eng
Выпуск #5/2024
А.И.Ахметова, Н.А.Никитин, М.В.Архипенко, О.В.Карпова, И.В.Яминский
ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ВИРУСА ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ МЕТОДАМИ АТОМНО-СИЛОВОЙ И ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ
ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ВИРУСА ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ МЕТОДАМИ АТОМНО-СИЛОВОЙ И ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ
Просмотры: 1518
DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.5.302.310
Вирусы обладают многими преимуществами перед другими типами биомолекул для синтеза наночастиц, поскольку они встречаются в широком диапазоне форм и размеров и обладают разнообразными химическими функциональными возможностями. Немаловажно, что вирусы растений безвредны для человека, в связи с чем широко используются в биотехнологиях. Вирус табачной мозаики становится интересным объектом для использования в качестве платформы и средства доставки, благодаря высокому аспектному соотношению, узкому распределению по размерам, разнообразным биохимическим функциональным группами на поверхности и совместимости путем химической конъюгации. К тому же его достаточно легко выделять, а морфологией можно манипулировать с помощью генетической модификации или термической обработки.
Вирусы обладают многими преимуществами перед другими типами биомолекул для синтеза наночастиц, поскольку они встречаются в широком диапазоне форм и размеров и обладают разнообразными химическими функциональными возможностями. Немаловажно, что вирусы растений безвредны для человека, в связи с чем широко используются в биотехнологиях. Вирус табачной мозаики становится интересным объектом для использования в качестве платформы и средства доставки, благодаря высокому аспектному соотношению, узкому распределению по размерам, разнообразным биохимическим функциональным группами на поверхности и совместимости путем химической конъюгации. К тому же его достаточно легко выделять, а морфологией можно манипулировать с помощью генетической модификации или термической обработки.
Теги: bionanoscopy physics of living systems scanning probe microscopy tobacco mosaic virus virion бионаноскопия вирион вирус табачной мозаики сканирующая зондовая микроскопия физика живых систем
Получено: 22.07.2024 г. | Принято: 26.07.2024 г. | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.5.302.310
Научная статья
ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ВИРУСА ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ МЕТОДАМИ АТОМНО-СИЛОВОЙ И ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ
А.И.Ахметова1, к.ф.-м.н., мл. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-5115-8030
Н.А.Никитин2, д.б.н., проф., ORCID: 0000-0001-9626-2336
М.В.Архипенко2, к.б.н., ст. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-5575-602X
О.В.Карпова2, д.б.н., проф., зав. каф., ORCID: 0000-0002-0605-9033
И.В.Яминский1, д.ф.-м.н., проф., ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Аннотация. Вирусы обладают многими преимуществами перед другими типами биомолекул для синтеза наночастиц, поскольку они встречаются в широком диапазоне форм и размеров и обладают разнообразными химическими функциональными возможностями. Немаловажно, что вирусы растений безвредны для человека, в связи с чем широко используются в биотехнологиях. Вирус табачной мозаики становится интересным объектом для использования в качестве платформы и средства доставки, благодаря высокому аспектному соотношению, узкому распределению по размерам, разнообразным биохимическим функциональным группами на поверхности и совместимости путем химической конъюгации. К тому же его достаточно легко выделять, а морфологией можно манипулировать с помощью генетической модификации или термической обработки.
Ключевые слова: вирус табачной мозаики, вирион, физика живых систем, сканирующая зондовая микроскопия, бионаноскопия
Для цитирования: А.И. Ахметова, Н.А. Никитин, М.В. Архипенко, О.В. Карпова, И.В. Яминский. Визуализация вируса табачной мозаики методами атомно-силовой и электронной микроскопии. НАНОИНДУСТРИЯ. 2024. Т. 17. № 5. С. 302–310. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.5.302.310.
Received: 22.07.2024 | Accepted: 26.07.2024 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.5.302.310
Original paper
VISUALIZATION OF TOBACCO MOSAIC VIRUS BY ATOMIC FORCE AND ELECTRON MICROSCOPY
A.I.Akhmetova1, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Junior Researcher, ORCID: 0000-0002-5115-8030
N.A.Nikitin2, Doct. of Sci. (Biology), Professor, ORCID: 0000-0001-9626-2336
M.V.Arkhipenko2, Cand. of Sci. (Biology), Senior Researcher, ORCID: 0000-0002-5575-602X
O.V.Karpova2, Doct. of Sci. (Biology), Head of Chair, ORCID: 0000-0002-0605-9033
I.V.Yaminsky1, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Abstract. For nanoparticle synthesis, viruses have many advantages over other types of biomolecules, as they occur in a wide range of shapes and sizes and have diverse chemical functionalities. It is important that plant viruses are harmless to humans, and therefore are widely used in biotechnology. Tobacco mosaic virus is emerging as an interesting target for use as a nanotemplate and delivery vehicle due to its high aspect ratio, narrow size distribution, diverse biochemical functionalities on the surface, and compatibility through chemical conjugation. In addition, it is quite easy to synthesize tobacco mosaic virus, and its properties can be manipulated through genetic modification or heat treatment.
Keywords: tobacco mosaic virus, virion, physics of living systems, scanning probe microscopy, bionanoscopy
For citation: A.I. Akhmetova, N.A. Nikitin, M.V. Arkhipenko, O.V. Karpova, I.V. Yaminsky. Visualization of tobacco mosaic virus by atomic force and electron microscopy. NANOINDUSTRY. 2024. Vol. 17. No. 5. PP. 302–310. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.5.302.310.
ВВЕДЕНИЕ
Растительные вирусы имеют различные формы: вирус хлоротичной крапчатости коровьего гороха, вирус мозаики коровьего гороха и вирус мозаики костра образуют икосаэдрические структуры размером от 18 до 30 нм, вирус табачной мозаики (ВТМ) и вирус штриховой мозаики ячменя имеют палочковидную форму размером до 300 нм [1]. Благодаря такому разнообразию форм растительные вирусы становятся интересным объектом в качестве платформы для разработки наноматериалов, которые можно использовать в биомедицине в качестве средства доставки, в электронике и энергетике для создания катализаторов, датчиков, анодов аккумуляторов и полупроводниковых цифровых устройств памяти.
Вирусные частицы состоят из самособирающихся капсидных белков и нуклеиновых кислот, которые кодируют вирусные белки. Капсидные белки обладают разнообразными биохимическими функциональными возможностями благодаря аминокислотным остаткам, которые могут взаимодействовать с металлами в растворе [2, 3]. Эти остатки можно конъюгировать с другими соединениями, чтобы синтезировать различные наноматериалы с новыми функциональными свойствами.
ВТМ был первым вирусом, визуализированным в электронном микроскопе. Микрофотографии ВТМ, опубликованные Густавом А. Кауше, Эдгаром Пфанкухом и Гельмутом Руской в 1939 году, продемонстрировали отдельные стержнеобразные частицы размером 330 × 15 нм [4]. Джеймс Уотсон начал изучать структуру ВТМ в 1952 году. Пока Френсис Крик заканчивал докторскую диссертацию по методам рентгеновской дифракции белков [5], Д.Уотсон пытался определить структуру ВТМ [6]. Д.Уотсон очень увлекательно описывает, как они разгадывали структуру ДНК. Он хотел заниматься исследованием ДНК, и изучение ВТМ было идеальным прикрытием, так как ключевой компонент вируса – нуклеиновая кислота. Тот факт, что в вирусе содержится РНК, а не ДНК, было даже лучше, так как разгадав РНК, можно было получить ключ к структуре ДНК. Уотсон не до конца понимал кристаллографическую теорию по собственному признанию, но догадался, что некоторые пятна дифракции рентгеновских лучей ВТМ, которые озадачивали Джона Десмонда Бернала и Исидора Фанкюхена, можно объяснить тем фактом, что ВТМ имеет спиральную конфигурацию.
Получив собственные рентгенограммы паракристаллов ВТМ, Д.Уотсон подтвердил свою догадку. Основываясь на своих новых данных, он утверждал, что ВТМ представляет собой спираль, повторяющуюся каждые три витка с периодом 68 Å. Он также предположил, что вирусная РНК находится в центре этой спирали, аналогично ее расположению в сферических вирусах: вирусе желтой мозаики репы и бактериофаге Т2 [7]. Статья Уотсона о ВТМ была представлена в журнал Biochimica et Biophysical Acta за неделю до того, как его знаменитая заметка с Криком о двухцепочечной структуре ДНК появилась в журнале Nature [8]. Таким образом, знакомство Уотсона с теорией спиральной дифракции оказалось очень полезным для понимания всего значения "Фотографии 51" Розалинды Франклин.
В настоящее время вирус табачной мозаики является одним из самых хорошо изученных модельных объектов. С помощью атомно-силовой микроскопии удается получать новые структурные данные о морфологии частиц при обычных условиях и при изменении температуры окружающей среды [9]. Форма и размеры частиц зависят от методов выделения, очистки, условий хранения образца, процедур нанесения образца на подложку и характера подложки. Ранее было показано, что подложка может влиять на вирус, вызывая частичное разрушение белковой оболочки [10].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Вирус табачной мозаики (ВТМ), штамм U1 из коллекции кафедры вирусологии МГУ был накоплен в растениях табака (Nicotiana tabacum L.) сорта Samsun. Растения N. tabacum выращивали до стадии формирования 5–6 больших листьев в теплице с дополнительным освещением (натриевые лампы высокого давления) при температуре 22–25 °С. Растения инфицировали методом механической инокуляции. В качестве инфекционного материала использовали суспензию ранее выделенного и очищенного вируса в концентрации 50 мкг/мл. Через 1–2 недели после заражения развиваются симптомы системного поражения растения: наблюдаются мозаичные симптомы в виде чередующихся светло-зеленых и темно-зеленых участков, часто сопровождаемые появлением аномалий в виде локальных вздутий, четко наблюдаемое при сравнении с контрольным здоровым растением. Листья зараженных растений собирали через три недели после заражения, фасовали и замораживали (–18 °С). ВТМ был выделен и очищен с помощью метода дифференциального центрифугирования, как описано ранее [11].
Вирусный осадок растворяли в 0,01 М трис-НС1 рН 7,8. Раствор ВТМ осветляли при помощи низкоскоростного центрифугирования при 10 000 g в течение 15 мин. Проводили отбор пробы объемом 0,05 мл для определения концентрации ВТМ и чистоты препарата.
Качество выделенного препарата ВТМ (наличие примесей, морфология и размеры частиц) контролировали методами спектрофотометрии, электрофоретического анализа и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭM). Для ПЭМ препарат ВТМ сорбировали на медных сетках для электронной микроскопии, покрытых формваром, негативно контрастировали 1% раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты и анализировали с помощью электронного микроскопа Leo 912 (Zeiss).
3D-морфология вирусных частиц исследовалась с помощью СЗМ "ФемтоСкан" на воздухе на подложках из графита и слюды в резонансном режиме, использовали кантилевер NSG10, обработка изображений осуществлялась в ПО "ФемтоСкан Онлайн" [12].
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рис.1 представлено изображение вируса, полученное с помощью ПЭМ. Характерные размеры вируса табачной мозаики – 300 нм в длину, 18 нм в высоту. На кадре присутствуют как одиночные частицы, так и частицы, выстроенные торцами друг к другу, образовывая тем самым длинные вереницы частиц до 1 мкм. Отдельные частицы имеют стержневидную форму.
На рис.2. представлен образец вируса, полученный в резонансном режиме АСМ. Несколько мкл образца нанесли на поверхность свежесколотой слюды и высушили.
На кадре присутствуют как частицы длиной в 300 нм, так и другой длины, в том числе и совсем небольшие – менее 100 нм. Также в образце присутствуют длинные частицы, когда вирусы выстраиваются друг за другом торец к торцу. Разброс в размерах частиц можно объяснить методом выделения и очистки, что приводит к появлению на поверхности слюды фрагментов и сегментов вирусов. С помощью АСМ также можно определить характер распределения частиц по поверхности – вирусы не собираются в одном месте, а стремятся разместиться на поверхности. Заниженное значение высоты в АСМ является следствием взаимодействия с подложкой.
На рис.3 показан образец вируса табачной мозаики, где почти все частицы стремятся выстроиться торец к торцу, отчего создается впечатление ветвящихся частиц. По данным гистограммы характерная высота составляет 14 нм. Изображение указывает на деградацию белковой оболочки вируса, в результате наблюдается варьирование поперечного сечения частиц ВТМ. Вследствие потери механической жесткости частицы теряют прямолинейную форму, характерную для интактных частиц. На частичное разрушение частиц указывает и наблюдаемый заниженный размер высоты.
С помощью АСМ можно получить детальные характеристики по всем объектам на кадре. Программное обеспечение "ФемтоСкан Онлайн" может автоматически выделить объекты и посчитать геометрические характеристики каждой структуры, а также сравнить распределение частиц по размерам на двух образцах.
Приведенного выше набора из восьми параметров вполне достаточно для достоверной оценки различий в приготовленных образцах.
Из данных таблицы видно, что у второго образца значения периметра, площади и объема частиц гораздо выше, при этом высота объектов и среднеквадратичная шероховатость почти не отличаются.
Интересно оценить форм-фактор – частицы во втором образцы более склонны образовывать вытянутые нитевидные структуры в отличие от первого, что может быть следствием нанесения образца и его высыхания на подложке. Также, вероятно, в процессе хранения и подготовки образца для исследования на АСМ частицы могут ломаться и менее активно выстраиваются друг за другом на подложке.
В табл.1 приведены усредненные параметры частиц для двух случаев приготовления образцов (образец №1 и 2). Частицы образца 2 более склонны к упорядоченному построению торец к торцу. На это указывают увеличенные значения параметров P, S и V для второго образца. Пропорциональное увеличение периметра и объема частиц в два раза второго образца указывает на характерную организацию друг за другом.
Образец вируса на рис.4 нагревали до 90 °C в концентрации 1 мг/мл в течение 1 мин. Существенно отличие в форме частиц от предыдущих двух образцов: все частицы как будто пытаются слиться воедино не только торец к торцу, но и бок о бок, почти не встречаются одиночные. По данным геометрических размеров объектов образца №3 видно занижение общей высоты объектов, увеличение объема объектов, при этом значения форм-факторов не отличаются от образца №2.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Исследования ВТМ внесли существенный вклад в базовые представления о вирусах, способствовали интенсивному развитию молекулярной генетики и пониманию характера протекания инфекционных заболеваний. ВТМ служил моделью для изучения таких человеческих патогенов, как грипп и полиомиелит [13, 14].
В рамках данной работы были получены данные об образцах ВТМ, частицы визуализированы с помощью АСМ и ПЭМ. Получены геометрические характеристики частиц по данным АСМ, показан разный характер адсорбции частиц на подложке из слюды в зависимости от образца, что может быть следствием пробоподготовки, условий нанесения и хранения образца ВТМ. Показано изменение формы частиц и характера расположения на слюде вследствие нагревания до 90 °C. На примере вируса табачной мозаики показаны возможности применения метода атомно-силовой микроскопии для определения морфологии и характера адсорбции вирусных частиц на подложке методом АСМ.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа выполнена в рамках Междисциплинарных научно-образовательных школ Московского университета, проект № 23-Ш04-04.
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Dubrovin E.V., Drygin Y., Novikov V.K., Yaminsky I.V. Atomic Force Microscopy as a Tool of Inspection of Viral Infection. Nanomed. Nanotechnol. Biol. Med. 2007. No. 3. PP. 128–131. https://doi.org/10.1016/j.nano.2007.01.005
Makarov V.V., Love A.J., Sinitsyna O.V., Makarova S.S., Yaminsky I.V., Taliansky M.E., Kalinina N.O. Green nanotechnologies: synthesis of metal nanoparticles using plants. Acta Naturae (на англ.). 2014. Vol. 6. No. 1. PP. 35–44.
Love A.J., Makarov V.V., Kalinina N.O., Yaminsky I.V., Taliansky M.E. The use of tobacco mosaic virus and cowpea mosaic virus for the production of novel metal nanomaterials. Virology. 2014. Vol. 449. PP. 133–139. https://doi.org/10.1016/j.virol.2013.11.002
Kausche G.A., Pfannkuch E., Ruska H. Die Sichtbarmachung von pflanzlichem Virus im Übermikroskop. Naturwissenschaften. 1939. Vol. 27. PP. 292–98.
Olby R.C. Francis Crick: Hunter of Life’s Secrets Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harb. Lab. 2009.
Watson J.D. The Double Helix: A Personal Account of the Discovery of the Structure of DNA. 1968. New York: Atheneum.
Watson J.D. 1954. The structure of tobacco mosaic virus: I. X-ray evidence of a helical arrangement of sub-units around the longitudinal axis. Biochim. Biophys. Acta. 1954. Vol. 13. PP. 10–19. https://doi.org/10.1016/0006-3002(54)90265-6
Watson J.D., Crick F.H.C. A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature. 1953. Vol. 171. PP. 737–38. https://doi.org/10.1038/171737a0
Akhmetova A.I., Nikitin N.A., Archipenko M.V., Karpova O.V., Yaminsky I.V. 3. D visualization and characterization of plant viruses using bionanoscopy methods. NANOINDUSTRY. 2023. Vol. 16(6). PP. 338–344. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2023.16.6.338.344
Dubrovin E.V., Kirikova M.N., Novikov V.K., Drygin Y.F., Yaminsky I.V. Study of the peculiarities of adhesion of tobacco mosaic virus by atomic force microscopy. Colloid J. 2004. Vol. 66. PP. 673-678. https://doi.org/10.1007/s10595-005-0048-x
Trifonova E.A., Nikitin N.A., Kirpichnikov M.P., Karpova O.V., Atabekov I.G. Method for obtaining and characterizing spherical particles – new biogenic platforms. Bulletin of Moscow University. Series 16: Biology. 2015. Vol. 4. PP. 46–50.
Akhmetova A.I., Yaminsky I.V. FemtoScan Online software in virus research. NANOINDUSTRY. 2021. Vol. 14. No. 1 (103). PP. 62–67. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2021.14.1.62.67
Creager A.N.H. The Life of a Virus: Tobacco Mosaic Virus as an Experimental Model, 1930–1965. Chicago: Univ. Chicago Press. 2002.
Creager A.N.H. Paradigms and exemplars meet biomedicine. In Kuhn’s Structure of Scientific Revolutions at Fifty: Reflections on a Science Classic. Ed. R.J. Richards L. Daston. 2016. Chicago: Univ. Chicago Press. PP. 151–66.
Научная статья
ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ВИРУСА ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ МЕТОДАМИ АТОМНО-СИЛОВОЙ И ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ
А.И.Ахметова1, к.ф.-м.н., мл. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-5115-8030
Н.А.Никитин2, д.б.н., проф., ORCID: 0000-0001-9626-2336
М.В.Архипенко2, к.б.н., ст. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-5575-602X
О.В.Карпова2, д.б.н., проф., зав. каф., ORCID: 0000-0002-0605-9033
И.В.Яминский1, д.ф.-м.н., проф., ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Аннотация. Вирусы обладают многими преимуществами перед другими типами биомолекул для синтеза наночастиц, поскольку они встречаются в широком диапазоне форм и размеров и обладают разнообразными химическими функциональными возможностями. Немаловажно, что вирусы растений безвредны для человека, в связи с чем широко используются в биотехнологиях. Вирус табачной мозаики становится интересным объектом для использования в качестве платформы и средства доставки, благодаря высокому аспектному соотношению, узкому распределению по размерам, разнообразным биохимическим функциональным группами на поверхности и совместимости путем химической конъюгации. К тому же его достаточно легко выделять, а морфологией можно манипулировать с помощью генетической модификации или термической обработки.
Ключевые слова: вирус табачной мозаики, вирион, физика живых систем, сканирующая зондовая микроскопия, бионаноскопия
Для цитирования: А.И. Ахметова, Н.А. Никитин, М.В. Архипенко, О.В. Карпова, И.В. Яминский. Визуализация вируса табачной мозаики методами атомно-силовой и электронной микроскопии. НАНОИНДУСТРИЯ. 2024. Т. 17. № 5. С. 302–310. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.5.302.310.
Received: 22.07.2024 | Accepted: 26.07.2024 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.5.302.310
Original paper
VISUALIZATION OF TOBACCO MOSAIC VIRUS BY ATOMIC FORCE AND ELECTRON MICROSCOPY
A.I.Akhmetova1, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Junior Researcher, ORCID: 0000-0002-5115-8030
N.A.Nikitin2, Doct. of Sci. (Biology), Professor, ORCID: 0000-0001-9626-2336
M.V.Arkhipenko2, Cand. of Sci. (Biology), Senior Researcher, ORCID: 0000-0002-5575-602X
O.V.Karpova2, Doct. of Sci. (Biology), Head of Chair, ORCID: 0000-0002-0605-9033
I.V.Yaminsky1, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Abstract. For nanoparticle synthesis, viruses have many advantages over other types of biomolecules, as they occur in a wide range of shapes and sizes and have diverse chemical functionalities. It is important that plant viruses are harmless to humans, and therefore are widely used in biotechnology. Tobacco mosaic virus is emerging as an interesting target for use as a nanotemplate and delivery vehicle due to its high aspect ratio, narrow size distribution, diverse biochemical functionalities on the surface, and compatibility through chemical conjugation. In addition, it is quite easy to synthesize tobacco mosaic virus, and its properties can be manipulated through genetic modification or heat treatment.
Keywords: tobacco mosaic virus, virion, physics of living systems, scanning probe microscopy, bionanoscopy
For citation: A.I. Akhmetova, N.A. Nikitin, M.V. Arkhipenko, O.V. Karpova, I.V. Yaminsky. Visualization of tobacco mosaic virus by atomic force and electron microscopy. NANOINDUSTRY. 2024. Vol. 17. No. 5. PP. 302–310. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.5.302.310.
ВВЕДЕНИЕ
Растительные вирусы имеют различные формы: вирус хлоротичной крапчатости коровьего гороха, вирус мозаики коровьего гороха и вирус мозаики костра образуют икосаэдрические структуры размером от 18 до 30 нм, вирус табачной мозаики (ВТМ) и вирус штриховой мозаики ячменя имеют палочковидную форму размером до 300 нм [1]. Благодаря такому разнообразию форм растительные вирусы становятся интересным объектом в качестве платформы для разработки наноматериалов, которые можно использовать в биомедицине в качестве средства доставки, в электронике и энергетике для создания катализаторов, датчиков, анодов аккумуляторов и полупроводниковых цифровых устройств памяти.
Вирусные частицы состоят из самособирающихся капсидных белков и нуклеиновых кислот, которые кодируют вирусные белки. Капсидные белки обладают разнообразными биохимическими функциональными возможностями благодаря аминокислотным остаткам, которые могут взаимодействовать с металлами в растворе [2, 3]. Эти остатки можно конъюгировать с другими соединениями, чтобы синтезировать различные наноматериалы с новыми функциональными свойствами.
ВТМ был первым вирусом, визуализированным в электронном микроскопе. Микрофотографии ВТМ, опубликованные Густавом А. Кауше, Эдгаром Пфанкухом и Гельмутом Руской в 1939 году, продемонстрировали отдельные стержнеобразные частицы размером 330 × 15 нм [4]. Джеймс Уотсон начал изучать структуру ВТМ в 1952 году. Пока Френсис Крик заканчивал докторскую диссертацию по методам рентгеновской дифракции белков [5], Д.Уотсон пытался определить структуру ВТМ [6]. Д.Уотсон очень увлекательно описывает, как они разгадывали структуру ДНК. Он хотел заниматься исследованием ДНК, и изучение ВТМ было идеальным прикрытием, так как ключевой компонент вируса – нуклеиновая кислота. Тот факт, что в вирусе содержится РНК, а не ДНК, было даже лучше, так как разгадав РНК, можно было получить ключ к структуре ДНК. Уотсон не до конца понимал кристаллографическую теорию по собственному признанию, но догадался, что некоторые пятна дифракции рентгеновских лучей ВТМ, которые озадачивали Джона Десмонда Бернала и Исидора Фанкюхена, можно объяснить тем фактом, что ВТМ имеет спиральную конфигурацию.
Получив собственные рентгенограммы паракристаллов ВТМ, Д.Уотсон подтвердил свою догадку. Основываясь на своих новых данных, он утверждал, что ВТМ представляет собой спираль, повторяющуюся каждые три витка с периодом 68 Å. Он также предположил, что вирусная РНК находится в центре этой спирали, аналогично ее расположению в сферических вирусах: вирусе желтой мозаики репы и бактериофаге Т2 [7]. Статья Уотсона о ВТМ была представлена в журнал Biochimica et Biophysical Acta за неделю до того, как его знаменитая заметка с Криком о двухцепочечной структуре ДНК появилась в журнале Nature [8]. Таким образом, знакомство Уотсона с теорией спиральной дифракции оказалось очень полезным для понимания всего значения "Фотографии 51" Розалинды Франклин.
В настоящее время вирус табачной мозаики является одним из самых хорошо изученных модельных объектов. С помощью атомно-силовой микроскопии удается получать новые структурные данные о морфологии частиц при обычных условиях и при изменении температуры окружающей среды [9]. Форма и размеры частиц зависят от методов выделения, очистки, условий хранения образца, процедур нанесения образца на подложку и характера подложки. Ранее было показано, что подложка может влиять на вирус, вызывая частичное разрушение белковой оболочки [10].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Вирус табачной мозаики (ВТМ), штамм U1 из коллекции кафедры вирусологии МГУ был накоплен в растениях табака (Nicotiana tabacum L.) сорта Samsun. Растения N. tabacum выращивали до стадии формирования 5–6 больших листьев в теплице с дополнительным освещением (натриевые лампы высокого давления) при температуре 22–25 °С. Растения инфицировали методом механической инокуляции. В качестве инфекционного материала использовали суспензию ранее выделенного и очищенного вируса в концентрации 50 мкг/мл. Через 1–2 недели после заражения развиваются симптомы системного поражения растения: наблюдаются мозаичные симптомы в виде чередующихся светло-зеленых и темно-зеленых участков, часто сопровождаемые появлением аномалий в виде локальных вздутий, четко наблюдаемое при сравнении с контрольным здоровым растением. Листья зараженных растений собирали через три недели после заражения, фасовали и замораживали (–18 °С). ВТМ был выделен и очищен с помощью метода дифференциального центрифугирования, как описано ранее [11].
Вирусный осадок растворяли в 0,01 М трис-НС1 рН 7,8. Раствор ВТМ осветляли при помощи низкоскоростного центрифугирования при 10 000 g в течение 15 мин. Проводили отбор пробы объемом 0,05 мл для определения концентрации ВТМ и чистоты препарата.
Качество выделенного препарата ВТМ (наличие примесей, морфология и размеры частиц) контролировали методами спектрофотометрии, электрофоретического анализа и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭM). Для ПЭМ препарат ВТМ сорбировали на медных сетках для электронной микроскопии, покрытых формваром, негативно контрастировали 1% раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты и анализировали с помощью электронного микроскопа Leo 912 (Zeiss).
3D-морфология вирусных частиц исследовалась с помощью СЗМ "ФемтоСкан" на воздухе на подложках из графита и слюды в резонансном режиме, использовали кантилевер NSG10, обработка изображений осуществлялась в ПО "ФемтоСкан Онлайн" [12].
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рис.1 представлено изображение вируса, полученное с помощью ПЭМ. Характерные размеры вируса табачной мозаики – 300 нм в длину, 18 нм в высоту. На кадре присутствуют как одиночные частицы, так и частицы, выстроенные торцами друг к другу, образовывая тем самым длинные вереницы частиц до 1 мкм. Отдельные частицы имеют стержневидную форму.
На рис.2. представлен образец вируса, полученный в резонансном режиме АСМ. Несколько мкл образца нанесли на поверхность свежесколотой слюды и высушили.
На кадре присутствуют как частицы длиной в 300 нм, так и другой длины, в том числе и совсем небольшие – менее 100 нм. Также в образце присутствуют длинные частицы, когда вирусы выстраиваются друг за другом торец к торцу. Разброс в размерах частиц можно объяснить методом выделения и очистки, что приводит к появлению на поверхности слюды фрагментов и сегментов вирусов. С помощью АСМ также можно определить характер распределения частиц по поверхности – вирусы не собираются в одном месте, а стремятся разместиться на поверхности. Заниженное значение высоты в АСМ является следствием взаимодействия с подложкой.
На рис.3 показан образец вируса табачной мозаики, где почти все частицы стремятся выстроиться торец к торцу, отчего создается впечатление ветвящихся частиц. По данным гистограммы характерная высота составляет 14 нм. Изображение указывает на деградацию белковой оболочки вируса, в результате наблюдается варьирование поперечного сечения частиц ВТМ. Вследствие потери механической жесткости частицы теряют прямолинейную форму, характерную для интактных частиц. На частичное разрушение частиц указывает и наблюдаемый заниженный размер высоты.
С помощью АСМ можно получить детальные характеристики по всем объектам на кадре. Программное обеспечение "ФемтоСкан Онлайн" может автоматически выделить объекты и посчитать геометрические характеристики каждой структуры, а также сравнить распределение частиц по размерам на двух образцах.
- P – периметр;
- S – площадь;
- V – объем;
- RMS – среднеквадратичное значение высоты объекта (шероховатость);
- форм-фактор 1 – отношение радиуса окружности эквивалентной площади к радиусу окружности эквивалентного периметра. Для круглого объекта этот форм-фактор равен единице. Чем сильнее изрезан периметр объекта, тем ближе его значение к нулю;
- форм-фактор 2 – отношение удвоенной протяженности объекта к его периметру. Для тонкой нити это отношение равно единице, для окружности оно равно нулю;
- H – максимальная высота объекта;
- <H> – средняя высота объекта.
Приведенного выше набора из восьми параметров вполне достаточно для достоверной оценки различий в приготовленных образцах.
Из данных таблицы видно, что у второго образца значения периметра, площади и объема частиц гораздо выше, при этом высота объектов и среднеквадратичная шероховатость почти не отличаются.
Интересно оценить форм-фактор – частицы во втором образцы более склонны образовывать вытянутые нитевидные структуры в отличие от первого, что может быть следствием нанесения образца и его высыхания на подложке. Также, вероятно, в процессе хранения и подготовки образца для исследования на АСМ частицы могут ломаться и менее активно выстраиваются друг за другом на подложке.
В табл.1 приведены усредненные параметры частиц для двух случаев приготовления образцов (образец №1 и 2). Частицы образца 2 более склонны к упорядоченному построению торец к торцу. На это указывают увеличенные значения параметров P, S и V для второго образца. Пропорциональное увеличение периметра и объема частиц в два раза второго образца указывает на характерную организацию друг за другом.
Образец вируса на рис.4 нагревали до 90 °C в концентрации 1 мг/мл в течение 1 мин. Существенно отличие в форме частиц от предыдущих двух образцов: все частицы как будто пытаются слиться воедино не только торец к торцу, но и бок о бок, почти не встречаются одиночные. По данным геометрических размеров объектов образца №3 видно занижение общей высоты объектов, увеличение объема объектов, при этом значения форм-факторов не отличаются от образца №2.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Исследования ВТМ внесли существенный вклад в базовые представления о вирусах, способствовали интенсивному развитию молекулярной генетики и пониманию характера протекания инфекционных заболеваний. ВТМ служил моделью для изучения таких человеческих патогенов, как грипп и полиомиелит [13, 14].
В рамках данной работы были получены данные об образцах ВТМ, частицы визуализированы с помощью АСМ и ПЭМ. Получены геометрические характеристики частиц по данным АСМ, показан разный характер адсорбции частиц на подложке из слюды в зависимости от образца, что может быть следствием пробоподготовки, условий нанесения и хранения образца ВТМ. Показано изменение формы частиц и характера расположения на слюде вследствие нагревания до 90 °C. На примере вируса табачной мозаики показаны возможности применения метода атомно-силовой микроскопии для определения морфологии и характера адсорбции вирусных частиц на подложке методом АСМ.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа выполнена в рамках Междисциплинарных научно-образовательных школ Московского университета, проект № 23-Ш04-04.
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Dubrovin E.V., Drygin Y., Novikov V.K., Yaminsky I.V. Atomic Force Microscopy as a Tool of Inspection of Viral Infection. Nanomed. Nanotechnol. Biol. Med. 2007. No. 3. PP. 128–131. https://doi.org/10.1016/j.nano.2007.01.005
Makarov V.V., Love A.J., Sinitsyna O.V., Makarova S.S., Yaminsky I.V., Taliansky M.E., Kalinina N.O. Green nanotechnologies: synthesis of metal nanoparticles using plants. Acta Naturae (на англ.). 2014. Vol. 6. No. 1. PP. 35–44.
Love A.J., Makarov V.V., Kalinina N.O., Yaminsky I.V., Taliansky M.E. The use of tobacco mosaic virus and cowpea mosaic virus for the production of novel metal nanomaterials. Virology. 2014. Vol. 449. PP. 133–139. https://doi.org/10.1016/j.virol.2013.11.002
Kausche G.A., Pfannkuch E., Ruska H. Die Sichtbarmachung von pflanzlichem Virus im Übermikroskop. Naturwissenschaften. 1939. Vol. 27. PP. 292–98.
Olby R.C. Francis Crick: Hunter of Life’s Secrets Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harb. Lab. 2009.
Watson J.D. The Double Helix: A Personal Account of the Discovery of the Structure of DNA. 1968. New York: Atheneum.
Watson J.D. 1954. The structure of tobacco mosaic virus: I. X-ray evidence of a helical arrangement of sub-units around the longitudinal axis. Biochim. Biophys. Acta. 1954. Vol. 13. PP. 10–19. https://doi.org/10.1016/0006-3002(54)90265-6
Watson J.D., Crick F.H.C. A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature. 1953. Vol. 171. PP. 737–38. https://doi.org/10.1038/171737a0
Akhmetova A.I., Nikitin N.A., Archipenko M.V., Karpova O.V., Yaminsky I.V. 3. D visualization and characterization of plant viruses using bionanoscopy methods. NANOINDUSTRY. 2023. Vol. 16(6). PP. 338–344. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2023.16.6.338.344
Dubrovin E.V., Kirikova M.N., Novikov V.K., Drygin Y.F., Yaminsky I.V. Study of the peculiarities of adhesion of tobacco mosaic virus by atomic force microscopy. Colloid J. 2004. Vol. 66. PP. 673-678. https://doi.org/10.1007/s10595-005-0048-x
Trifonova E.A., Nikitin N.A., Kirpichnikov M.P., Karpova O.V., Atabekov I.G. Method for obtaining and characterizing spherical particles – new biogenic platforms. Bulletin of Moscow University. Series 16: Biology. 2015. Vol. 4. PP. 46–50.
Akhmetova A.I., Yaminsky I.V. FemtoScan Online software in virus research. NANOINDUSTRY. 2021. Vol. 14. No. 1 (103). PP. 62–67. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2021.14.1.62.67
Creager A.N.H. The Life of a Virus: Tobacco Mosaic Virus as an Experimental Model, 1930–1965. Chicago: Univ. Chicago Press. 2002.
Creager A.N.H. Paradigms and exemplars meet biomedicine. In Kuhn’s Structure of Scientific Revolutions at Fifty: Reflections on a Science Classic. Ed. R.J. Richards L. Daston. 2016. Chicago: Univ. Chicago Press. PP. 151–66.
Отзывы читателей
