eng
Выпуск #7-8/2024
К.Е.Мочалов, О.И.Агапова, И.И.Агапов, Д.С.Коржов, Д.О.Соловьева, С.В.Сизова, М.С.Шестопалова, В.А.Олейников, А.Е.Ефимов
ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ ОПТИЧЕСКАЯ НАНОТОМОГРАФИЯ: ОБЪЕДИНЕНИЕ ТЕХНИК ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ ПОЛНОГО ВНУТРЕННЕГО ОТРАЖЕНИЯ И УЛЬТРАМИКРОТОМИИ
ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ ОПТИЧЕСКАЯ НАНОТОМОГРАФИЯ: ОБЪЕДИНЕНИЕ ТЕХНИК ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ ПОЛНОГО ВНУТРЕННЕГО ОТРАЖЕНИЯ И УЛЬТРАМИКРОТОМИИ
Просмотры: 1716
DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.7-8.428.433
Предложен метод 3D-TIRF-микроскопии, основанный на объединении методик ультрамикротомии и флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения поверхности образца после среза и позволяющий реконструировать трехмерную ультраструктуру объектов.
Предложен метод 3D-TIRF-микроскопии, основанный на объединении методик ультрамикротомии и флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения поверхности образца после среза и позволяющий реконструировать трехмерную ультраструктуру объектов.
Теги: 3d-tirf microscopy 3d-tirf-микроскопия three-dimensional ultrastructure of objects трехмерная ультраструктура объектов
Получено: 17.10.2024 г. | Принято: 21.10.2024 г. | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.7-8.428.433
Научная статья
Флуоресцентная оптическая нанотомография: объединение техник флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения и ультрамикротомии
К.Е.Мочалов1, д.ф.-м.н., ст. науч. сотр., ORCID: 0000-0001-8157-9613
О.И.Агапова2, к.б.н., ст. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-4507-1852
И.И.Агапов2, д.б.н., зав. лаб., ORCID: 0000-0002-0273-4601
Д.С.Коржов1, 3, техник-лаборант, ORCID: 0009-0006-2626-1278
Д.О.Соловьева1, к.б.н., науч. сотр., ORCID: 0000-0002-2590-4204
С.В.Сизова1, к.х.н., науч. сотр., ORCID: 0000-0003-0846-4670
М.С.Шестопалова1, 3 инж.-иссл., ORCID: 0000-0001-6543-4289
В.А.Олейников1, 3, д.ф.-м.н., проф., зав. отд., ORCID: 0000-0003-4623-4913
А.Е.Ефимов2, д.б.н., гл. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-0769-301X / antefimov@gmail.com
Аннотация. Предложен метод 3D-TIRF-микроскопии, основанный на объединении методик ультрамикротомии и флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения поверхности образца после среза и позволяющий реконструировать трехмерную ультраструктуру объектов.
Ключевые слова: 3D-TIRF-микроскопия, трехмерная ультраструктура объектов
Для цитирования: К.Е. Мочалов, О.И. Агапова, И.И. Агапов, Д.С. Коржов, Д.О. Соловьева, С.В. Сизова, М.С. Шестопалова, В.А. Олейников, А.Е. Ефимов. Флуоресцентная оптическая нанотомография: объединение техник флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения и ультрамикротомии. НАНОИНДУСТРИЯ. 2024. Т. 17. № 7–8. С. 428–433. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.7-8.428.433.
Received: 17.10.2024 | Accepted: 21.10.2024 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.7-8.428.433
Original paper
FLUORESCENCE OPTICAL NANOTOMOGRAPHY:
COMBINING THE TECHNIQUES OF TOTAL INTERNAL REFLECTION FLUORESCENCE MICROSCOPY AND ULTRAMICROTOMY
K.E.Mochalov1, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Senior Researcher, ORCID: 0000-0001-8157-9613
O.I.Agapova2, Cand. of Sci. (Biology), Senior Researcher, ORCID: 0000-0002-4507-1852
I.I.Agapov2, Doct. of Sci. (Biology), Prof., Head of Laboratory, ORCID: 0000-0002-0273-4601
D.S.Korzhov1, 3, Technician, ORCID: 0009-0006-2626-1278
D.O.Solovyeva1, Cand. of Sci. (Biology), Researcher, ORCID: 0000-0002-2590-4204
S.V.Sizova1, Cand. of Sci. (Chemistry), Researcher, ORCID: 0000-0003-0846-4670
M.S.Shestopalova1, 3, Engineer Researcher, ORCID: 0000-0001-6543-4289
V.A.Oleinikov1, 3, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics),
Prof., Head of Department, ORCID: 0000-0003-4623-4913
A.E.Efimov2, Doct. of Sci. (Biology), Chief Researcher, ORCID: 0000-0002-0769-301X / antefimov@gmail.com
Abstract. A method of 3D-TIRF microscopy is proposed, based on combination of ultramicrotomy and total internal reflection fluorescence microscopy techniques of the sample surface after cutting, which allows reconstructing the three-dimensional ultrastructure of objects.
Keywords: 3D-TIRF microscopy, three-dimensional ultrastructure of objects
For citation: K.E. Mochalov, O.I. Agapova, I.I. Agapov, D.S. Korzhov, D.O. Solovyeva, S.V. Sizova, M.S. Shestopalova, V.A. Oleinikov, A.E. Efimov. Fluorescence optical nanotomography: combining the techniques of total internal reflection fluorescence microscopy and ultramicrotomy. NANOINDUSTRY. 2024. Vol. 17. No. 7–8. PP. 428–433. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.7-8.428.433.
ВВЕДЕНИЕ
Современные исследования и задачи в биомедицине, клеточной биологии и нанотехнологиях требуют постоянного усовершенствования и разработки новых методов микроскопии сверхвысокого разрешения. В настоящее время для трехмерной визуализации субклеточных процессов и структур применяются различные методы флуоресцентной и конфокальной микро- и наноскопии, однако предел разрешения, ограниченный дифракцией, во многих случаях не позволяет получить достаточно высокое разрешение для детальной визуализации исследуемых биологических структур [1, 2]. Аксиальное разрешение большинства существующих методик составляет несколько микрон, что существенно ниже по сравнению с их латеральным разрешением. Это препятствует возможности получения удовлетворительных трехмерных изображений ультраструктуры биологических образцов.
Одним из распространенных на данный момент способов достижения высокого аксиального разрешения является использование метода флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF, Total Internal Reflection Fluorescence microscopy), который нашел широкое применение в биологических исследованиях, позволяя получать достаточно детализированные и контрастные изображения [3, 4]. Пучок света в TIRF-микроскопии распространяется в направлении границы раздела сред, на поверхности которой в водной или воздушной среде находится тонкий слой образца. При падении плоской волны под сверхкритическим углом на границе разделов сред происходит возбуждение эванесцентной волны, возникающей в результате эффекта полного внутреннего отражения. Эванесцентная волна экспоненциально затухает, распространяясь в среде на глубину, обычно значительно меньшую длины волны излучения [5].
Следовательно, затухающее поле способно возбуждать флуорофоры только в тонком слое вблизи поверхности, и значительно увеличить аксиальное разрешение флуоресцентных изображений, что и обуславливает применение метода TIRF в биологических in vitro исследованиях на протяжении двух последних десятилетий [3, 4, 6].
Однако TIRF-микроскопия имеет и свои недостатки, одним из них является ограничение толщины исследуемой области образца, которая не должна превышать 100–200 нм, что накладывает ограничения на спектр задач, решаемых с помощью данной методики. И на сегодняшний день TIRF используется в основном для визуализации процессов, ассоциированных с плазматической мембраной клетки, таких как процессы секреции и эндоцитоза [7, 8], изучение взаимодействия лиганд-рецептор на клеточной поверхности [9, 10], картирования цитоплазматической мембраны [11, 12] или контактов клетки с подложкой. При этом для изучения большинства биологических процессов и моделей требуются значительное увеличение предельной глубины реконструкции флуоресцентного изображения, что вызывает необходимость развития подходов, позволяющих производить протяженное вдоль оптической оси послойное сканирование с последующей реконструкцией массива 2D-данных в 3D-изображение.
В данной работе предложен подход для решения вышеуказанной проблемы, основанный на объединении методик ультрамикротомии (выполнение последовательности сверхтонких срезов образца) и TIRF, что дает возможность визуализации 3D-ультраструктуры объектов на основе результатов послойного TIRF-сканирования (томографии) образца в режиме и в рамках единой измерительной процедуры. Совмещение методик возможно за счет ключевой особенности: использования специализированного алмазного ножа ультрамикротома как для получения физических срезов, так и в качестве TIRF-призмы.
3D-TIRF-СИСТЕМА
Основная техническая задача для реализации методики 3D-TIRF состояла в разработке специализированного прямого оптического флуоресцентного микроскопа и системы его сопряжения с ультрамикротомом (см. рис.1). Исходя из результатов предварительных расчетов, геометрия и оптические свойства ножа ультрамикротома (рис.2, поз.1) позволяют проводить возбуждение и сбор оптического сигнала с помощью объектива с числовой апертурой 0.75 и рабочим отрезком 5.2 мм (Mitutoyo Plan Apo HR Infinity Corrected × 50) (рис.2, поз.2). Возбуждающее излучение выходит из объектива и, проходя через внешнюю грань алмазного ножа, испытывает полное внутреннее отражение на его внутренней грани во всем угловом диапазоне падающих лучей. Таким образом, для данного объектива оказывается задействована вся его числовая апертура, что способствует повышению чувствительности флуоресцентной микроскопии и ее латерального разрешения. Условие полного внутреннего отражения во всем угловом диапазоне падающих лучей также будет выполняться при варьировании положения оптической оси объектива в диапазоне от 0° (вертикальное расположение, рис.2) до 45° (перпендикулярно первой грани ножа). Возможность широкого варьирования угла наклона оптической оси объектива по отношению к внешней грани алмазной призмы в вертикальной плоскости является важным параметром данной системы, увеличивающим ее адаптируемость под различные экспериментальные условия.
Исследуемый образец располагается на сканирующем XYZ-пьезосканере (рис.2 поз. 3), закрепленном на подвижной консоли ультрамикротома таким образом, что одна из его координат (X) параллельна кромке алмазного ножа. Данный пьезосканер был создан ранее коллективом авторов в ходе работы по созданию уникальной научной установки (УНУ – http://ckp-rf.ru/usu/486825/) [13–15]. Использование XYZ-пьезосканера системы как в качестве сканирующего устройства, так и в качестве устройства подвода образца обеспечивает высокоточное совмещение поверхности образца с гранью алмазного ножа. Перемещение с нанометровой точностью вдоль оси Z (перпендикулярно плоскости среза) позволяет зондировать экспоненциально затухающее поле, возбуждающее флуоресценцию (см. рис.3), с целью нахождения оптимальных соотношений между разрешением по глубине и интенсивностью TIRF-сигнала.
Для получения среза образца нож ультрамикротома должен располагаться под углом 2–10° к поверхности образца, что приводит к тому, что эффективное возбуждение TIRF возникает только в узкой полосе ("полоса контрастности") вблизи его кромки, где нож и образец находятся на наименьшем расстоянии друг от друга. Последовательность "полос контрастности", полученная при сканировании плоскости среза образца вдоль направления Y перпендикулярно кромке ножа, с использованием специального программного обеспечения, написанного в среде Piton 3.8, складывается в его 2D-флуоресцентное изображение. Набор 2D-флуоресцентных изображений, полученных в результате последовательных срезов и сканирований вдоль оси Y, далее преобразуется с помощью программы ImagePro Plus 6.0 в трехмерное флуоресцентное изображение исследуемого образца.
МАТЕРИАЛЫ
В качестве тестового образца для практического исследования возможностей микроскопии 3D-TIRF были выбраны полистирольные микросферы (ПСМ) диаметром 5 мкм, поверхность которых покрыта монослоем полупроводниковых флуоресцентных квантовых точек (КТ) структуры ядро/оболочка (CdSe/ZnS) с длиной волны испускаемой флуоресценции в районе 530 нм. Толщина флуоресцентного монослоя КТ соответствует их среднему диаметру порядка 7 нм. Таким образом можно считать, что исследуемым объектом является флуоресцентная сфера диаметром 5 мкм и бесконечно малой (относительно аксиального разрешения прибора) толщиной. Для проведения измерений массив ПСМ/КТ был залит в среду Ловикрил, позволяющую легко выполнять срезы ультрамикротомом и, соответственно, проводить их полную 3D-реконструкцию.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Первой задачей для валидации метода 3D-TIRF было сравнение теоретического и экспериментального распределений эванесцентного поля вдоль оси Z на образцах ПСМ/КТ, описанных выше. Для этого проводился срез экспериментального образца, после чего к плоскости среза подводилась кромка ножа ультрамикротома до появления отчетливой "полосы контрастности". Далее образец отводился от ножа с шагом в 10 нм и записывались флуоресцентные изображения образца в "полосе контрастности". Глубина проникновения поля оценивалась по относительной яркости изображений кластеров КТ на поверхности ПСМ. Теоретическая зависимость строилась для длины волны 436 нм, что соответствует одной из длин волн ртутной лампы, которой в дальнейшем проводилось возбуждение флуоресценции КТ. Сравнение этой зависимости и данных, полученных экспериментально, приведено на рис.3.
Из приведенных данных видно, что с точностью до погрешности измерений теоретическая и экспериментальная зависимости совпадают, что прежде всего говорит об адекватной работе созданной системы возбуждения/сбора флуоресценции в режиме TIRF. Кроме того, полученные экспериментальные зависимости в дальнейшем будут использоваться для подбора параметров проведения эксперимента и интерпретации его результатов.
Далее была выполнена трехмерная реконструкция образцов ПСМ/КТ. Для этого было получено 33 последовательных 2D-TIRF с шагом ультрамикротомирования 150 нм. Каждое 2D-TIRF изображение было получено в результате последовательной интеграции 256 горизонтальных линий пикселов – "полос контрастности" вблизи лезвия ножа, полученных при растровом сканировании образцом по оси Y с шагом 100 нм. На рис.4 (левая панель) показан пример одного из полученных интегрированных 2D-TIRF изображений. Получение каждого из изображений заняло около 40 с. Различимые на изображении круговые структуры соответствуют срезам отдельных микросфер, на поверхности которых находятся флуоресцирующие квантовые точки.
Серия полученных 2D-TIRF-изображений была обработана при помощи программного пакета ImagePro Plus 6.0 3DConstructor (Media Cybernetics, Inc., USA). Визуализация полученной трехмерной реконструкции представлена на рис.4 (правая панель). На ней различимы объекты сферической формы, полые внутри, что указывает на успешность трехмерной реконструкции с приемлемым аксиальным разрешением. Так же как и на 2D-изображении, можно отметить, что флуоресцентные квантовые точки на поверхности распределены неравномерно, большинство из них находятся в кластерах размерами до нескольких сотен нанометров.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Предлагаемый метод позволяет получать трехмерные TIRF-изображения с аксиальным разрешением лучше дифракционного предела – за счет детектирования флуоресценции, возбужденной экспоненциально затухающими волнами, возникающими при полном внутреннем отражении от ближайшей к образцу грани ножа. После получения оптического среза толщиной менее 100 нм, выполняется очередной физический сверхтонкий срез поверхности образца с помощью ультрамикротома. В результате многократного повторения данной процедуры, получается серия оптических срезов, на основе которой восстанавливается 3D-TIRF-изображение исследуемого объекта. Основным преимуществом описанного подхода является отсутствие принципиальных (за исключением общего времени проведения эксперимента) ограничений на количество выполняемых срезов, а значит, реконструкция изображения объектов происходит без потерь аксиального разрешения при теоретически не ограниченной глубине реконструкции.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект № 22-14-00168).
ЛИТЕРАТУРА
Dongre A., Weinberg R.A. New insights into the mechanisms of epithelial–mesenchymal transition and implications for cancer, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2019. Vol. 20. PP. 69–84. https://doi.org/10.1038/s41580-018-0080-4
Finkenstaedt-Quinn S.A., Qiu T.A., Shin K., Haynes C.L. Super-resolution imaging for monitoring cytoskeleton dynamics, Analyst. 2016. Vol. 141. PP. 5674–5688. https://doi.org/10.1039/C6AN 00731G
Axelrod D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy in Cell Biology, Traffic. 2001. Vol. 2. PP. 764–774. https://doi.org/10.1034/j.1600-0854.2001.21104.x
Poulter N.S., Pitkeathly W.T.E., Smith P.J., Rappoport J.Z. The physical basis of total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and its cellular applications, in: P. Verveer (Eds.), Advanced Fluorescence Microscopy. Methods in Molecular Biology, Humana Press, New York. 2014. PP. 1–23. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2080-8_1
Martin-Fernandez M.L., Tynan C.J., Webb S.E.D. A ‘pocket guide’ to total internal reflection fluorescence, J. Microsc. 2013. Vol. 252. PP. 16–22. https://doi.org/10.1111/jmi.12070
Mattheyses A.L., Simon S.M., Rappoport J.Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist, J. Cell. Sci. 2010. Vol. 123. PP. 3621–3628. https://doi.org/10.1242/jcs.056218
Stabley D.R., Oh T., Simon S.M., Mattheyses A.L., Salaita K. 2015. Real-time fluorescence imaging with 20 nm axial resolution. Nat. Commun. Vol. 6. P. 8307. https://doi.org/10.1038/ncomms9307
Trexler A.J., Sochacki K.A., Taraska J.W. Imaging the recruitment and loss of proteins and lipids at single sites of calcium-triggered exocytosis, Mol. iol. Cell. 2016. Vol. 27. PP. 2423–2434. https://doi.org/10.1091/mbc.E16-01-0057
Allikalt A., Purkayastha N., Flad K., Schmidt M.F., Tabor A., Gmeiner P., Hübner P., Weikert D. Fluorescent ligands for dopamine D2/D3 receptors. Sci. Rep. 2020. Vol. 10. P. 21842. https://doi.org/10.1038/s41598-020-78827-9
Tabor A., Möller D., Hübner Y., Kornhuber J., Gmeiner P. Visualization of ligand-induced dopamine D2S and D2L receptor internalization by TIRF microscopy. Sci. Rep. 2017. Vol. 7. P. 10894. https://doi.org/10.1038/s41598-017-11436-1
Sankaran J., Wohland T. Fluorescence strategies for mapping cell membrane dynamics and structures. APL Bioeng. 2020. Vol. 4. P. 020901. https://doi.org/10.1063/1.5143945
Lukeš T., Glatzová D., Kvíčalová Z., Levet F., Benda A., Letschert S., Sauer M., Brdička T. Lasser T., Cebecauer M. Quantifying protein densities on cell membranes using super-resolution optical fluctuation imaging. Nat. Commun. 2017. Vol. 8. P. 1731. https://doi.org/10.1038/s41467-017-01857-x
Efimov A.E., Agapov I.I., Agapova O.I., Oleinikov V.A., Mezin A.V., Molinari M., Nabiev I., Mochalov K.E. A novel design of a scanning probe microscope integrated with an ultramicrotome for serial block-face nanotomography. Rev. Sci. Instrum. 2017. Vol. 88. P. 023701. https://doi.org/10.1063/1.4975202
Mochalov K.E., Chistyakov A.A., Solovyeva D.O., Mezin A.V., Oleinikov V.A., Vaskan I.S., Molinari M., Agapov I.I., Nabiev I., Efimov A.E. An instrumental approach to combining confocal microspectroscopy and 3D scanning probe nanotomography, Ultramicroscopy. 2017. Vol. 182. PP. 118–123. https://doi.org/10.1016/j.ultramic. 2017.06.022
Мочалов К., Чистяков А., Соловьева Д. и др. / Инструментальное объединение конфокальной микроспектроскопии и 3D-сканирующей зондовой нанотомографии // НАНОИНДУСТРИЯ. 2016. Т. 7. № 69. С. 60–71.
Научная статья
Флуоресцентная оптическая нанотомография: объединение техник флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения и ультрамикротомии
К.Е.Мочалов1, д.ф.-м.н., ст. науч. сотр., ORCID: 0000-0001-8157-9613
О.И.Агапова2, к.б.н., ст. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-4507-1852
И.И.Агапов2, д.б.н., зав. лаб., ORCID: 0000-0002-0273-4601
Д.С.Коржов1, 3, техник-лаборант, ORCID: 0009-0006-2626-1278
Д.О.Соловьева1, к.б.н., науч. сотр., ORCID: 0000-0002-2590-4204
С.В.Сизова1, к.х.н., науч. сотр., ORCID: 0000-0003-0846-4670
М.С.Шестопалова1, 3 инж.-иссл., ORCID: 0000-0001-6543-4289
В.А.Олейников1, 3, д.ф.-м.н., проф., зав. отд., ORCID: 0000-0003-4623-4913
А.Е.Ефимов2, д.б.н., гл. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-0769-301X / antefimov@gmail.com
Аннотация. Предложен метод 3D-TIRF-микроскопии, основанный на объединении методик ультрамикротомии и флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения поверхности образца после среза и позволяющий реконструировать трехмерную ультраструктуру объектов.
Ключевые слова: 3D-TIRF-микроскопия, трехмерная ультраструктура объектов
Для цитирования: К.Е. Мочалов, О.И. Агапова, И.И. Агапов, Д.С. Коржов, Д.О. Соловьева, С.В. Сизова, М.С. Шестопалова, В.А. Олейников, А.Е. Ефимов. Флуоресцентная оптическая нанотомография: объединение техник флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения и ультрамикротомии. НАНОИНДУСТРИЯ. 2024. Т. 17. № 7–8. С. 428–433. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.7-8.428.433.
Received: 17.10.2024 | Accepted: 21.10.2024 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.7-8.428.433
Original paper
FLUORESCENCE OPTICAL NANOTOMOGRAPHY:
COMBINING THE TECHNIQUES OF TOTAL INTERNAL REFLECTION FLUORESCENCE MICROSCOPY AND ULTRAMICROTOMY
K.E.Mochalov1, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Senior Researcher, ORCID: 0000-0001-8157-9613
O.I.Agapova2, Cand. of Sci. (Biology), Senior Researcher, ORCID: 0000-0002-4507-1852
I.I.Agapov2, Doct. of Sci. (Biology), Prof., Head of Laboratory, ORCID: 0000-0002-0273-4601
D.S.Korzhov1, 3, Technician, ORCID: 0009-0006-2626-1278
D.O.Solovyeva1, Cand. of Sci. (Biology), Researcher, ORCID: 0000-0002-2590-4204
S.V.Sizova1, Cand. of Sci. (Chemistry), Researcher, ORCID: 0000-0003-0846-4670
M.S.Shestopalova1, 3, Engineer Researcher, ORCID: 0000-0001-6543-4289
V.A.Oleinikov1, 3, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics),
Prof., Head of Department, ORCID: 0000-0003-4623-4913
A.E.Efimov2, Doct. of Sci. (Biology), Chief Researcher, ORCID: 0000-0002-0769-301X / antefimov@gmail.com
Abstract. A method of 3D-TIRF microscopy is proposed, based on combination of ultramicrotomy and total internal reflection fluorescence microscopy techniques of the sample surface after cutting, which allows reconstructing the three-dimensional ultrastructure of objects.
Keywords: 3D-TIRF microscopy, three-dimensional ultrastructure of objects
For citation: K.E. Mochalov, O.I. Agapova, I.I. Agapov, D.S. Korzhov, D.O. Solovyeva, S.V. Sizova, M.S. Shestopalova, V.A. Oleinikov, A.E. Efimov. Fluorescence optical nanotomography: combining the techniques of total internal reflection fluorescence microscopy and ultramicrotomy. NANOINDUSTRY. 2024. Vol. 17. No. 7–8. PP. 428–433. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.7-8.428.433.
ВВЕДЕНИЕ
Современные исследования и задачи в биомедицине, клеточной биологии и нанотехнологиях требуют постоянного усовершенствования и разработки новых методов микроскопии сверхвысокого разрешения. В настоящее время для трехмерной визуализации субклеточных процессов и структур применяются различные методы флуоресцентной и конфокальной микро- и наноскопии, однако предел разрешения, ограниченный дифракцией, во многих случаях не позволяет получить достаточно высокое разрешение для детальной визуализации исследуемых биологических структур [1, 2]. Аксиальное разрешение большинства существующих методик составляет несколько микрон, что существенно ниже по сравнению с их латеральным разрешением. Это препятствует возможности получения удовлетворительных трехмерных изображений ультраструктуры биологических образцов.
Одним из распространенных на данный момент способов достижения высокого аксиального разрешения является использование метода флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF, Total Internal Reflection Fluorescence microscopy), который нашел широкое применение в биологических исследованиях, позволяя получать достаточно детализированные и контрастные изображения [3, 4]. Пучок света в TIRF-микроскопии распространяется в направлении границы раздела сред, на поверхности которой в водной или воздушной среде находится тонкий слой образца. При падении плоской волны под сверхкритическим углом на границе разделов сред происходит возбуждение эванесцентной волны, возникающей в результате эффекта полного внутреннего отражения. Эванесцентная волна экспоненциально затухает, распространяясь в среде на глубину, обычно значительно меньшую длины волны излучения [5].
Следовательно, затухающее поле способно возбуждать флуорофоры только в тонком слое вблизи поверхности, и значительно увеличить аксиальное разрешение флуоресцентных изображений, что и обуславливает применение метода TIRF в биологических in vitro исследованиях на протяжении двух последних десятилетий [3, 4, 6].
Однако TIRF-микроскопия имеет и свои недостатки, одним из них является ограничение толщины исследуемой области образца, которая не должна превышать 100–200 нм, что накладывает ограничения на спектр задач, решаемых с помощью данной методики. И на сегодняшний день TIRF используется в основном для визуализации процессов, ассоциированных с плазматической мембраной клетки, таких как процессы секреции и эндоцитоза [7, 8], изучение взаимодействия лиганд-рецептор на клеточной поверхности [9, 10], картирования цитоплазматической мембраны [11, 12] или контактов клетки с подложкой. При этом для изучения большинства биологических процессов и моделей требуются значительное увеличение предельной глубины реконструкции флуоресцентного изображения, что вызывает необходимость развития подходов, позволяющих производить протяженное вдоль оптической оси послойное сканирование с последующей реконструкцией массива 2D-данных в 3D-изображение.
В данной работе предложен подход для решения вышеуказанной проблемы, основанный на объединении методик ультрамикротомии (выполнение последовательности сверхтонких срезов образца) и TIRF, что дает возможность визуализации 3D-ультраструктуры объектов на основе результатов послойного TIRF-сканирования (томографии) образца в режиме и в рамках единой измерительной процедуры. Совмещение методик возможно за счет ключевой особенности: использования специализированного алмазного ножа ультрамикротома как для получения физических срезов, так и в качестве TIRF-призмы.
3D-TIRF-СИСТЕМА
Основная техническая задача для реализации методики 3D-TIRF состояла в разработке специализированного прямого оптического флуоресцентного микроскопа и системы его сопряжения с ультрамикротомом (см. рис.1). Исходя из результатов предварительных расчетов, геометрия и оптические свойства ножа ультрамикротома (рис.2, поз.1) позволяют проводить возбуждение и сбор оптического сигнала с помощью объектива с числовой апертурой 0.75 и рабочим отрезком 5.2 мм (Mitutoyo Plan Apo HR Infinity Corrected × 50) (рис.2, поз.2). Возбуждающее излучение выходит из объектива и, проходя через внешнюю грань алмазного ножа, испытывает полное внутреннее отражение на его внутренней грани во всем угловом диапазоне падающих лучей. Таким образом, для данного объектива оказывается задействована вся его числовая апертура, что способствует повышению чувствительности флуоресцентной микроскопии и ее латерального разрешения. Условие полного внутреннего отражения во всем угловом диапазоне падающих лучей также будет выполняться при варьировании положения оптической оси объектива в диапазоне от 0° (вертикальное расположение, рис.2) до 45° (перпендикулярно первой грани ножа). Возможность широкого варьирования угла наклона оптической оси объектива по отношению к внешней грани алмазной призмы в вертикальной плоскости является важным параметром данной системы, увеличивающим ее адаптируемость под различные экспериментальные условия.
Исследуемый образец располагается на сканирующем XYZ-пьезосканере (рис.2 поз. 3), закрепленном на подвижной консоли ультрамикротома таким образом, что одна из его координат (X) параллельна кромке алмазного ножа. Данный пьезосканер был создан ранее коллективом авторов в ходе работы по созданию уникальной научной установки (УНУ – http://ckp-rf.ru/usu/486825/) [13–15]. Использование XYZ-пьезосканера системы как в качестве сканирующего устройства, так и в качестве устройства подвода образца обеспечивает высокоточное совмещение поверхности образца с гранью алмазного ножа. Перемещение с нанометровой точностью вдоль оси Z (перпендикулярно плоскости среза) позволяет зондировать экспоненциально затухающее поле, возбуждающее флуоресценцию (см. рис.3), с целью нахождения оптимальных соотношений между разрешением по глубине и интенсивностью TIRF-сигнала.
Для получения среза образца нож ультрамикротома должен располагаться под углом 2–10° к поверхности образца, что приводит к тому, что эффективное возбуждение TIRF возникает только в узкой полосе ("полоса контрастности") вблизи его кромки, где нож и образец находятся на наименьшем расстоянии друг от друга. Последовательность "полос контрастности", полученная при сканировании плоскости среза образца вдоль направления Y перпендикулярно кромке ножа, с использованием специального программного обеспечения, написанного в среде Piton 3.8, складывается в его 2D-флуоресцентное изображение. Набор 2D-флуоресцентных изображений, полученных в результате последовательных срезов и сканирований вдоль оси Y, далее преобразуется с помощью программы ImagePro Plus 6.0 в трехмерное флуоресцентное изображение исследуемого образца.
МАТЕРИАЛЫ
В качестве тестового образца для практического исследования возможностей микроскопии 3D-TIRF были выбраны полистирольные микросферы (ПСМ) диаметром 5 мкм, поверхность которых покрыта монослоем полупроводниковых флуоресцентных квантовых точек (КТ) структуры ядро/оболочка (CdSe/ZnS) с длиной волны испускаемой флуоресценции в районе 530 нм. Толщина флуоресцентного монослоя КТ соответствует их среднему диаметру порядка 7 нм. Таким образом можно считать, что исследуемым объектом является флуоресцентная сфера диаметром 5 мкм и бесконечно малой (относительно аксиального разрешения прибора) толщиной. Для проведения измерений массив ПСМ/КТ был залит в среду Ловикрил, позволяющую легко выполнять срезы ультрамикротомом и, соответственно, проводить их полную 3D-реконструкцию.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Первой задачей для валидации метода 3D-TIRF было сравнение теоретического и экспериментального распределений эванесцентного поля вдоль оси Z на образцах ПСМ/КТ, описанных выше. Для этого проводился срез экспериментального образца, после чего к плоскости среза подводилась кромка ножа ультрамикротома до появления отчетливой "полосы контрастности". Далее образец отводился от ножа с шагом в 10 нм и записывались флуоресцентные изображения образца в "полосе контрастности". Глубина проникновения поля оценивалась по относительной яркости изображений кластеров КТ на поверхности ПСМ. Теоретическая зависимость строилась для длины волны 436 нм, что соответствует одной из длин волн ртутной лампы, которой в дальнейшем проводилось возбуждение флуоресценции КТ. Сравнение этой зависимости и данных, полученных экспериментально, приведено на рис.3.
Из приведенных данных видно, что с точностью до погрешности измерений теоретическая и экспериментальная зависимости совпадают, что прежде всего говорит об адекватной работе созданной системы возбуждения/сбора флуоресценции в режиме TIRF. Кроме того, полученные экспериментальные зависимости в дальнейшем будут использоваться для подбора параметров проведения эксперимента и интерпретации его результатов.
Далее была выполнена трехмерная реконструкция образцов ПСМ/КТ. Для этого было получено 33 последовательных 2D-TIRF с шагом ультрамикротомирования 150 нм. Каждое 2D-TIRF изображение было получено в результате последовательной интеграции 256 горизонтальных линий пикселов – "полос контрастности" вблизи лезвия ножа, полученных при растровом сканировании образцом по оси Y с шагом 100 нм. На рис.4 (левая панель) показан пример одного из полученных интегрированных 2D-TIRF изображений. Получение каждого из изображений заняло около 40 с. Различимые на изображении круговые структуры соответствуют срезам отдельных микросфер, на поверхности которых находятся флуоресцирующие квантовые точки.
Серия полученных 2D-TIRF-изображений была обработана при помощи программного пакета ImagePro Plus 6.0 3DConstructor (Media Cybernetics, Inc., USA). Визуализация полученной трехмерной реконструкции представлена на рис.4 (правая панель). На ней различимы объекты сферической формы, полые внутри, что указывает на успешность трехмерной реконструкции с приемлемым аксиальным разрешением. Так же как и на 2D-изображении, можно отметить, что флуоресцентные квантовые точки на поверхности распределены неравномерно, большинство из них находятся в кластерах размерами до нескольких сотен нанометров.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Предлагаемый метод позволяет получать трехмерные TIRF-изображения с аксиальным разрешением лучше дифракционного предела – за счет детектирования флуоресценции, возбужденной экспоненциально затухающими волнами, возникающими при полном внутреннем отражении от ближайшей к образцу грани ножа. После получения оптического среза толщиной менее 100 нм, выполняется очередной физический сверхтонкий срез поверхности образца с помощью ультрамикротома. В результате многократного повторения данной процедуры, получается серия оптических срезов, на основе которой восстанавливается 3D-TIRF-изображение исследуемого объекта. Основным преимуществом описанного подхода является отсутствие принципиальных (за исключением общего времени проведения эксперимента) ограничений на количество выполняемых срезов, а значит, реконструкция изображения объектов происходит без потерь аксиального разрешения при теоретически не ограниченной глубине реконструкции.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект № 22-14-00168).
ЛИТЕРАТУРА
Dongre A., Weinberg R.A. New insights into the mechanisms of epithelial–mesenchymal transition and implications for cancer, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2019. Vol. 20. PP. 69–84. https://doi.org/10.1038/s41580-018-0080-4
Finkenstaedt-Quinn S.A., Qiu T.A., Shin K., Haynes C.L. Super-resolution imaging for monitoring cytoskeleton dynamics, Analyst. 2016. Vol. 141. PP. 5674–5688. https://doi.org/10.1039/C6AN 00731G
Axelrod D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy in Cell Biology, Traffic. 2001. Vol. 2. PP. 764–774. https://doi.org/10.1034/j.1600-0854.2001.21104.x
Poulter N.S., Pitkeathly W.T.E., Smith P.J., Rappoport J.Z. The physical basis of total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and its cellular applications, in: P. Verveer (Eds.), Advanced Fluorescence Microscopy. Methods in Molecular Biology, Humana Press, New York. 2014. PP. 1–23. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2080-8_1
Martin-Fernandez M.L., Tynan C.J., Webb S.E.D. A ‘pocket guide’ to total internal reflection fluorescence, J. Microsc. 2013. Vol. 252. PP. 16–22. https://doi.org/10.1111/jmi.12070
Mattheyses A.L., Simon S.M., Rappoport J.Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist, J. Cell. Sci. 2010. Vol. 123. PP. 3621–3628. https://doi.org/10.1242/jcs.056218
Stabley D.R., Oh T., Simon S.M., Mattheyses A.L., Salaita K. 2015. Real-time fluorescence imaging with 20 nm axial resolution. Nat. Commun. Vol. 6. P. 8307. https://doi.org/10.1038/ncomms9307
Trexler A.J., Sochacki K.A., Taraska J.W. Imaging the recruitment and loss of proteins and lipids at single sites of calcium-triggered exocytosis, Mol. iol. Cell. 2016. Vol. 27. PP. 2423–2434. https://doi.org/10.1091/mbc.E16-01-0057
Allikalt A., Purkayastha N., Flad K., Schmidt M.F., Tabor A., Gmeiner P., Hübner P., Weikert D. Fluorescent ligands for dopamine D2/D3 receptors. Sci. Rep. 2020. Vol. 10. P. 21842. https://doi.org/10.1038/s41598-020-78827-9
Tabor A., Möller D., Hübner Y., Kornhuber J., Gmeiner P. Visualization of ligand-induced dopamine D2S and D2L receptor internalization by TIRF microscopy. Sci. Rep. 2017. Vol. 7. P. 10894. https://doi.org/10.1038/s41598-017-11436-1
Sankaran J., Wohland T. Fluorescence strategies for mapping cell membrane dynamics and structures. APL Bioeng. 2020. Vol. 4. P. 020901. https://doi.org/10.1063/1.5143945
Lukeš T., Glatzová D., Kvíčalová Z., Levet F., Benda A., Letschert S., Sauer M., Brdička T. Lasser T., Cebecauer M. Quantifying protein densities on cell membranes using super-resolution optical fluctuation imaging. Nat. Commun. 2017. Vol. 8. P. 1731. https://doi.org/10.1038/s41467-017-01857-x
Efimov A.E., Agapov I.I., Agapova O.I., Oleinikov V.A., Mezin A.V., Molinari M., Nabiev I., Mochalov K.E. A novel design of a scanning probe microscope integrated with an ultramicrotome for serial block-face nanotomography. Rev. Sci. Instrum. 2017. Vol. 88. P. 023701. https://doi.org/10.1063/1.4975202
Mochalov K.E., Chistyakov A.A., Solovyeva D.O., Mezin A.V., Oleinikov V.A., Vaskan I.S., Molinari M., Agapov I.I., Nabiev I., Efimov A.E. An instrumental approach to combining confocal microspectroscopy and 3D scanning probe nanotomography, Ultramicroscopy. 2017. Vol. 182. PP. 118–123. https://doi.org/10.1016/j.ultramic. 2017.06.022
Мочалов К., Чистяков А., Соловьева Д. и др. / Инструментальное объединение конфокальной микроспектроскопии и 3D-сканирующей зондовой нанотомографии // НАНОИНДУСТРИЯ. 2016. Т. 7. № 69. С. 60–71.
Отзывы читателей
