eng
Выпуск #7-8/2024
А.И.Ахметова, Т.О.Советников, А.Д.Терентьев, И.В.Яминский
СКАНИРУЮЩАЯ КАПИЛЛЯРНАЯ МИКРОСКОПИЯ КАК СРЕДСТВО НАНОКАПИЛЛЯРНОЙ ПЕЧАТИ
СКАНИРУЮЩАЯ КАПИЛЛЯРНАЯ МИКРОСКОПИЯ КАК СРЕДСТВО НАНОКАПИЛЛЯРНОЙ ПЕЧАТИ
Просмотры: 1865
DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.7-8.418.425
Контролируемое манипулирование культивируемыми клетками и локальная доставка макромолекул и веществ являются до сих пор нерешенными задачами экспериментальной биологии. Внутриклеточное введение различных терапевтических средств, включая биологические препараты и супрамолекулярные агенты, сложно реализуема из-за естественных биологических барьеров, необходимых для защиты клетки. Эффективная доставка нуклеиновых кислот, белков, пептидов и наночастиц имеет решающее значение для клинического внедрения новых технологий, которые могут принести пользу лечению заболеваний с помощью генной и клеточной терапии. Используя капилляр, можно локально нанести на клетку требующееся вещество или даже ввести его внутрь клетки, а в дальнейшем оценить его влияние на морфологию с помощью инструментов сканирующей капиллярной микроскопии (СКМ). Эти возможности делают метод капиллярной микроскопии перспективным для целей биомедицины.
Контролируемое манипулирование культивируемыми клетками и локальная доставка макромолекул и веществ являются до сих пор нерешенными задачами экспериментальной биологии. Внутриклеточное введение различных терапевтических средств, включая биологические препараты и супрамолекулярные агенты, сложно реализуема из-за естественных биологических барьеров, необходимых для защиты клетки. Эффективная доставка нуклеиновых кислот, белков, пептидов и наночастиц имеет решающее значение для клинического внедрения новых технологий, которые могут принести пользу лечению заболеваний с помощью генной и клеточной терапии. Используя капилляр, можно локально нанести на клетку требующееся вещество или даже ввести его внутрь клетки, а в дальнейшем оценить его влияние на морфологию с помощью инструментов сканирующей капиллярной микроскопии (СКМ). Эти возможности делают метод капиллярной микроскопии перспективным для целей биомедицины.
Теги: living systems local substance delivery microdosing nanoparticles scanning capillary microscopy живые системы локальная доставка вещества микродозирование наночастицы сканирующая капиллярная микроскопия
Получено: 28.10.2024 г. | Принято: 31.10.2024 г. | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.7-8.418.425
Научная статья
СКАНИРУЮЩАЯ КАПИЛЛЯРНАЯ МИКРОСКОПИЯ КАК СРЕДСТВО НАНОКАПИЛЛЯРНОЙ ПЕЧАТИ
А.И.Ахметова1, 2, к.ф.-м.н., науч. сотр., ORCID: 0000-0002-5115-8030
Т.О.Советников1, 2, асп., вед. инж., ORCID: 0000-0001-6541-8932
А.Д.Терентьев1, 2, асп., прогр., ORCID: 0009-0009-1528-5284
И.В.Яминский1, 2, д.ф.-м.н., проф., ген. дир., ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Аннотация. Контролируемое манипулирование культивируемыми клетками и локальная доставка макромолекул и веществ являются до сих пор нерешенными задачами экспериментальной биологии. Внутриклеточное введение различных терапевтических средств, включая биологические препараты и супрамолекулярные агенты, сложно реализуема из-за естественных биологических барьеров, необходимых для защиты клетки. Эффективная доставка нуклеиновых кислот, белков, пептидов и наночастиц имеет решающее значение для клинического внедрения новых технологий, которые могут принести пользу лечению заболеваний с помощью генной и клеточной терапии. Используя капилляр, можно локально нанести на клетку требующееся вещество или даже ввести его внутрь клетки, а в дальнейшем оценить его влияние на морфологию с помощью инструментов сканирующей капиллярной микроскопии (СКМ). Эти возможности делают метод капиллярной микроскопии перспективным для целей биомедицины.
Ключевые слова: сканирующая капиллярная микроскопия, живые системы, микродозирование, локальная доставка вещества, наночастицы
Для цитирования: А.И. Ахметова, Т.О. Советников, А.Д. Терентьев, И.В. Яминский. Сканирующая капиллярная микроскопия как средство нанокапиллярной печати. НАНОИНДУСТРИЯ. 2024. Т. 17. № 7–8. С. 418–425. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.7-8.418.425.
Received: 28.10.2024 | Accepted: 31.10.2024 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.7-8.418.425
Original paper
SCANNING CAPILLARY MICROSCOPY AS A TOOL FOR NANOCAPILLARY PRINTING
A.I.Akhmetova1, 2, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Researcher, ORCID: 0000-0002-5115-8030
T.O.Sovetnikov1, 2, Postgraduate, Engineer, Leading Engineer, ORCID: 0000-0001-6541-8932
A.D.Terentev1, 2, Postgraduate, Programmer, ORCID: 0009-0009-1528-5284
I.V.Yaminsky1, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Prof., Director General,
ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Abstract. Controlled manipulation of cultured cells and local delivery of macromolecules and substances are still unsolved problems in experimental biology. Intracellular injection of various therapeutic agents, including biologics and supramolecular agents, is difficult due to natural biological barriers required to protect the cell. Efficient delivery of nucleic acids, proteins, peptides and nanoparticles is critical for clinical implementation of new technologies that can benefit the treatment of diseases using gene and cell therapy. Using a capillary, it is possible to locally apply a desired substance to a cell or even introduce it into the cell, and then evaluate its effect on morphology using scanning capillary microscopy (SCM) tools. These capabilities make the capillary microscopy method promising for biomedical purposes.
Keywords: scanning capillary microscopy, living systems, microdosing, local substance delivery, nanoparticles
For citation: A.I. Akhmetova, T.O. Sovetnikov, A.D. Terentev, I.V. Yaminsky. Scanning capillary microscopy as a tool for nanocapillary printing. NANOINDUSTRY. 2024. Vol. 17. No. 7–8. PP. 418–425. https://doi.org/
10.22184/1993-8578.2024.17.7-8.418.425.
ВВЕДЕНИЕ
Клетка наделена динамичным механизмом, доступ к которому строго регулируется внутриклеточными процессами. Клетки передают информацию друг другу через молекулы, ДНК кодирует РНК и белки, белки передают сигналы и действуют как строительные блоки клеточной структуры, липиды образуют мембрану и хранят энергию. Традиционные методы доставки веществ могут нарушать функции клеток, что ограничивает их применимость. Введение молекул и веществ в клетку является важным экспериментальным шагом в понимании ее функции, в управлении клеткой и перепрограммировании ее поведения.
Существуют разные способы доставки веществ в клетки млекопитающих: с помощью липидных везикул и вирусоподобных частиц, путем химической трансфекции, электропорации и микро- и наноинъекций.
Наноинъекция – это процесс внутриклеточной доставки с использованием наноигл [1–3]. Наноиглы, как правило, не вредны для клеток, в том числе для нейронов, кардиомиоцитов и иммунных клеток [4–6]. Наноинъекция повышает эффективность трансфекции плазмидной ДНК (пДНК) в труднотрансфицируемых клетках [7].
Для инъекций можно использовать не только наноиглы, но и стеклянные капилляры с диаметром выходного отверстия микронного размера для механического проникновения через плазматическую мембрану, что также позволяет доставлять молекулы. Однако большой размер кончика капилляра (обычно от 0,5 до 75 мкм по внешнему диаметру) относительно размера клетки может деформировать мембрану во время инъекции, нарушая актиновый цитоскелет и изменяя морфологию клетки.
С помощью пуллера (например, P2000, Sutter Instruments) можно изготовить капилляры с минимальным радиусом выходного отверстия – до 10 нм. С помощью электрода, помещенного в капилляр, можно контролировать транспорт молекул приложением подходящего напряжения и измерением ионного тока. Полярность и величина напряжения зависят от заряда доставляемой молекулы, причем величина напряжения не должна превышать ±1 В [8, 9]. Более того, малый размер кончика капилляра относительно клетки позволяет не деформировать клеточную мембрану. Транслокация одной макромолекулы через кончик капилляра приводит к обнаруживаемому изменению измеряемого ионного тока, который можно использовать для характеристики и количественной оценки числа молекул, проходящих через капилляр [10, 11].
В работе [12] описывается платформа, которая использует капилляры для доставки определенного количества макромолекул в культивируемые клеточные линии и первичные клетки с разрешением на уровне одной молекулы. Капилляр используется и как зонд сканирующего капиллярного микроскопа, и как игла для инъекции. С помощью СКМ осуществляется позиционирование над поверхностью клетки перед тем, как капилляр будет введен на заданную глубину в определенное место клетки. С помощью этой установки показана количественная доставка ДНК, глобулярных белков и белковых фибрилл в клетки с разрешением на уровне одной молекулы. А также продемонстрировано, что доставка приводит к изменению фенотипа клетки.
Также известны результаты по применению сканирующей капиллярной микроскопии для локальной доставки наночастиц [13, 14]. В этой связи встает вопрос подсчета их числа, прошедшего через отверстия нанокапилляра. Такой подход позволит проводить не только локальную, но и высокоточную доставку наночастиц к поверхности клетки.
В рамках разработки нанокапиллярной печати нашей группой выработана методика подсчета числа осаждаемых частиц. Метод состоит в подборе отверстия капилляра, соразмерного доставляемым (осаждаемым) частицам, при этом выход наночастицы из капилляра (под действием приложенной разности потенциалов) будет сопровождаться созданием своего рода преграды для прохождения ионов, значение ионного тока будет уменьшаться.
Известные результаты [15–17] по описанию поведения тока через апертуру нанокапилляра показывают, что в широком диапазоне размера концевого отверстия ток через него можно описать законом Ома. Величина ионного тока, протекающего через отверстие в капилляре, определяется выражением:
(1)
где – ток насыщения (на удалении от поверхности образца), z – расстояние до поверхности образца, А – коэффициент, учитывающий геометрию капилляра, определяемый через соотношение [17]:
(2)
где – внешний диаметр апертуры, – внутренний диаметр апертуры, L – расстояние от торца капилляра до электрода, расположенного внутри капилляра. Ток насыщения, протекающий через нанокапилляр на большом расстоянии от образца, определяется в основном через сопротивление капилляра Rp через закон Ома:
(3)
где U – напряжение между электродами.
Для сопротивления нанокапилляра справедливо соотношение:
(4)
где – электропроводность электролита среды, – внутренний радиус капилляра, – угол при вершине капилляра (в среднем составляет от 3° до 5°).
Воспользовавшись также выражениями для определения размера и сопротивления капилляра (3, 4) и тока вблизи поверхности (1) и пренебрегая постоянными составляющими, несложно прийти к соотношению для токов в присутствии частицы и без нее:
(5)
Проиллюстрируем методику на примере капилляра с радиусом отверстия 100 нм (рис.1). При расчете для частицы с rчастицы ≅ 50 нм получаем Rпри/Rбез ≈ 2 рост сопротивления в два раза, что влечет за собой падение величины тока на 50%!
В процессе нанокапиллярной печати, когда капилляр находится вблизи поверхности образца, а прыжковый режим его перемещения выключен, это падение будет без труда зафиксировано системой обратной связи, что позволит точно проводить подсчет в процессе локального осаждения наночастиц.
Данная схема имплементирована в управляющее ПО сканирующего капиллярного микроскопа "ФемтоСкан X Ion" [18], регистрирующее соответствующие изменения в сигнале с усилителя ионного тока, протекающего через апертуру капилляра ионного тока.
Сканирующий капиллярный микроскоп может использоваться и для локального нанесения на подложку или в область образца мельчайших капель жидкости [19]. Механизм работы проиллюстрирован на рис.2. Вследствие капиллярного эффекта (закон Лапласа) на кончике заполненного электролитом капилляра образуется микрокапля, которая при подведении капилляра к проводящей подложке соприкасается с ней и между электродом в среде капилляра и электродом подложки начинает протекать ток. Появление тока регистрируется системой обратной связи, что позволяет остановить сближение и отвести капилляр, при этом капля вследствие смачивания остается на поверхности.
Данная техника была реализована и на платформе сканирующего капиллярного микроскопа "ФемтоСкан X Ion" [20]. Использование СКМ в данном случае обусловлено вышеописанным механизмом и необходимостью локального и дозированного нанесения капель с микрометровым периодом на горизонтальной поверхности образца (подложки). В этом отлично помогает пьезоманипулятор, обеспечивающий прецизионное перемещение подложки.
В качестве наносимой жидкости взят физраствор (0,9 М NaCl), проводящей подложкой служил контакт MicroSD/SD адаптера, покрытый золотым напылением. Подтверждена способность системы обратной связи регистрировать ток при соприкосновении капли с подложкой и останавливать подвод без поломки капилляра.
В работе использовался капилляр с размером отверстия около 1,5 мкм, при этом линейные размеры образующейся на его кончике капли имеют аналогичный порядок величины (рис.3), что позволяет наносить капли объемом порядка фемтолитров (мкм3 = 10–18 м3 = 10–15 л). Величина тока при контакте с подложкой составляла 6,5 нА.
Контролировать объем наносимой капли можно различными способами. Первым из них может быть выбор капилляра с определенным размером выходного отверстия. Другой способ предполагает использование внешнего давления, подаваемого с помощью компрессорной системы через верхнее свободное отверстие капилляра. Варьировать доставку вещества удается также с помощью электрофореза – направленного переноса заряженных частиц под действием электрического поля.
ВЫВОДЫ
Внутриклеточная доставка является ключевым шагом в современных биологических исследованиях и открывает путь для многочисленных биомедицинских открытий. Сейчас доставка веществ в клетки становится все более важной в промышленных и медицинских приложениях, начиная от биопроизводства и заканчивая клеточной терапией.
Поэтому сканирующая капиллярная микроскопия приобретает особый интерес как метод исследования морфологии, измерения локальных биотоков и как метод адресной доставки веществ, что позволяет изучать реакцию клетки на внешнее воздействие и, как следствие, получать качественно новую и более значимую информацию о процессе их жизнедеятельности.
Уникальность доставки молекул, белков и ДНК с помощью капилляра заключается в ее доступности, применимости к разным типам клеток с минимальным повреждением клеточной мембраны и относительной быстроте. Этот метод можно использовать для эффективной доставки передовых терапевтических средств (наноинъекция) и для неразрушающего отбора проб (нанобиопсия), при этом можно сразу же получить информацию об изменении фенотипа клеток вследствие проведенных манипуляций.
Однако успешное внедрение этой технологии требует знания нескольких научных областей, а также широкого распространение сканирующей капиллярной микроскопии для всех, кто интересуется внутриклеточной доставкой: для биологов, исследующих клеточную механику и морфологию; химиков, разрабатывающих новые вещества; клеточных физиологов и биотехнологов, изучающих механизмы доставки веществ в клетку.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа выполнена по госзаданию при финансовой поддержке физического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова (Регистрационная тема 122091200048-7). ПО "ФемтоСкан Онлайн" предоставлено ООО НПП "Центр перспективных технологий". www.nanoscopy.ru. Отдельная благодарность за поддержку Советникова Т.О. фонду "Базис" (договор № 24-2-10-9-1)
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Elnathan R. et al. Engineering vertically aligned semiconductor nanowire arrays for applications in the life sciences. Nano Today 9. 2014. PP. 172–196. https://doi.org/10.1016/j.nantod.2014.04.001
Tay A. The benefits of going small: nanostructures for mammalian cell transfection. ACS Nano. 2020. Vol. 14. PP. 7714–7721. https://doi.org/10.1021/acsnano.0c04624
He G. et al. Nanoneedle platforms: the many ways to pierce the cell membrane. Adv. Funct. Mater. 2020. Vol. 30. P. 1909890. https://doi.org/10.1002/adfm.201909890
Liu R. et al. High density individually addressable nanowire arrays record intracellular activity from primary rodent and human stem cell derived neurons. Nano Lett. 2017. Vol. 17. PP. 2757–2764. https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.6b04752
Abbott J. et al. Optimizing nanoelectrode arrays for scalable intracellular electrophysiology. Acc. Chem. Res. 51. 2018. PP. 600–608. https://doi.org/10.1021/acs.accounts.7b00519
Chen Y. et al. Emerging roles of 1D vertical nanostructures in orchestrating immune cell functions. Adv. Mater. 32. 2020. P. e2001668. https://doi.org/10.1002/adma.202001668
Wang Z. et al. Interrogation of cellular innate immunity by diamond-nanoneedle-assisted intracellular molecular fishing. Nano Lett. 2015. Vol. 15. PP. 7058–7063. https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.5b03126
Leitao S.M. et al. Spatially multiplexed single-molecule translocations through a nanopore at controlled speeds. Nat. Nanotechnol. 2023. Vol. 18. PP. 1078–1084. https://doi.org/10.1038/s41565-023-01412-4
Varongchayakul N. et al. Single-molecule protein sensing in a nanopore: a tutorial. Chem. Soc. Rev. 47. 2018. PP. 8512–8524. https://doi.org/10.1039/c8cs00106e
Chau C.C. et al. Macromolecular crowding enhances the detection of DNA and proteins by a solid-state nanopore. Nano Lett. 20. 2020. PP. 5553–5561. https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c02246
Confederat S. et al. Next-generation nanopore sensors based on conductive pulse sensing for enhanced detection of nanoparticles. Small. 2023. https://doi.org/10.1002/smll.202305186
Chau C.C. et al. Single molecule delivery into living cells. Nat Commun. 2024. Vol. 15. No. 1. P. 4403. https://doi.org/10.1038/s41467-024-48608-3
O’Connell M.A. et al. Positionable vertical microfluidic cell based on electromigration in a theta pipet. Langmuir. 2014. Vol. 30. PP. 10011–10018. https://doi.org/10.1021/la5020412
McKelvey K. et al. Meniscus confined fabrication of multidimensional conducting polymer nanostructures with scanning electrochemical cell microscopy (SECCM). Chem. Comm. 2013. Vol. 49. PP. 2986–2988. https://doi.org/10.1039/c3cc00104k
Pastre D. et al. Characterization of AC mode scanning ion-conductance microscopy. Ultramicroscopy. 2001. Vol. 90. PP. 13–19. https://doi.org/10.1016/s0304-3991(01)00096-1
Rheinlander J., Schaffer T.E. An accurate model for the ion current–distance behavior in scanning ion conductance microscopy allows for calibration of pipet tip geometry and tip–sample distance. Anal. Chem. 2017. Vol. 89. No. 21. PP. 11875–11880. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.7b03871
Lukashenko S.Y. et al. Behavioral features of the approach curve of a scanning ion-conductance microscope. J. Surf. Investig. 2023. Vol. 17. PP. 585–591. https://doi.org/10.1134/S1027451023030096
Sovetnikov T.O. et al. Characteristics of the use of scanning capillary microscopy in biomedical research. Bio-Medical Engineering 57. 2023. Vol. 4. PP. 250–253. https://doi.org/10.1007/s10527-023-10309-4
Rodolfa K.T. et al. Two-Component Graded Deposition of Biomolecules with a Double-Barreled Nanopipette. Angewandte Chemie International Edition. 2005. Vol. 44. No. 42. PP. 6854–6859. https://doi.org/10.1002/anie.200502338
Akhmetova A.I. et al. Scanning capillary microscopy for biological applications. NANOINDUSTRY. 2024. Vol. 17. No. 6. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.6.364.370
Научная статья
СКАНИРУЮЩАЯ КАПИЛЛЯРНАЯ МИКРОСКОПИЯ КАК СРЕДСТВО НАНОКАПИЛЛЯРНОЙ ПЕЧАТИ
А.И.Ахметова1, 2, к.ф.-м.н., науч. сотр., ORCID: 0000-0002-5115-8030
Т.О.Советников1, 2, асп., вед. инж., ORCID: 0000-0001-6541-8932
А.Д.Терентьев1, 2, асп., прогр., ORCID: 0009-0009-1528-5284
И.В.Яминский1, 2, д.ф.-м.н., проф., ген. дир., ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Аннотация. Контролируемое манипулирование культивируемыми клетками и локальная доставка макромолекул и веществ являются до сих пор нерешенными задачами экспериментальной биологии. Внутриклеточное введение различных терапевтических средств, включая биологические препараты и супрамолекулярные агенты, сложно реализуема из-за естественных биологических барьеров, необходимых для защиты клетки. Эффективная доставка нуклеиновых кислот, белков, пептидов и наночастиц имеет решающее значение для клинического внедрения новых технологий, которые могут принести пользу лечению заболеваний с помощью генной и клеточной терапии. Используя капилляр, можно локально нанести на клетку требующееся вещество или даже ввести его внутрь клетки, а в дальнейшем оценить его влияние на морфологию с помощью инструментов сканирующей капиллярной микроскопии (СКМ). Эти возможности делают метод капиллярной микроскопии перспективным для целей биомедицины.
Ключевые слова: сканирующая капиллярная микроскопия, живые системы, микродозирование, локальная доставка вещества, наночастицы
Для цитирования: А.И. Ахметова, Т.О. Советников, А.Д. Терентьев, И.В. Яминский. Сканирующая капиллярная микроскопия как средство нанокапиллярной печати. НАНОИНДУСТРИЯ. 2024. Т. 17. № 7–8. С. 418–425. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.7-8.418.425.
Received: 28.10.2024 | Accepted: 31.10.2024 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.7-8.418.425
Original paper
SCANNING CAPILLARY MICROSCOPY AS A TOOL FOR NANOCAPILLARY PRINTING
A.I.Akhmetova1, 2, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Researcher, ORCID: 0000-0002-5115-8030
T.O.Sovetnikov1, 2, Postgraduate, Engineer, Leading Engineer, ORCID: 0000-0001-6541-8932
A.D.Terentev1, 2, Postgraduate, Programmer, ORCID: 0009-0009-1528-5284
I.V.Yaminsky1, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Prof., Director General,
ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Abstract. Controlled manipulation of cultured cells and local delivery of macromolecules and substances are still unsolved problems in experimental biology. Intracellular injection of various therapeutic agents, including biologics and supramolecular agents, is difficult due to natural biological barriers required to protect the cell. Efficient delivery of nucleic acids, proteins, peptides and nanoparticles is critical for clinical implementation of new technologies that can benefit the treatment of diseases using gene and cell therapy. Using a capillary, it is possible to locally apply a desired substance to a cell or even introduce it into the cell, and then evaluate its effect on morphology using scanning capillary microscopy (SCM) tools. These capabilities make the capillary microscopy method promising for biomedical purposes.
Keywords: scanning capillary microscopy, living systems, microdosing, local substance delivery, nanoparticles
For citation: A.I. Akhmetova, T.O. Sovetnikov, A.D. Terentev, I.V. Yaminsky. Scanning capillary microscopy as a tool for nanocapillary printing. NANOINDUSTRY. 2024. Vol. 17. No. 7–8. PP. 418–425. https://doi.org/
10.22184/1993-8578.2024.17.7-8.418.425.
ВВЕДЕНИЕ
Клетка наделена динамичным механизмом, доступ к которому строго регулируется внутриклеточными процессами. Клетки передают информацию друг другу через молекулы, ДНК кодирует РНК и белки, белки передают сигналы и действуют как строительные блоки клеточной структуры, липиды образуют мембрану и хранят энергию. Традиционные методы доставки веществ могут нарушать функции клеток, что ограничивает их применимость. Введение молекул и веществ в клетку является важным экспериментальным шагом в понимании ее функции, в управлении клеткой и перепрограммировании ее поведения.
Существуют разные способы доставки веществ в клетки млекопитающих: с помощью липидных везикул и вирусоподобных частиц, путем химической трансфекции, электропорации и микро- и наноинъекций.
Наноинъекция – это процесс внутриклеточной доставки с использованием наноигл [1–3]. Наноиглы, как правило, не вредны для клеток, в том числе для нейронов, кардиомиоцитов и иммунных клеток [4–6]. Наноинъекция повышает эффективность трансфекции плазмидной ДНК (пДНК) в труднотрансфицируемых клетках [7].
Для инъекций можно использовать не только наноиглы, но и стеклянные капилляры с диаметром выходного отверстия микронного размера для механического проникновения через плазматическую мембрану, что также позволяет доставлять молекулы. Однако большой размер кончика капилляра (обычно от 0,5 до 75 мкм по внешнему диаметру) относительно размера клетки может деформировать мембрану во время инъекции, нарушая актиновый цитоскелет и изменяя морфологию клетки.
С помощью пуллера (например, P2000, Sutter Instruments) можно изготовить капилляры с минимальным радиусом выходного отверстия – до 10 нм. С помощью электрода, помещенного в капилляр, можно контролировать транспорт молекул приложением подходящего напряжения и измерением ионного тока. Полярность и величина напряжения зависят от заряда доставляемой молекулы, причем величина напряжения не должна превышать ±1 В [8, 9]. Более того, малый размер кончика капилляра относительно клетки позволяет не деформировать клеточную мембрану. Транслокация одной макромолекулы через кончик капилляра приводит к обнаруживаемому изменению измеряемого ионного тока, который можно использовать для характеристики и количественной оценки числа молекул, проходящих через капилляр [10, 11].
В работе [12] описывается платформа, которая использует капилляры для доставки определенного количества макромолекул в культивируемые клеточные линии и первичные клетки с разрешением на уровне одной молекулы. Капилляр используется и как зонд сканирующего капиллярного микроскопа, и как игла для инъекции. С помощью СКМ осуществляется позиционирование над поверхностью клетки перед тем, как капилляр будет введен на заданную глубину в определенное место клетки. С помощью этой установки показана количественная доставка ДНК, глобулярных белков и белковых фибрилл в клетки с разрешением на уровне одной молекулы. А также продемонстрировано, что доставка приводит к изменению фенотипа клетки.
Также известны результаты по применению сканирующей капиллярной микроскопии для локальной доставки наночастиц [13, 14]. В этой связи встает вопрос подсчета их числа, прошедшего через отверстия нанокапилляра. Такой подход позволит проводить не только локальную, но и высокоточную доставку наночастиц к поверхности клетки.
В рамках разработки нанокапиллярной печати нашей группой выработана методика подсчета числа осаждаемых частиц. Метод состоит в подборе отверстия капилляра, соразмерного доставляемым (осаждаемым) частицам, при этом выход наночастицы из капилляра (под действием приложенной разности потенциалов) будет сопровождаться созданием своего рода преграды для прохождения ионов, значение ионного тока будет уменьшаться.
Известные результаты [15–17] по описанию поведения тока через апертуру нанокапилляра показывают, что в широком диапазоне размера концевого отверстия ток через него можно описать законом Ома. Величина ионного тока, протекающего через отверстие в капилляре, определяется выражением:
(1)
где – ток насыщения (на удалении от поверхности образца), z – расстояние до поверхности образца, А – коэффициент, учитывающий геометрию капилляра, определяемый через соотношение [17]:
(2)
где – внешний диаметр апертуры, – внутренний диаметр апертуры, L – расстояние от торца капилляра до электрода, расположенного внутри капилляра. Ток насыщения, протекающий через нанокапилляр на большом расстоянии от образца, определяется в основном через сопротивление капилляра Rp через закон Ома:
(3)
где U – напряжение между электродами.
Для сопротивления нанокапилляра справедливо соотношение:
(4)
где – электропроводность электролита среды, – внутренний радиус капилляра, – угол при вершине капилляра (в среднем составляет от 3° до 5°).
Воспользовавшись также выражениями для определения размера и сопротивления капилляра (3, 4) и тока вблизи поверхности (1) и пренебрегая постоянными составляющими, несложно прийти к соотношению для токов в присутствии частицы и без нее:
(5)
Проиллюстрируем методику на примере капилляра с радиусом отверстия 100 нм (рис.1). При расчете для частицы с rчастицы ≅ 50 нм получаем Rпри/Rбез ≈ 2 рост сопротивления в два раза, что влечет за собой падение величины тока на 50%!
В процессе нанокапиллярной печати, когда капилляр находится вблизи поверхности образца, а прыжковый режим его перемещения выключен, это падение будет без труда зафиксировано системой обратной связи, что позволит точно проводить подсчет в процессе локального осаждения наночастиц.
Данная схема имплементирована в управляющее ПО сканирующего капиллярного микроскопа "ФемтоСкан X Ion" [18], регистрирующее соответствующие изменения в сигнале с усилителя ионного тока, протекающего через апертуру капилляра ионного тока.
Сканирующий капиллярный микроскоп может использоваться и для локального нанесения на подложку или в область образца мельчайших капель жидкости [19]. Механизм работы проиллюстрирован на рис.2. Вследствие капиллярного эффекта (закон Лапласа) на кончике заполненного электролитом капилляра образуется микрокапля, которая при подведении капилляра к проводящей подложке соприкасается с ней и между электродом в среде капилляра и электродом подложки начинает протекать ток. Появление тока регистрируется системой обратной связи, что позволяет остановить сближение и отвести капилляр, при этом капля вследствие смачивания остается на поверхности.
Данная техника была реализована и на платформе сканирующего капиллярного микроскопа "ФемтоСкан X Ion" [20]. Использование СКМ в данном случае обусловлено вышеописанным механизмом и необходимостью локального и дозированного нанесения капель с микрометровым периодом на горизонтальной поверхности образца (подложки). В этом отлично помогает пьезоманипулятор, обеспечивающий прецизионное перемещение подложки.
В качестве наносимой жидкости взят физраствор (0,9 М NaCl), проводящей подложкой служил контакт MicroSD/SD адаптера, покрытый золотым напылением. Подтверждена способность системы обратной связи регистрировать ток при соприкосновении капли с подложкой и останавливать подвод без поломки капилляра.
В работе использовался капилляр с размером отверстия около 1,5 мкм, при этом линейные размеры образующейся на его кончике капли имеют аналогичный порядок величины (рис.3), что позволяет наносить капли объемом порядка фемтолитров (мкм3 = 10–18 м3 = 10–15 л). Величина тока при контакте с подложкой составляла 6,5 нА.
Контролировать объем наносимой капли можно различными способами. Первым из них может быть выбор капилляра с определенным размером выходного отверстия. Другой способ предполагает использование внешнего давления, подаваемого с помощью компрессорной системы через верхнее свободное отверстие капилляра. Варьировать доставку вещества удается также с помощью электрофореза – направленного переноса заряженных частиц под действием электрического поля.
ВЫВОДЫ
Внутриклеточная доставка является ключевым шагом в современных биологических исследованиях и открывает путь для многочисленных биомедицинских открытий. Сейчас доставка веществ в клетки становится все более важной в промышленных и медицинских приложениях, начиная от биопроизводства и заканчивая клеточной терапией.
Поэтому сканирующая капиллярная микроскопия приобретает особый интерес как метод исследования морфологии, измерения локальных биотоков и как метод адресной доставки веществ, что позволяет изучать реакцию клетки на внешнее воздействие и, как следствие, получать качественно новую и более значимую информацию о процессе их жизнедеятельности.
Уникальность доставки молекул, белков и ДНК с помощью капилляра заключается в ее доступности, применимости к разным типам клеток с минимальным повреждением клеточной мембраны и относительной быстроте. Этот метод можно использовать для эффективной доставки передовых терапевтических средств (наноинъекция) и для неразрушающего отбора проб (нанобиопсия), при этом можно сразу же получить информацию об изменении фенотипа клеток вследствие проведенных манипуляций.
Однако успешное внедрение этой технологии требует знания нескольких научных областей, а также широкого распространение сканирующей капиллярной микроскопии для всех, кто интересуется внутриклеточной доставкой: для биологов, исследующих клеточную механику и морфологию; химиков, разрабатывающих новые вещества; клеточных физиологов и биотехнологов, изучающих механизмы доставки веществ в клетку.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа выполнена по госзаданию при финансовой поддержке физического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова (Регистрационная тема 122091200048-7). ПО "ФемтоСкан Онлайн" предоставлено ООО НПП "Центр перспективных технологий". www.nanoscopy.ru. Отдельная благодарность за поддержку Советникова Т.О. фонду "Базис" (договор № 24-2-10-9-1)
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Elnathan R. et al. Engineering vertically aligned semiconductor nanowire arrays for applications in the life sciences. Nano Today 9. 2014. PP. 172–196. https://doi.org/10.1016/j.nantod.2014.04.001
Tay A. The benefits of going small: nanostructures for mammalian cell transfection. ACS Nano. 2020. Vol. 14. PP. 7714–7721. https://doi.org/10.1021/acsnano.0c04624
He G. et al. Nanoneedle platforms: the many ways to pierce the cell membrane. Adv. Funct. Mater. 2020. Vol. 30. P. 1909890. https://doi.org/10.1002/adfm.201909890
Liu R. et al. High density individually addressable nanowire arrays record intracellular activity from primary rodent and human stem cell derived neurons. Nano Lett. 2017. Vol. 17. PP. 2757–2764. https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.6b04752
Abbott J. et al. Optimizing nanoelectrode arrays for scalable intracellular electrophysiology. Acc. Chem. Res. 51. 2018. PP. 600–608. https://doi.org/10.1021/acs.accounts.7b00519
Chen Y. et al. Emerging roles of 1D vertical nanostructures in orchestrating immune cell functions. Adv. Mater. 32. 2020. P. e2001668. https://doi.org/10.1002/adma.202001668
Wang Z. et al. Interrogation of cellular innate immunity by diamond-nanoneedle-assisted intracellular molecular fishing. Nano Lett. 2015. Vol. 15. PP. 7058–7063. https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.5b03126
Leitao S.M. et al. Spatially multiplexed single-molecule translocations through a nanopore at controlled speeds. Nat. Nanotechnol. 2023. Vol. 18. PP. 1078–1084. https://doi.org/10.1038/s41565-023-01412-4
Varongchayakul N. et al. Single-molecule protein sensing in a nanopore: a tutorial. Chem. Soc. Rev. 47. 2018. PP. 8512–8524. https://doi.org/10.1039/c8cs00106e
Chau C.C. et al. Macromolecular crowding enhances the detection of DNA and proteins by a solid-state nanopore. Nano Lett. 20. 2020. PP. 5553–5561. https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c02246
Confederat S. et al. Next-generation nanopore sensors based on conductive pulse sensing for enhanced detection of nanoparticles. Small. 2023. https://doi.org/10.1002/smll.202305186
Chau C.C. et al. Single molecule delivery into living cells. Nat Commun. 2024. Vol. 15. No. 1. P. 4403. https://doi.org/10.1038/s41467-024-48608-3
O’Connell M.A. et al. Positionable vertical microfluidic cell based on electromigration in a theta pipet. Langmuir. 2014. Vol. 30. PP. 10011–10018. https://doi.org/10.1021/la5020412
McKelvey K. et al. Meniscus confined fabrication of multidimensional conducting polymer nanostructures with scanning electrochemical cell microscopy (SECCM). Chem. Comm. 2013. Vol. 49. PP. 2986–2988. https://doi.org/10.1039/c3cc00104k
Pastre D. et al. Characterization of AC mode scanning ion-conductance microscopy. Ultramicroscopy. 2001. Vol. 90. PP. 13–19. https://doi.org/10.1016/s0304-3991(01)00096-1
Rheinlander J., Schaffer T.E. An accurate model for the ion current–distance behavior in scanning ion conductance microscopy allows for calibration of pipet tip geometry and tip–sample distance. Anal. Chem. 2017. Vol. 89. No. 21. PP. 11875–11880. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.7b03871
Lukashenko S.Y. et al. Behavioral features of the approach curve of a scanning ion-conductance microscope. J. Surf. Investig. 2023. Vol. 17. PP. 585–591. https://doi.org/10.1134/S1027451023030096
Sovetnikov T.O. et al. Characteristics of the use of scanning capillary microscopy in biomedical research. Bio-Medical Engineering 57. 2023. Vol. 4. PP. 250–253. https://doi.org/10.1007/s10527-023-10309-4
Rodolfa K.T. et al. Two-Component Graded Deposition of Biomolecules with a Double-Barreled Nanopipette. Angewandte Chemie International Edition. 2005. Vol. 44. No. 42. PP. 6854–6859. https://doi.org/10.1002/anie.200502338
Akhmetova A.I. et al. Scanning capillary microscopy for biological applications. NANOINDUSTRY. 2024. Vol. 17. No. 6. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.6.364.370
Отзывы читателей
