЛЕКТРОНОВ ДЛЯ ИНАКТИВАЦИИ ФЕРМЕНТА ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА
УСКОРИТЕЛЬ ЭЛЕКТРОНОВ ДЛЯ ИНАКТИВАЦИИ ФЕРМЕНТА ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА
Просмотры: 1392
DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.5.260.266
Нанотехнологии – это технологии, которые манипулируют с объектами, имеющими характеристические размеры менее 100 нм. В работе в качестве объектов были использованы молекулы фермента пероксидазы хрена (ПХ), имеющие размеры порядка 5 нм, а устройство для их инактивации представляло из себя ускоритель электронов, позволяющий получить пучок электронов с энергией 9,7 МэВ. Было показано, что при дозе облучения 25 кГр активность этого фермента снижалась практически до нуля. Полученные результаты необходимо учитывать в разработке методов стерилизации продуктов питания и упаковочных материалов для пищевой и медицинской продукции.
Нанотехнологии – это технологии, которые манипулируют с объектами, имеющими характеристические размеры менее 100 нм. В работе в качестве объектов были использованы молекулы фермента пероксидазы хрена (ПХ), имеющие размеры порядка 5 нм, а устройство для их инактивации представляло из себя ускоритель электронов, позволяющий получить пучок электронов с энергией 9,7 МэВ. Было показано, что при дозе облучения 25 кГр активность этого фермента снижалась практически до нуля. Полученные результаты необходимо учитывать в разработке методов стерилизации продуктов питания и упаковочных материалов для пищевой и медицинской продукции.
Теги: electron accelerator enzyme inactivation horseradish peroxidase инактивация фермента пероксидаза хрена электронный ускоритель
Получено: 31.05.2024 г. | Принято: 7.06.2024 г. | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.5.260.266
Научная статья
УСКОРИТЕЛЬ ЭЛЕКТРОНОВ ДЛЯ ИНАКТИВАЦИИ
ФЕРМЕНТА ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА
Ю.Д.Иванов1, 2, д.б.н., зав. лаб., проф., ORCID: 0000-0001-5041-1914
И.Д.Шумов1, к.б.н., науч. сотр., ORCID: 0000-0002-9795-7065
А.Н.Аблеев1, вед. инж., ORCID: 0009-0004-3096-107X
А.Ф.Козлов1, вед. инж., ORCID: 0000-0002-2117-8743
Е.Е.Важенкова1, лаборант, ORCID: 0009-0001-4224-8907
В.С.Зиборов1, 2, к.ф.-м.н., ст. науч. сотр., ORCID: 0000-0001-7942-3337
А.Ю.Долгобородов2, д.ф.-м.н., зав. лаб., ORCID: 0000-0001-7054-7341
О.Ф.Петров2, д.ф.-м.н., дир., акад. РАН, ORCID: 0000-0002-6373-0305
С.В.Будник3, ген. дир., ORCID: 0009-0006-7597-8523
Р.С.Чурюкин3, к.б.н., гл. техн., ORCID: 0000-0002-2845-1052
С.В.Новиков4, к.т.н., зам. ген. дир., ORCID: 0000-0002-0943-9488
А.М.Тереза5, ст. науч. сотр., к.ф.-м.н., ORCID: 0009-0005-7985-0044
А.И.Арчаков1, д.б.н., проф., акад. РАН, науч. рук., ORCID: 0000-0002-2290-8090 / shum230988@yandex.ru
Аннотация. Нанотехнологии – это технологии, которые манипулируют с объектами, имеющими характеристические размеры менее 100 нм. В работе в качестве объектов были использованы молекулы фермента пероксидазы хрена (ПХ), имеющие размеры порядка 5 нм, а устройство для их инактивации представляло из себя ускоритель электронов, позволяющий получить пучок электронов с энергией 9,7 МэВ. Было показано, что при дозе облучения 25 кГр активность этого фермента снижалась практически до нуля. Полученные результаты необходимо учитывать в разработке методов стерилизации продуктов питания и упаковочных материалов для пищевой и медицинской продукции.
Ключевые слова: пероксидаза хрена, электронный ускоритель, инактивация фермента
Для цитирования: Ю.Д. Иванов, И.Д. Шумов, А.Н. Аблеев, А.Ф. Козлов, Е.Е. Важенкова, В.С. Зиборов, А.Ю. Долгобородов, О.Ф. Петров, С.В. Будник, Р.С. Чурюкин, С.В. Новиков, А.М. Тереза, А.И. Арчаков. Ускоритель электронов для инактивации фермента пероксидазы хрена. НАНОИНДУСТРИЯ. 2024. Т. 17. № 5. С. 260–266. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.5.260.266.
Received: 31.05.2024 | Accepted: 7.06.2024 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.5.260.266
Original paper
ELECTRON ACCELERATOR FOR INACTIVATION
OF HORSERADISH PEROXIDASE ENZYME
Yu.D.Ivanov1, 2, Doct. of Sci. (Biology), Prof., Head of Laboratory, ORCID: 0000-0001-5041-1914
I.D.Shumov1, Cand. of Sci. (Biology), Researcher, ORCID: 0000-0002-9795-7065
A.N.Ableev1, Leading Engineer, ORCID: 0009-0004-3096-107X
A.F.Kozlov1, Leading Engineer, ORCID: 0000-0002-2117-8743
E.E.Vazhenkova1, Laboratory assistant, ORCID: 0009-0001-4224-8907
V.S.Ziborov1, 2, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Senior Researcher, ORCID: 0000-0001-7942-3337
A.Yu.Dolgoborodov2, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Head of Laboratory, ORCID: 0000-0001-7054-7341
O.F.Petrov2, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Acad. of RAS, Director, ORCID: 0000-0002-6373-0305
S.V.Budnik3, Director General, ORCID: 0009-0006-7597-8523
R.S.Churyukin3, Cand. of Sci. (Biology), Chief technologist, ORCID: 0000-0002-2845-1052
S.V.Novikov4, Cand. of Sci. (Tech), Deputy General Director, ORCID: 0000-0002-0943-9488
A.M.Tereza5, Senior Scientist, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics) ORCID: 0009-0005-7985-0044
A.I.Archakov1, Doct. of Sci. (Biology), Prof., Academician of RAS, Scientific Adviser, ORCID: 0000-0002-2290-8090 /
shum230988@yandex.ru
Abstract. Nanotechnology manipulates objects with characteristic dimensions of less than 100 nm. In this work, molecules of horseradish peroxidase (HRP) enzyme with dimensions of the order of 5 nm are used as objects, and the device for their inactivation is an electron accelerator, which allows us to obtain electron beam with energy of 9.7 MeV. We demonstrate that upon an irradiation dose of 25 kGy, the activity of the enzyme decreased virtually to zero. The results obtained must be taken into account in the development of methods for sterilization of food and packaging materials for food and medical products.
Keywords: horseradish peroxidase, electron accelerator, enzyme inactivation
For citation: Yu.D. Ivanov, I.D. Shumov, A.N. Ableev, A.F. Kozlov, E.E. Vazhenkova, V.S. Ziborov, A.Yu. Dolgoborodov, O.F. Petrov, S.V. Budnik, R.S. Churyukin, S.V. Novikov, A.M. Tereza, A.I. Archakov. Electron accelerator for inactivation of horseradish peroxidase enzyme. NANOINDUSTRY. 2024. Vol. 17. No. 5. PP. 260–266. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.5.260.266.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время важной задачей исследований, ориентированных на развитие пищевых технологий, биотехнологии и биомедицины, является разработка методов инактивации патогенных микроорганизмов (таких как бактерии [1] и вирусные частицы [2, 3]) в продуктах питания [2–6], а также стерилизации медицинских устройств и материалов [7]. Опубликованные исследования показали перспективность использования для вышеуказанных целей облучения обрабатываемых сред (включая упаковочные материалы) ускоренными электронами [5, 6]. Разработанные к настоящему времени устройства для обработки материалов ускоренными электронами позволяют достигать энергии электронов порядка 1–10 МэВ. В частности, устройство ТТ1000 (Бельгия) позволяет получать электронные пучки с энергией электронов на уровне 7 МэВ [8], а устройство отечественного производства TEOCORTEX (Россия) – даже 10 МэВ [9]. Такие устройства вполне могут использоваться для обработки поверхностей с целью их стерилизации [10]. Эти установки удобнее в использовании, чем установки химической стерилизации, так как установки на базе электронных ускорителей гораздо проще в управлении. В то же время, необходимо дальнейшее детальное изучение влияния доз излучения на обрабатываемые материалы и микроорганизмы, подлежащие инактивации. В связи с последним обстоятельством, необходимо отметить, что процессы в живых системах, включая патогенные микроорганизмы, регулируются ферментными системами [11]. Соответственно, важным направлением исследований является изучение влияния воздействия пучков ускоренных электронов на функционирование ферментных систем.
В нашей работе было проведено исследование инактивации модельного фермента – пероксидазы хрена в результате облучения его раствора пучком ускоренных электронов с высокой энергией (~10 МэВ). Фермент ПХ был выбран в качестве модельного объекта исходя из его изученности [12]: так, охарактеризованы его химический состав [13] и пространственная структура [14]. Этот фермент представляет из себя гликопротеин с молекулярной массой 40–44 кДа [13, 15].
В качестве метода определения инактивации ПХ в результате воздействия пучка ускоренных электронов на раствор фермента использовали спектрофотометрию, которая позволяет проводить анализ активности фермента после воздействия на него различными физико-химическими методами [16–18].
Было показано, что доза облучения 25 кГр приводит к практически полной потере ферментом активности в реакции окисления его субстрата – 2,2′-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната) (АБТС) – в присутствии пероксида водорода (H2O2).
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Использованные реактивы. Аналогично работе [18], в настоящей работе использовали белок ПХ, выделенный из хрена (Sigma, Cat. #6782). 2,2′-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат) (АБТС) был также приобретен в Sigma (Cat. #A-1888). Пероксид водорода (H2O2, ч.д.а.), лимонная кислота (ос.ч.) и однозамещенный фосфат натрия (Na2HPO4, ч.д.а.) были приобретены в "Реахим" (Москва). 2 мМ фосфатно-солевой буфер в модификации Дульбекко (ФСБ-Д) готовили путем растворения готовой смеси солей (Pierce, США) в ультрачистой деионизированной воде. Все растворы, использованные в экспериментах, готовили, используя ультрачистую воду (18,2 MОм ∙ см), очищенную с помощью установки Simplicity UV (Millipore, Франция).
Эксперименты на электронном ускорителе. Для исследования воздействия электронного пучка на фермент ПХ 1 мл 10–7 М раствора фермента в 2 мМ ФСБ-Д с pH 7.4 помещали в одноразовую полипропиленовую пробирку с раствором белка номинальным объемом 1,7 мл. Пробирку размещали в зоне воздействия электронного пучка ускорителя электронов ООО "Теокортекс". При этом температура среды поддерживали на уровне Tсреды = 20 °C. Поглощенная образцом ПХ, облученным в ускорителе электронов, доза излучения составила 25 кГр. Облученный образец ПХ передавали на спектрофотометрический анализ.
Контрольные эксперименты. Контрольные эксперименты выполняли с образцом ПХ, выдержанном в изолированном помещении. Контрольный образец 10–7 М раствора фермента в 2 мМ ФСБ-Д буфере с pH 7,4 объемом 1 мл также помещали в одноразовую полипропиленовую пробирку с раствором белка номинальным объемом 1,7 мл, которую размещали в изолированном помещении с уровнем фонового излучения, разрешенного общепринятыми санитарными нормами. После этого контрольный образец раствора фермента также передавали на спектрофотометрический анализ.
Спектрофотометрические измерения. Спектрофотометрическое определение активности фермента ПХ проводили согласно методике Sanders et al. [19], как описано в наших предыдущих публикациях [16–18]. А именно, при помощи спектрофотометра модели 8453 (Agilent Deutschland GmbH, Вальдбронн, Германия) регистрировали зависимости поглощения 10–9 М раствора ПХ от времени при длине волны 405 нм в течение 5 мин. Измерения проводили в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см (Agilent Deutschland GmbH, Вальдбронн, Германия). Измерения проводили в фосфатно-цитратном буфере, содержащем 51 мМ Na2HPO4, 24 мМ лимонной кислоты, pH 5 [19], в который также был предварительно добавлен субстрат АБТС в концентрации 0,3 мМ. Для проведения измерений 30 мкл 0,1 мкМ (10–7 М) исследуемого раствора ПХ добавляли в кварцевую кювету, содержащую 2,95 мл вышеописанного буфера, содержащего субстрат АБТС, и тщательно перемешивали. Затем в кювету добавляли 8 мкл 3% (масс./масс.) раствора пероксида водорода и сразу же начинали регистрацию зависимости поглощения раствора в кювете при длине волны 405 нм от времени.
Ферментативную активность ПХ в реакции окисления субстрата АБТС рассчитывали по данным спектрофотометрических измерений согласно методике фирмы-производителя фермента и субстрата (Sigma) [20].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Эксперименты проводили в два этапа. На первом этапе проводили облучение раствора фермента ПХ в электронном ускорителе. Доза поглощенного этим раствором излучения составила 25 кГр. Контрольный образец раствора фермента выдерживали при это в изолированном помещении, исключая его облучение. На втором этапе определяли активность фермента в облученном и в контрольном образцах раствора фермента методом спектрофотометрии исходя из зависимости скорости наработки продукта в ходе реакции окисления субстрата АБТС, катализируемой ПХ. С этой целью проводили мониторинг наработки продукта реакции от времени в течение 5 мин. В процессе этой ферментативной реакции поглощение раствора, содержащего наработанный в течение 5 мин продукт реакции, при длине волны 405 нм и длине оптического пути 1 см составило Аконтр = 2,0 и Аоблуч = 0,06 в случае контрольного и облученного дозой 25 кГр образцов фермента, соответственно. Соответственно, активность фермента ПХ по отношению к его субстрату АБТС в контрольном и облученном образцах составила 111,67 ед./мл и 3,35 ед/мл, уменьшившись в результате облучения в 33 раза.
Полученные нами данные согласуются с данными, полученными ранее Liu et al. [21]. Эти авторы исследовали воздействие облучения электронным пучком на активность ферментов цианобактерий Microcystis aeruginosa, обнаружили ~10-кратное снижение активности пероксидазы Microcystis aeruginosa после облучения электронным пучком c энергией лишь 1 МэВ при дозах облучения даже 5 кГр. В нашем же случае, энергия пучка была в 10 раз выше, а доза облучения – в 5 раз выше, чем в экспериментах Liu et al. [21], что приводило к еще более сильной дезактивации фермента пероксидазы. В нашей работе были проведены исследования по влиянию облучения электронным пучком с энергией ~ 10 МэВ на фермент ПХ. Для этого использовался спектрофотометрический метод контроля активности фермента ПХ. Исходя из спектрофотометрических данных получено, что активность фермента без воздействия облучения была в 33 раза выше, чем после воздействия облучения дозой 25 кГр. Известно, что активность фермента связана с его пространственной структурой, включая структуру его активного центра [11].
Соответственно, представленные данные означают, что при дозе облучения порядка 25 кГр наблюдается разрушение структуры фермента, включая его активный центр.
ВЫВОДЫ
Было проведено исследование влияния ускоренных электронов c энергией ~10 МэВ на фермент ПХ. Было получено, что при такой дозе облучения наблюдается практически полная инактивация фермента, что указывает на разрушение его структуры. Полученные результаты важны для корректной оценки влияния ускоренных электронов на ферменты при стерилизации продуктов питания и других материалов в установках на базе ускорителей электронов. Также результаты нашей работы следует учитывать для создания безопасных условий работы персонала.
БЛАГОДАРНОСТИ
Спектрофотометрические измерения выполнены в рамах Программы фундаментальных научных исследований в Российской Федерации на долгосрочный период (2021–2030 годы) (№ 122030100168-2). Облучение фермента в электронном ускорителе выполнено при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение № 075-00270-24-00).
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Luo Z., Chang G., Liu Y., Ni K., Zhou T., Lv X., Yu J., Bai J., Wang X. Inactivation of suspended cells and biofilms of the gram-negative bacteria by electron beam irradiation and possible mechanisms of action. LWT Food Sci Technol 2022. Vol. 172. P. 114171. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2022.114171
Predmore A., Sanglay G.C., DiCaprio E., Li J., Uribe R.M., Lee K. Electron beam inactivation of Tulane virus on fresh produce, and mechanism of inactivation of human norovirus surrogates by electron beam irradiation. Int J Food Microbiol 2015. Vol. 198. PP. 28–36. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2014.12.024
Espinosa A.C., Jesudhasan P., Arredondo R., Cepeda M., Mazari-Hiriart M., Mena K.D., Pillai S.D. Quantifying the Reduction in Potential Health Risks by Determining the Sensitivity of Poliovirus Type 1 Chat Strain and Rotavirus SA-11 to Electron Beam Irradiation of Iceberg Lettuce and Spinach. Appl Environmental Biol. 2012. Vol. 78(4). PP. 988–993. https://doi.org/10.1128/AEM.06927-11
Lung H., Cheng Y., Chang Y., Huang H., Yang B.B., Wang C. Microbial decontamination of food by electron beam irradiation. Trends Food Sci Technol. 2015. Vol. 44. PP. 66–78. https://doi.org/10.1016/j.tifs.2015.03.005
Tahergorabi R., Matak K.E., Jaczynski J. Application of electron beam to inactivate Salmonella in food: Recent developments. Food Res Intl. 2012. Vol. 45. PP. 685–694. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2011.02.003
Grasso E.M., Uribe-Rendon R.M., Lee K. Inactivation of Escherichia coli Inoculated onto Fresh-Cut Chopped Cabbage Using Electron-Beam Processing. J Food Protection. 2011. Vol. 74(1). PP. 115–118. https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-10-281
Gotzmann G., Portillo J., Wronski S., Kohl Y., Gorjup E., Schuck H., Rögner F.H., Müller M., Chaberny I.F., Schönfelder J., Wetzel G. Low-energy electron-beam treatment as alternative for on-site sterilization of highly functionalized medical products A feasibility study. Radiation Phys Chem. 2018. Vol. 150. PP. 9–19. https://doi.org/10.1016/j.radphyschem.2018.04.008
Abs M., Jongen Y., Poncelet E., Bol J. The IBA rhodotron TT1000: a very high power E-beam accelerator. Radiation Phys Chem. 2004. Vol. 71. PP. 285–288. https://doi.org/10.1016/j.radphyschem.2004.03.061
Cherkashina N.I., Pavlenko V.I., Abrosimov V.M., Gavrish V.M., Trofimov V.I., Budnik S.V., Churyukin R.S. Effect of 10 MeV electron irradiation on polyimide composites for space systems, Acta Astronautica. 2021. Vol. 184. PP. 59–69. https://doi.org/10.1016/j.actaastro.2021.03.032
Hutchinson F. Chemical changes induced in DNA by ionizing radiation. Progress in Nucleic Acid Res Mol Biol. 1985. Vol. 32. PP. 115–154. https://doi.org/10.1016/S0079-6603(08)60347-5
Metzler D.E. Biochemistry, the Chemical Reactions of Living Cells, 1st ed.; Academic Press: Cambridge, UK, 1977.
Veitch N.C. Horseradish peroxidase : a modern view of a classic enzyme. Phytochemistry. 2004. Vol. 65(3). PP. 249–259. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2003.10.022
Welinder K.G. Amino acid sequence studies of horseradish peroxidase, Amino and carboxyl termini, cyanogen bromide and tryptic frag-ments, the complete sequence, and some structural characteristics of horseradish peroxidase. Cent Eur J Biochem. 1979. Vol. 96. PP. 483–502. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1979.tb13061.x
Gajhede M., David J. Schuller D.J., Henriksen A., Smith A.T., Poulos T.L. Crystal structure of horseradish peroxidase C at 2.15 Å resolution / Nature Structural Biology. 1997. Vol. 4, PP. 1032–1038. https://doi.org/10.1038/nsb1297-1032
Davies P.F., Rennke H.G., Cotran R.S. Influence of molecular charge upon the endocytosis and intracellular fate of peroxidase activity in cultured arterial endothelium, J Cell Sci. 1981. Vol. 49(1). PP. 69–86. https://doi.org/10.1242/jcs.49.1.69
Ivanov Y.D., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Ivanova I.A., Valueva A.A., Tatur V.Y., Smelov M.V., Ivanova N.D., Ziborov V.S. AFM imaging of protein aggregation in studying the impact of knotted electromagnetic field on a peroxidase. Sci Rep. 2020. Vol. 10. P. 9022. https://doi.org/10.1038/s41598-020-65888-z
Ziborov V.S., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Larionov D.I., Evdokimov A.N., Tatur V.Y., Aleshko A.I., Sakharov K.Y., Dolgoborodov A.Y., Fortov V.E., Archakov A.I., Ivanov Y.D. The Impact of Fast-Rise-Time Electromagnetic Field and Pressure on the Aggregation of Peroxidase upon Its Adsorption onto Mica. Appl Sci. 2021. Vol. 11(24). P. 11677. https://doi.org/10.3390/app 112411677
Иванов Ю.Д., Шумов И.Д., Козлов А.Ф., Ершова М.О., Валуева А.А., Иванова И.А., Татур В.Ю., Лукьяница А.А., Иванова Н.Д., Неведрова Е.Д., Зиборов В.С. АСМ-исследование пост-эффекта движения глицерина в выходной части проточной системы на адсорбционные свойства белка. НАНОИНДУСТРИЯ. 2023. № 16(2). С. 106–113. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2023.16.2.106.113
Sanders S.A., Bray R.C., Smith A.T. pH-dependent properties of a mutant horseradish peroxidase isoenzyme C in which Arg38 has been replaced with lysine, Eur J Biochem. 1994. Vol. 224. PP. 1029–1037. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1994.01029.x
Электронный источник: Enzymatic Assay of Peroxidase (EC 1.11.1.7) 2,20-Azino-Bis(3-Ethylbenzthiazoline-6-Sulfonic Acid) as a Substrate Sigma Prod. No. P-6782. Available online: https://www.sigmaaldrich.com/RU/en/technical-documents/protocol/protein-biology/enzymeactivity-assays/enzymatic-assay-of-peroxidase-abts-as-substrate (дата обращения 18 February 2022).
Liu S., Zhao Y., Jiang W., Wu M., Ma F. Inactivation of Microcystis aeruginosa by Electron Beam Irradiation. Water Air Soil Pollut. 2014. Vol. 225. P. 2093. https://doi.org/10.1007/s11270-014-2093-8
Научная статья
УСКОРИТЕЛЬ ЭЛЕКТРОНОВ ДЛЯ ИНАКТИВАЦИИ
ФЕРМЕНТА ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА
Ю.Д.Иванов1, 2, д.б.н., зав. лаб., проф., ORCID: 0000-0001-5041-1914
И.Д.Шумов1, к.б.н., науч. сотр., ORCID: 0000-0002-9795-7065
А.Н.Аблеев1, вед. инж., ORCID: 0009-0004-3096-107X
А.Ф.Козлов1, вед. инж., ORCID: 0000-0002-2117-8743
Е.Е.Важенкова1, лаборант, ORCID: 0009-0001-4224-8907
В.С.Зиборов1, 2, к.ф.-м.н., ст. науч. сотр., ORCID: 0000-0001-7942-3337
А.Ю.Долгобородов2, д.ф.-м.н., зав. лаб., ORCID: 0000-0001-7054-7341
О.Ф.Петров2, д.ф.-м.н., дир., акад. РАН, ORCID: 0000-0002-6373-0305
С.В.Будник3, ген. дир., ORCID: 0009-0006-7597-8523
Р.С.Чурюкин3, к.б.н., гл. техн., ORCID: 0000-0002-2845-1052
С.В.Новиков4, к.т.н., зам. ген. дир., ORCID: 0000-0002-0943-9488
А.М.Тереза5, ст. науч. сотр., к.ф.-м.н., ORCID: 0009-0005-7985-0044
А.И.Арчаков1, д.б.н., проф., акад. РАН, науч. рук., ORCID: 0000-0002-2290-8090 / shum230988@yandex.ru
Аннотация. Нанотехнологии – это технологии, которые манипулируют с объектами, имеющими характеристические размеры менее 100 нм. В работе в качестве объектов были использованы молекулы фермента пероксидазы хрена (ПХ), имеющие размеры порядка 5 нм, а устройство для их инактивации представляло из себя ускоритель электронов, позволяющий получить пучок электронов с энергией 9,7 МэВ. Было показано, что при дозе облучения 25 кГр активность этого фермента снижалась практически до нуля. Полученные результаты необходимо учитывать в разработке методов стерилизации продуктов питания и упаковочных материалов для пищевой и медицинской продукции.
Ключевые слова: пероксидаза хрена, электронный ускоритель, инактивация фермента
Для цитирования: Ю.Д. Иванов, И.Д. Шумов, А.Н. Аблеев, А.Ф. Козлов, Е.Е. Важенкова, В.С. Зиборов, А.Ю. Долгобородов, О.Ф. Петров, С.В. Будник, Р.С. Чурюкин, С.В. Новиков, А.М. Тереза, А.И. Арчаков. Ускоритель электронов для инактивации фермента пероксидазы хрена. НАНОИНДУСТРИЯ. 2024. Т. 17. № 5. С. 260–266. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.5.260.266.
Received: 31.05.2024 | Accepted: 7.06.2024 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.5.260.266
Original paper
ELECTRON ACCELERATOR FOR INACTIVATION
OF HORSERADISH PEROXIDASE ENZYME
Yu.D.Ivanov1, 2, Doct. of Sci. (Biology), Prof., Head of Laboratory, ORCID: 0000-0001-5041-1914
I.D.Shumov1, Cand. of Sci. (Biology), Researcher, ORCID: 0000-0002-9795-7065
A.N.Ableev1, Leading Engineer, ORCID: 0009-0004-3096-107X
A.F.Kozlov1, Leading Engineer, ORCID: 0000-0002-2117-8743
E.E.Vazhenkova1, Laboratory assistant, ORCID: 0009-0001-4224-8907
V.S.Ziborov1, 2, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Senior Researcher, ORCID: 0000-0001-7942-3337
A.Yu.Dolgoborodov2, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Head of Laboratory, ORCID: 0000-0001-7054-7341
O.F.Petrov2, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Acad. of RAS, Director, ORCID: 0000-0002-6373-0305
S.V.Budnik3, Director General, ORCID: 0009-0006-7597-8523
R.S.Churyukin3, Cand. of Sci. (Biology), Chief technologist, ORCID: 0000-0002-2845-1052
S.V.Novikov4, Cand. of Sci. (Tech), Deputy General Director, ORCID: 0000-0002-0943-9488
A.M.Tereza5, Senior Scientist, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics) ORCID: 0009-0005-7985-0044
A.I.Archakov1, Doct. of Sci. (Biology), Prof., Academician of RAS, Scientific Adviser, ORCID: 0000-0002-2290-8090 /
shum230988@yandex.ru
Abstract. Nanotechnology manipulates objects with characteristic dimensions of less than 100 nm. In this work, molecules of horseradish peroxidase (HRP) enzyme with dimensions of the order of 5 nm are used as objects, and the device for their inactivation is an electron accelerator, which allows us to obtain electron beam with energy of 9.7 MeV. We demonstrate that upon an irradiation dose of 25 kGy, the activity of the enzyme decreased virtually to zero. The results obtained must be taken into account in the development of methods for sterilization of food and packaging materials for food and medical products.
Keywords: horseradish peroxidase, electron accelerator, enzyme inactivation
For citation: Yu.D. Ivanov, I.D. Shumov, A.N. Ableev, A.F. Kozlov, E.E. Vazhenkova, V.S. Ziborov, A.Yu. Dolgoborodov, O.F. Petrov, S.V. Budnik, R.S. Churyukin, S.V. Novikov, A.M. Tereza, A.I. Archakov. Electron accelerator for inactivation of horseradish peroxidase enzyme. NANOINDUSTRY. 2024. Vol. 17. No. 5. PP. 260–266. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.5.260.266.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время важной задачей исследований, ориентированных на развитие пищевых технологий, биотехнологии и биомедицины, является разработка методов инактивации патогенных микроорганизмов (таких как бактерии [1] и вирусные частицы [2, 3]) в продуктах питания [2–6], а также стерилизации медицинских устройств и материалов [7]. Опубликованные исследования показали перспективность использования для вышеуказанных целей облучения обрабатываемых сред (включая упаковочные материалы) ускоренными электронами [5, 6]. Разработанные к настоящему времени устройства для обработки материалов ускоренными электронами позволяют достигать энергии электронов порядка 1–10 МэВ. В частности, устройство ТТ1000 (Бельгия) позволяет получать электронные пучки с энергией электронов на уровне 7 МэВ [8], а устройство отечественного производства TEOCORTEX (Россия) – даже 10 МэВ [9]. Такие устройства вполне могут использоваться для обработки поверхностей с целью их стерилизации [10]. Эти установки удобнее в использовании, чем установки химической стерилизации, так как установки на базе электронных ускорителей гораздо проще в управлении. В то же время, необходимо дальнейшее детальное изучение влияния доз излучения на обрабатываемые материалы и микроорганизмы, подлежащие инактивации. В связи с последним обстоятельством, необходимо отметить, что процессы в живых системах, включая патогенные микроорганизмы, регулируются ферментными системами [11]. Соответственно, важным направлением исследований является изучение влияния воздействия пучков ускоренных электронов на функционирование ферментных систем.
В нашей работе было проведено исследование инактивации модельного фермента – пероксидазы хрена в результате облучения его раствора пучком ускоренных электронов с высокой энергией (~10 МэВ). Фермент ПХ был выбран в качестве модельного объекта исходя из его изученности [12]: так, охарактеризованы его химический состав [13] и пространственная структура [14]. Этот фермент представляет из себя гликопротеин с молекулярной массой 40–44 кДа [13, 15].
В качестве метода определения инактивации ПХ в результате воздействия пучка ускоренных электронов на раствор фермента использовали спектрофотометрию, которая позволяет проводить анализ активности фермента после воздействия на него различными физико-химическими методами [16–18].
Было показано, что доза облучения 25 кГр приводит к практически полной потере ферментом активности в реакции окисления его субстрата – 2,2′-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната) (АБТС) – в присутствии пероксида водорода (H2O2).
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Использованные реактивы. Аналогично работе [18], в настоящей работе использовали белок ПХ, выделенный из хрена (Sigma, Cat. #6782). 2,2′-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат) (АБТС) был также приобретен в Sigma (Cat. #A-1888). Пероксид водорода (H2O2, ч.д.а.), лимонная кислота (ос.ч.) и однозамещенный фосфат натрия (Na2HPO4, ч.д.а.) были приобретены в "Реахим" (Москва). 2 мМ фосфатно-солевой буфер в модификации Дульбекко (ФСБ-Д) готовили путем растворения готовой смеси солей (Pierce, США) в ультрачистой деионизированной воде. Все растворы, использованные в экспериментах, готовили, используя ультрачистую воду (18,2 MОм ∙ см), очищенную с помощью установки Simplicity UV (Millipore, Франция).
Эксперименты на электронном ускорителе. Для исследования воздействия электронного пучка на фермент ПХ 1 мл 10–7 М раствора фермента в 2 мМ ФСБ-Д с pH 7.4 помещали в одноразовую полипропиленовую пробирку с раствором белка номинальным объемом 1,7 мл. Пробирку размещали в зоне воздействия электронного пучка ускорителя электронов ООО "Теокортекс". При этом температура среды поддерживали на уровне Tсреды = 20 °C. Поглощенная образцом ПХ, облученным в ускорителе электронов, доза излучения составила 25 кГр. Облученный образец ПХ передавали на спектрофотометрический анализ.
Контрольные эксперименты. Контрольные эксперименты выполняли с образцом ПХ, выдержанном в изолированном помещении. Контрольный образец 10–7 М раствора фермента в 2 мМ ФСБ-Д буфере с pH 7,4 объемом 1 мл также помещали в одноразовую полипропиленовую пробирку с раствором белка номинальным объемом 1,7 мл, которую размещали в изолированном помещении с уровнем фонового излучения, разрешенного общепринятыми санитарными нормами. После этого контрольный образец раствора фермента также передавали на спектрофотометрический анализ.
Спектрофотометрические измерения. Спектрофотометрическое определение активности фермента ПХ проводили согласно методике Sanders et al. [19], как описано в наших предыдущих публикациях [16–18]. А именно, при помощи спектрофотометра модели 8453 (Agilent Deutschland GmbH, Вальдбронн, Германия) регистрировали зависимости поглощения 10–9 М раствора ПХ от времени при длине волны 405 нм в течение 5 мин. Измерения проводили в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см (Agilent Deutschland GmbH, Вальдбронн, Германия). Измерения проводили в фосфатно-цитратном буфере, содержащем 51 мМ Na2HPO4, 24 мМ лимонной кислоты, pH 5 [19], в который также был предварительно добавлен субстрат АБТС в концентрации 0,3 мМ. Для проведения измерений 30 мкл 0,1 мкМ (10–7 М) исследуемого раствора ПХ добавляли в кварцевую кювету, содержащую 2,95 мл вышеописанного буфера, содержащего субстрат АБТС, и тщательно перемешивали. Затем в кювету добавляли 8 мкл 3% (масс./масс.) раствора пероксида водорода и сразу же начинали регистрацию зависимости поглощения раствора в кювете при длине волны 405 нм от времени.
Ферментативную активность ПХ в реакции окисления субстрата АБТС рассчитывали по данным спектрофотометрических измерений согласно методике фирмы-производителя фермента и субстрата (Sigma) [20].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Эксперименты проводили в два этапа. На первом этапе проводили облучение раствора фермента ПХ в электронном ускорителе. Доза поглощенного этим раствором излучения составила 25 кГр. Контрольный образец раствора фермента выдерживали при это в изолированном помещении, исключая его облучение. На втором этапе определяли активность фермента в облученном и в контрольном образцах раствора фермента методом спектрофотометрии исходя из зависимости скорости наработки продукта в ходе реакции окисления субстрата АБТС, катализируемой ПХ. С этой целью проводили мониторинг наработки продукта реакции от времени в течение 5 мин. В процессе этой ферментативной реакции поглощение раствора, содержащего наработанный в течение 5 мин продукт реакции, при длине волны 405 нм и длине оптического пути 1 см составило Аконтр = 2,0 и Аоблуч = 0,06 в случае контрольного и облученного дозой 25 кГр образцов фермента, соответственно. Соответственно, активность фермента ПХ по отношению к его субстрату АБТС в контрольном и облученном образцах составила 111,67 ед./мл и 3,35 ед/мл, уменьшившись в результате облучения в 33 раза.
Полученные нами данные согласуются с данными, полученными ранее Liu et al. [21]. Эти авторы исследовали воздействие облучения электронным пучком на активность ферментов цианобактерий Microcystis aeruginosa, обнаружили ~10-кратное снижение активности пероксидазы Microcystis aeruginosa после облучения электронным пучком c энергией лишь 1 МэВ при дозах облучения даже 5 кГр. В нашем же случае, энергия пучка была в 10 раз выше, а доза облучения – в 5 раз выше, чем в экспериментах Liu et al. [21], что приводило к еще более сильной дезактивации фермента пероксидазы. В нашей работе были проведены исследования по влиянию облучения электронным пучком с энергией ~ 10 МэВ на фермент ПХ. Для этого использовался спектрофотометрический метод контроля активности фермента ПХ. Исходя из спектрофотометрических данных получено, что активность фермента без воздействия облучения была в 33 раза выше, чем после воздействия облучения дозой 25 кГр. Известно, что активность фермента связана с его пространственной структурой, включая структуру его активного центра [11].
Соответственно, представленные данные означают, что при дозе облучения порядка 25 кГр наблюдается разрушение структуры фермента, включая его активный центр.
ВЫВОДЫ
Было проведено исследование влияния ускоренных электронов c энергией ~10 МэВ на фермент ПХ. Было получено, что при такой дозе облучения наблюдается практически полная инактивация фермента, что указывает на разрушение его структуры. Полученные результаты важны для корректной оценки влияния ускоренных электронов на ферменты при стерилизации продуктов питания и других материалов в установках на базе ускорителей электронов. Также результаты нашей работы следует учитывать для создания безопасных условий работы персонала.
БЛАГОДАРНОСТИ
Спектрофотометрические измерения выполнены в рамах Программы фундаментальных научных исследований в Российской Федерации на долгосрочный период (2021–2030 годы) (№ 122030100168-2). Облучение фермента в электронном ускорителе выполнено при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение № 075-00270-24-00).
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Luo Z., Chang G., Liu Y., Ni K., Zhou T., Lv X., Yu J., Bai J., Wang X. Inactivation of suspended cells and biofilms of the gram-negative bacteria by electron beam irradiation and possible mechanisms of action. LWT Food Sci Technol 2022. Vol. 172. P. 114171. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2022.114171
Predmore A., Sanglay G.C., DiCaprio E., Li J., Uribe R.M., Lee K. Electron beam inactivation of Tulane virus on fresh produce, and mechanism of inactivation of human norovirus surrogates by electron beam irradiation. Int J Food Microbiol 2015. Vol. 198. PP. 28–36. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2014.12.024
Espinosa A.C., Jesudhasan P., Arredondo R., Cepeda M., Mazari-Hiriart M., Mena K.D., Pillai S.D. Quantifying the Reduction in Potential Health Risks by Determining the Sensitivity of Poliovirus Type 1 Chat Strain and Rotavirus SA-11 to Electron Beam Irradiation of Iceberg Lettuce and Spinach. Appl Environmental Biol. 2012. Vol. 78(4). PP. 988–993. https://doi.org/10.1128/AEM.06927-11
Lung H., Cheng Y., Chang Y., Huang H., Yang B.B., Wang C. Microbial decontamination of food by electron beam irradiation. Trends Food Sci Technol. 2015. Vol. 44. PP. 66–78. https://doi.org/10.1016/j.tifs.2015.03.005
Tahergorabi R., Matak K.E., Jaczynski J. Application of electron beam to inactivate Salmonella in food: Recent developments. Food Res Intl. 2012. Vol. 45. PP. 685–694. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2011.02.003
Grasso E.M., Uribe-Rendon R.M., Lee K. Inactivation of Escherichia coli Inoculated onto Fresh-Cut Chopped Cabbage Using Electron-Beam Processing. J Food Protection. 2011. Vol. 74(1). PP. 115–118. https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-10-281
Gotzmann G., Portillo J., Wronski S., Kohl Y., Gorjup E., Schuck H., Rögner F.H., Müller M., Chaberny I.F., Schönfelder J., Wetzel G. Low-energy electron-beam treatment as alternative for on-site sterilization of highly functionalized medical products A feasibility study. Radiation Phys Chem. 2018. Vol. 150. PP. 9–19. https://doi.org/10.1016/j.radphyschem.2018.04.008
Abs M., Jongen Y., Poncelet E., Bol J. The IBA rhodotron TT1000: a very high power E-beam accelerator. Radiation Phys Chem. 2004. Vol. 71. PP. 285–288. https://doi.org/10.1016/j.radphyschem.2004.03.061
Cherkashina N.I., Pavlenko V.I., Abrosimov V.M., Gavrish V.M., Trofimov V.I., Budnik S.V., Churyukin R.S. Effect of 10 MeV electron irradiation on polyimide composites for space systems, Acta Astronautica. 2021. Vol. 184. PP. 59–69. https://doi.org/10.1016/j.actaastro.2021.03.032
Hutchinson F. Chemical changes induced in DNA by ionizing radiation. Progress in Nucleic Acid Res Mol Biol. 1985. Vol. 32. PP. 115–154. https://doi.org/10.1016/S0079-6603(08)60347-5
Metzler D.E. Biochemistry, the Chemical Reactions of Living Cells, 1st ed.; Academic Press: Cambridge, UK, 1977.
Veitch N.C. Horseradish peroxidase : a modern view of a classic enzyme. Phytochemistry. 2004. Vol. 65(3). PP. 249–259. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2003.10.022
Welinder K.G. Amino acid sequence studies of horseradish peroxidase, Amino and carboxyl termini, cyanogen bromide and tryptic frag-ments, the complete sequence, and some structural characteristics of horseradish peroxidase. Cent Eur J Biochem. 1979. Vol. 96. PP. 483–502. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1979.tb13061.x
Gajhede M., David J. Schuller D.J., Henriksen A., Smith A.T., Poulos T.L. Crystal structure of horseradish peroxidase C at 2.15 Å resolution / Nature Structural Biology. 1997. Vol. 4, PP. 1032–1038. https://doi.org/10.1038/nsb1297-1032
Davies P.F., Rennke H.G., Cotran R.S. Influence of molecular charge upon the endocytosis and intracellular fate of peroxidase activity in cultured arterial endothelium, J Cell Sci. 1981. Vol. 49(1). PP. 69–86. https://doi.org/10.1242/jcs.49.1.69
Ivanov Y.D., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Ivanova I.A., Valueva A.A., Tatur V.Y., Smelov M.V., Ivanova N.D., Ziborov V.S. AFM imaging of protein aggregation in studying the impact of knotted electromagnetic field on a peroxidase. Sci Rep. 2020. Vol. 10. P. 9022. https://doi.org/10.1038/s41598-020-65888-z
Ziborov V.S., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Larionov D.I., Evdokimov A.N., Tatur V.Y., Aleshko A.I., Sakharov K.Y., Dolgoborodov A.Y., Fortov V.E., Archakov A.I., Ivanov Y.D. The Impact of Fast-Rise-Time Electromagnetic Field and Pressure on the Aggregation of Peroxidase upon Its Adsorption onto Mica. Appl Sci. 2021. Vol. 11(24). P. 11677. https://doi.org/10.3390/app 112411677
Иванов Ю.Д., Шумов И.Д., Козлов А.Ф., Ершова М.О., Валуева А.А., Иванова И.А., Татур В.Ю., Лукьяница А.А., Иванова Н.Д., Неведрова Е.Д., Зиборов В.С. АСМ-исследование пост-эффекта движения глицерина в выходной части проточной системы на адсорбционные свойства белка. НАНОИНДУСТРИЯ. 2023. № 16(2). С. 106–113. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2023.16.2.106.113
Sanders S.A., Bray R.C., Smith A.T. pH-dependent properties of a mutant horseradish peroxidase isoenzyme C in which Arg38 has been replaced with lysine, Eur J Biochem. 1994. Vol. 224. PP. 1029–1037. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1994.01029.x
Электронный источник: Enzymatic Assay of Peroxidase (EC 1.11.1.7) 2,20-Azino-Bis(3-Ethylbenzthiazoline-6-Sulfonic Acid) as a Substrate Sigma Prod. No. P-6782. Available online: https://www.sigmaaldrich.com/RU/en/technical-documents/protocol/protein-biology/enzymeactivity-assays/enzymatic-assay-of-peroxidase-abts-as-substrate (дата обращения 18 February 2022).
Liu S., Zhao Y., Jiang W., Wu M., Ma F. Inactivation of Microcystis aeruginosa by Electron Beam Irradiation. Water Air Soil Pollut. 2014. Vol. 225. P. 2093. https://doi.org/10.1007/s11270-014-2093-8
Отзывы читателей
