eng
Выпуск #7-8/2024
А.В.Моисеенко, Н.А.Басалова, Д.В.Багров, Т.С.Трифонова, М.А.Виговский, У.Д.Дьячкова, О.А.Григорьева, Е.С.Новоселецкая, А.Ю.Ефименко, О.С.Соколова
ПРЯМАЯ ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ НА МЕМБРАНЕ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ/СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА МЕТОДОМ КРИОЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ
ПРЯМАЯ ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ НА МЕМБРАНЕ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ/СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА МЕТОДОМ КРИОЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ
Просмотры: 2280
| DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.7-8.434.443
Внеклеточные везикулы (ВВ) играют важную роль в межклеточной коммуникации и влияют на множество физиологических и патологических процессов. Мембранно-ассоциированные внеклеточные везикулы (МАВ) представляют собой особый малоизученный класс внеклеточных везикул. В данной работе продемонстрировано использование метода крио-электронной микроскопии (крио-ЭМ) для изучения МАВ, секретируемых мезенхимными стволовыми/стромальными клетками человека (МСК). С помощью крио-ЭМ удалось обнаружить везикулы с диаметром от 50 до 750 нм, расположенные вблизи поверхности клеток. Полученные результаты помогут в дальнейшем изучении физиологической роли МАВ и установлении их связи с клеточными мембранами.
Внеклеточные везикулы (ВВ) играют важную роль в межклеточной коммуникации и влияют на множество физиологических и патологических процессов. Мембранно-ассоциированные внеклеточные везикулы (МАВ) представляют собой особый малоизученный класс внеклеточных везикул. В данной работе продемонстрировано использование метода крио-электронной микроскопии (крио-ЭМ) для изучения МАВ, секретируемых мезенхимными стволовыми/стромальными клетками человека (МСК). С помощью крио-ЭМ удалось обнаружить везикулы с диаметром от 50 до 750 нм, расположенные вблизи поверхности клеток. Полученные результаты помогут в дальнейшем изучении физиологической роли МАВ и установлении их связи с клеточными мембранами.
Теги: cryo-electron microscopy extracellular vesicles membrane-associated vesicles stem cells внеклеточные везикулы криоэлектронная микроскопия мембранно-ассоциированные везикулы стволовые клетки
Получено: 8.10.2024 г. | Принято: 11.10.2024 г. | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.7-8.434.443
Научная статья
ПРЯМАЯ ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ НА МЕМБРАНЕ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ/СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА МЕТОДОМ КРИОЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ
А.В.Моисеенко1, науч. сотр., ORCID: 0000-0003-1112-2356
Н.А.Басалова2, к.б.н., мл. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-2597-8879
Д.В.Багров1, к.ф.-м.н., вед. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-6355-7282
Т.С.Трифонова1, лаборант-исследователь, ORCID: 0000-0003-2042-5244
М.А.Виговский2, лаборант-исследователь, ORCID: 0000-0003-2103-8158
У.Д.Дьячкова2, лаборант-исследователь, ORCID: 0000-0002-6119-8976
О.А.Григорьева2, к.б.н., ORCID: 0000-0003-2954-2420
Е.С.Новоселецкая2, к.б.н., ORCID: 0000-0002-0922-9157
А.Ю.Ефименко2, д.м.н., зав. лаб., ORCID: 0000-0002-0696-1369
О.С.Соколова1, д.б.н., проф., ORCID: 0000-0003-4678-232X / sokolova@mail.bio.msu.ru
Аннотация. Внеклеточные везикулы (ВВ) играют важную роль в межклеточной коммуникации и влияют на множество физиологических и патологических процессов. Мембранно-ассоциированные внеклеточные везикулы (МАВ) представляют собой особый малоизученный класс внеклеточных везикул. В данной работе продемонстрировано использование метода крио-электронной микроскопии (крио-ЭМ) для изучения МАВ, секретируемых мезенхимными стволовыми/стромальными клетками человека (МСК). С помощью крио-ЭМ удалось обнаружить везикулы с диаметром от 50 до 750 нм, расположенные вблизи поверхности клеток. Полученные результаты помогут в дальнейшем изучении физиологической роли МАВ и установлении их связи с клеточными мембранами.
Ключевые слова: криоэлектронная микроскопия, внеклеточные везикулы, мембранно-ассоциированные везикулы, стволовые клетки
Для цитирования: А.В. Моисеенко, Н.А. Басалова, Д.В. Багров, Т.С. Трифонова, М.А. Виговский, У.Д. Дьячкова, О.А. Григорьева, Е.С. Новоселецкая, А.Ю. Ефименко, О.С. Соколова. Прямая визуализация внеклеточных везикул на мембране мезенхимных стволовых/стромальных клеток человека методом криоэлектронной микроскопии. НАНОИНДУСТРИЯ. 2024. Т. 17. № 7–8. С. 434–443. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.7-8.434.443.
Received: 8.10.2024 | Accepted: 11.10.2024 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.7-8.434.443
Original paper
DIRECT VISUALIZATION OF EXTRACELLULAR VESICLES ON THE MEMBRANE OF HUMAN MESENCHYMAL STEM/STROMAL CELLS BY CRYO-ELECTRON MICROSCOPY
A.V.Moiseenko1, Researcher, ORCID: 0000-0003-1112-2356
N.A.Basalova2, Cand. of Sci. (Biology), Junior Research Assistant, ORCID: 0000-0002-2597-8879
D.V.Bagrov1, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Leading Researcher, ORCID: 0000-0002-6355-7282
T.S.Trifonova1, Laboratory assistant, ORCID: 0000-0003-2042-5244
M.A.Vigovsky2, Laboratory assistant, ORCID: 0000-0003-2103-8158
U.D.Dyachkova2, Laboratory assistant, ORCID: 0000-0002-6119-8976
O.A.Grigorieva2, Cand. of Sci. (Biology), ORCID: 0000-0003-2954-2420
E.S.Novoseletskaya2, Cand. of Sci. (Biology), ORCID: 0000-0002-0922-9157
A.Yu.Efimenko2, Doct. of Sci. (Physiology), Head of Laboratory, ORCID: 0000-0002-0696-1369
O.S.Sokolova1, Doct. of Sci. (Biology), Prof., ORCID: 0000-0003-4678-232X / sokolova@mail.bio.msu.ru
Abstract. Extracellular vesicles (EVs) play an important role in intercellular communication and influence a wide range of physiological and pathological processes. Membrane-associated extracellular vesicles (MAVs) represent a distinct and poorly understood class of EVs. This study demonstrates the application of cryo-electron microscopy (cryo-EM) to investigate MAVs secreted by human mesenchymal stem/stromal cells (MSCs). Cryo-EM revealed vesicles ranging in diameter from 50 to 750 nm located near the cell surface. The results obtained will facilitate further studies on the physiological role of MAVs and their association with cell membranes.
Keywords: cryo-electron microscopy, extracellular vesicles, membrane-associated vesicles, stem cells
For citation: A.V. Moiseenko, N.A. Basalova, D.V. Bagrov, T.S. Trifonova, M.A. Vigorsky, U.D. Dyachkova, O.A. Grigorieva, E.S. Novoseletskaya, A.Yu. Efimenko, O.S. Sokolova. Direct visualization of extracellular vesicles on the membrane of human mesenchymal stem/stromal cells by cryo-electron microscopy. NANOINDUSTRY. 2024. Vol. 17. No. 7–8. PP. 434–443. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.7-8.434.443.
ВВЕДЕНИЕ
Перенос биологически активных факторов в составе внеклеточных везикул (ВВ), секретируемых мезенхимными стволовыми/стромальными клетками (МСК), согласно современным данным, лежит в основе межклеточной коммуникации при реализации многих механизмов регенераторного действия этих клеток. Использование ВВ МСК рассматривают как перспективный терапевтический подход в лечении различных патологических процессов. Например, ВВ МСК могут стимулировать регенерацию тканей [1, 2], регулировать работу иммунной системы [3, 4], помочь в лечении фибротических, онкологических и инфекционных заболеваний [5, 6].
Термин "внеклеточные везикулы" относится к частицам, которые высвобождаются из клеток, ограниченных липидным бислоем; они не могут самостоятельно реплицироваться (т.е. не содержат функционального ядра) [7]. В настоящее время выделяют несколько классов ВВ (например, экзосомы, микровезикулы и апоптотические тельца). Однако классификация подтипов ВВ осложнена тем, что нет единого консенсуса специалистов из-за ограничений технических возможностей методов разделения разных подтипов [8].
На поверхности многих животных клеток существуют мембранные везикулоподобные частицы, размер которых варьируется от десятков нанометров до 1–2 мкм. Эти частицы долгое время рассматривались как предшественники ВВ (в частности, микровезикул или микрочастиц), которые прикреплены к мембране до момента высвобождения в межклеточное пространство. В настоящее время в русскоязычной литературе нет общепринятого термина для обозначения этих ВВ. Группа исследователей под руководством Йон Чена, в исследованиях которой был впервые описан данный класс ВВ для клеток человека (клетки эндотелия пупочного канатика (HUVEC), клетки гепатомы (HepG-2)), предложила термин cell-bound membrane vesicles [9], и далее нами будет использован термин "мембранно-ассоциированные везикулы" (МАВ). Было показано, что МАВ являются отдельным классом ВВ, так как у МАВ отсутствует солокализация с предполагаемыми поверхностными маркерами экзосом (белками CD31, CD63 и другими), они устойчивы к обработке детергентами, но растворимы в органических соединениях, кроме того, отсутствует самопроизвольное высвобождение МАВ с поверхности клеток.
На сегодняшний день структура, состав и функции МАВ все еще остаются малоизученными. В работах [9, 10] для визуализации МАВ использовали метод конфокальной микроскопии с дифференциальным интерференционным контрастом; кроме того, после открепления от мембраны детергентом их исследовали с помощью просвечивающей электронной микроскопии с негативным контрастированием и использованием метода динамического рассеяния света. По данным последнего, их средний размер составил 443±6 нм, что находится на пределе разрешения оптической микроскопии и, очевидно, ее использование не всегда позволяет увидеть ВВ. Была высказана гипотеза о применимости атомно-силовой микроскопии для визуализации МАВ на высушенных клетках [11], однако при этом могут возникать сложности с идентификацией лопнувших МАВ на изображениях. Таким образом, представляется перспективным развитие подходов, предполагающих минимальную обработку образцов и использование электронной микроскопии и, в частности, криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) для визуализации и изучения МАВ.
Этот метод подразумевает быструю заморозку образцов, находящихся на специальных металлических сетках, покрытых тонкой углеродной подложкой. Их особенность состоит в том, что в подложке присутствуют многочисленные отверстия; они могут быть расположены регулярно или хаотическим образом. Крио ЭМ с успехом используют для визуализации отдельных ВВ [12], целых клеток [13], а также изучения взаимодействия между эукариотическими клетками и вирусами, которые близки к ВВ по размерам [14].
Однако, использование крио ЭМ для визуализации МАВ непосредственно на клетках является новым подходом. Эксперименты, описанные в данной работе, могут заложить методическую основу для исследования физиологической роли МАВ. Кроме того, учитывая нарастающую заинтересованность медицины в применении ВВ от МСК человека в качестве терапевтического средства, описание механизмов и биологических свойств различных ВВ, продуцируемых данным типом клеток, является актуальной фундаментальной и прикладной задачей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культивирование клеток. В данной работе были использованы иммортализованные МСК, выделенные из жировой ткани человека (ATCC, ASC52telo). Линия клеток была предоставлена биобанком из коллекции Центра регенеративной медицины МНОИ МГУ имени М.В. Ломоносова, (https://human.depo.msu.ru). МСК были выращены на поверхности перфорированной тонкой углеродной подложки C-flat 1.2/1.3, закрепленной на золотой поддерживающей сеточке для электронной микроскопии (Protochips, США).
Для этого сеточки были размещены в лунках 12-луночного планшета и простерилизованы ультрафиолетом (3 раза по 30 мин в условиях стерильного ламинарного бокса). В каждую лунку планшета были высажены МСК в концентрации 40000 кл/лунка в среде ДМЕМ-Ф12 (Capricorn, Германия) с добавлением 7% фетальной бычьей сыворотки (Lacopa, Россия) и 1х пеницилина-стрептомицина (Gibco, США). Через сутки культивирования была проведена оценка состояния культуры с помощью фазово-контрастной микроскопии (Leica DM IL LED, Германия).
Крио-ЭМ. Перед заморозкой для крио-ЭМ сеточки отмывали в сбалансированном солевом буфере Хенкса (ПанЭко, Россия), после чего замораживали в жидком этане при температуре –180 °С в установке EM GP2 (Leica Microsystems, Германия). При этом излишки жидкости удаляли промакиванием фильтровальной бумагой Whatman #1 с тыльной стороны углеродной подложки продолжительностью 10 с. Это позволило минимизировать вероятность открепления клеток от поверхности подложки вследствие контакта с фильтровальной бумагой. Исследования методом крио-ЭМ производили на просвечивающем электронном микроскопе JEM-2100 (Jeol, Япония) при ускоряющем напряжении 200 кВ. Изображения были получены с помощью детектора прямого обнаружения электронов DE-20 (Direct Electron, США) в режиме накопления (integration), при номинальном дефокусе –10 мкм, суммарной дозе облучения каждой области съемки не более 20 е/А2 и при увеличении микроскопа, соответствующего размеру пикселя 5.7А на изображении. На полученных сериях изображений произведена коррекция дрейфа, гауссова фильтрация и коррекция контраста.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В результате проведенных экспериментов были отработаны протоколы посадки МСК на золотые сетки и подготовки образцов для дальнейшего изучения методом крио-ЭМ. Были получены фотографии в процессе культивирования МСК на золотых сетках (рис.1a). Клетки распластаны по поверхности углеродной пленки, покрывающей золотую сетку, и их края видны во многих ячейках. Далее, сетки с МСК подвергались быстрой заморозке. На рис.1b показано изображение края клетки, полученное методом крио-ЭМ. Видно, что углеродная подложка не сплошная, а содержит регулярно расположенные круглые отверстия с диаметром 1.2 мкм, заполненные льдом. На изображении клетка выглядит более темной, чем чистая подложка, также присутствуют небольшие фрагменты кристаллического льда, не препятствующие изучению периферийных областей клеток. На качественном уровне полученные нами изображения аналогичны изображениям, которые приводятся в литературе для клеток печени [15] или нейронов [16].
Изображения, полученные методом крио-ЭМ, обладают низким контрастом. Это вызвано тем, что исследуемые объекты состоят из атомов элементов с низким атомным номером, слабо рассеивающих электроны на большие углы. Кроме того, характерная толщина препарата для исследования в ПЭМ составляет порядка 50–100 нм (для аморфных биологических объектов, состоящих из атомов с низким атомным номером). Поэтому избыточная толщина даже периферийной области клеток представляет собой серьезный ограничивающий фактор. Для увеличения контраста мы использовали дефокусировку объективной линзы микроскопа, позволяющую усилить фазовый контраст на изображениях. Также для наглядности и удобства интерпретации изображений на них вручную выделяли цветом основные структуры, представляющие интерес.
Наиболее контрастные структуры, видимые на изображениях – это отверстия в углеродной подложке и частицы кристаллического льда, а представляющие интерес для анализа биологические структуры имеют низкий контраст. В данном исследовании нами впервые были получены изображения МАВ, продуцируемые МСК, методом крио-ЭМ. На краю клетки, где ее толщина минимальна, можно увидеть клеточную мембрану МСК и отдельные везикулы (рис.2). В некоторых случаях внутри клетки удавалось наблюдать вытянутые характерные структуры, пучки волокон, которые были интерпретированы как фибриллы актина. Аналогичные структуры наблюдались методом крио-ЭМ в катехоламинергических нейрональных клетках мыши [16] и кератиноцитах человека [17].
Клеточные мембраны обладают сравнительно высоким контрастом в крио-ЭМ, и это позволяет интерпретировать расположенные вблизи клеток частицы, окруженные мембраной, как ВВ. Нам удалось наблюдать везикулы разной геометрии, размером от 50 до 750 нм. Эти значения представляются реалистичными, с учетом общих представлений о размерах ВВ [8] и имеющихся данных о размерах МАВ [9, 10]. Многие ВВ содержали не один липидный бислой, а два (рис.3) или более. Наличие нескольких липидных бислоев может являться причиной устойчивости МАВ к детергентам. Однако, данное предположение необходимо подтвердить дополнительными экспериментами. Ранее метод крио-ЭМ позволил обнаружить аналогичные многослойные ВВ, выделенные из образцов различного происхождения [18, 19], их физиологическая роль не до конца ясна.
На полученных изображениях встречались как ВВ, непосредственно контактирующие с мембраной (рис.3), так и расположенные вблизи нее, на расстоянии менее 50 нм (рис.2). Наличие наблюдаемых частиц рядом с МСК может быть интерпретировано одним из трех способов.
Во-первых, это могут быть ВВ, секретируемые клеткой, которая находится в поле зрения. Во-вторых, это могут быть ВВ, которые были секретированы другой клеткой, а клетка, находящаяся в поле зрения, связала их на своей поверхности. На сегодняшний день большинство экспериментальных данных свидетельствует о том, что ВВ обычно интернализуются в эндосомальный компартмент путем эндоцитоза. Однако точные механизмы, управляющие эндоцитозом ВВ, остаются весьма спорными. Были предложены различные механизмы захвата ВВ клеткой-реципиентом, включая клатрин-опосредованный эндоцитоз, кавеолин – зависимый эндоцитоз, микропиноцитоз и фагоцитоз. Кроме того, была показана роль белков липидных рафтов и специфических белок-белковых взаимодействий в интернализации ВВ. Как правило, стыковке и последующему эндоцитозу ВВ способствуют белок-белковые взаимодействия с мембранными рецепторами, лигандами или контактными белками клеток-реципиентов. Такие белки, как тетраспанины, лектины, протеогликаны и интегрины могут быть вовлечены в эти специфические взаимодействия, влияющие на интернализацию ВВ [20]. Слияние – еще один путь интернализации ВВ, при котором мембрана ВВ непосредственно сливается с плазматической мембраной клетки-реципиента. Помимо интернализации, ВВ могут активировать внутриклеточные сигнальные пути путем прямого взаимодействия с поверхностными рецепторами или лигандами клеток-мишеней. Сигнализация ВВ может влиять на фенотип клеток через мембраносвязанные морфогены, такие как Wnt и лиганд Notch DII4. Также сигнализация ВВ может влиять на подвижность, миграцию и инвазивность опухолевых клеток [21].
Наконец, наблюдаемые нами ВВ могут быть МАВ в моменте биогенеза, связанные с поверхностью клетки, находящейся в поле зрения. Именно эта интерпретация представляется наиболее вероятной, поскольку перед замораживанием клеточная культура была отмыта от остатков культуральной среды, которые могли бы содержать свободно секретируемые ВВ.
Изображения, полученные в описываемых экспериментах, не позволяют однозначно выбрать одну из этих трех интерпретаций. Чтобы доказать, что наблюдаемые частицы действительно являются МАВ, представляются целесообразными несколько экспериментов. Во-первых, можно подавлять секрецию ВВ, чтобы исключить их из рассмотрения, однако добиться полного прекращения секреторной активности клетки крайне сложно. Во-вторых, можно обработать клетки ферментами или детергентами, чтобы открепить МАВ от их поверхности, и проанализировать состояние примембранного пространства после такой обработки. В-третьих, может быть полезно использование иммуномечения коллоидным золотом, которое поможет выявить частицы, имеющие на своей поверхности специфические белковые маркеры, чтобы уточнить происхождение этих частиц. Однако, для уточнения белковых маркеров специфических для МАВ, как отдельного подкласса ВВ, необходимы дополнительные исследования.
ВЫВОДЫ
ВВ являются сложным для исследования объектом из-за их гетерогенности и вариабельности [8], а МАВ представляются особенно сложным специфическим классом ВВ. Методы микроскопии высокого разрешения с успехом используются в исследованиях ВВ, и можно надеяться, что применение крио-ЭМ позволит лучше понять происхождение и физиологическую роль МАВ.
В данной работе мы впервые изучили возможность детекции МАВ на МСК человека и продемонстрировали, что метод крио-ЭМ выявляет ВВ, расположенные вблизи поверхности клеток или непосредственно на ней. Для этого клетки культивируют на золотой сетке для крио-ЭМ и замораживают целиком, а исследования проводят на краях распластанных клеток, где толщина цитоплазмы сравнительно мала и позволяет получать информативные изображения. Дальнейшие эксперименты по удалению МАВ с поверхности клеток с помощью ферментативной обработки и анализу полученных клеточных культур и выделенных МАВ методом крио-ЭМ, а также по иммуномечению этих объектов, помогут более полно интерпретировать получаемые изображения.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа выполнена при поддержке Междисциплинарной научно-образовательной школы Московского государственного университета "Молекулярные технологии живых систем и синтетическая биология" (#24-Ш04-14). Работа выполнена с использованием уникальной научной установки "Трехмерная электронная микроскопия и спектроскопия" Биологического факультета МГУ.
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Басалова Н.А., Джауари С.С., Юршев Ю.А., Примак А.Л., Ефименко А.Ю., Ткачук В.А., et al. State-of-the-art: применение внеклеточных везикул и препаратов на их основе для нейропротекции. Нейрохимия. 2023. Т. 40. No 4. С. 367–80.
Williams T., Salmanian G., Burns M., Maldonado V., Smith E., Porter R.M., et al. Versatility of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in tissue repair and regenerative applications International Society for Cellular Therapy. Biochimie [Internet]. 2023. Vol. 207. PP. 33–48. https://doi.org/10.1016/j.biochi.2022.11.011
Wang J., Xia J., Huang R., Hu Y., Fan J., Shu Q., et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles alter disease outcomes via endorsement of macrophage polarization. Stem Cell Res Ther. 2020. Vol. 11. No. 1. PP. 1–12.
Guo L., Lai P., Wang Y., Huang T., Chen X., Geng S. International Immunopharmacology Extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells prevent skin fibrosis in the cGVHD mouse model by suppressing the activation of macrophages and B cells immune response. Int Immunopharmacol [Internet]. 2020. Vol. 84. No. 4. P. 106541. https://doi.org/10.1016/j.intimp. 2020.106541
Basalova N., Arbatskiy M., Popov V., Grigorieva O., Vigovskiy M., Zaytsev I., et al. Mesenchymal stromal cells facilitate resolution of pulmonary fibrosis by miR-29c and miR-129 intercellular transfer. Exp Mol Med. 2023. Vol. 55. No. 7. PP. 1399–412.
Manzoor T., Saleem A., Farooq N., Dar L.A., Nazir J., Saleem S., et al. Extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells – a novel therapeutic tool in infectious diseases. Inflamm Regen [Internet]. 2023. Vol. 43. https://doi.org/10.1186/s41232-023-00266-6
Welsh J.A., Arkesteijn G.J.A., Giebel B., Bremer M., Cimorelli M., Rond L. De., et al. A compendium of single extracellular vesicle flow cytometry. J Extracell Vesicles. 2023. Vol. 12. No. 11.
Welsh J.A, Buzas E.I., Blenkiron C., Driscoll L.O., Cai H., Bussolati B., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 2024. Vol. 13. No. 2.
Tang Q., Zhang X., Zhang W., Zhao S., Chen Y. Identification and characterization of cell-bound membrane vesicles. Biochim Biophys Acta – Biomembr [Internet]. 2017. Vol. 1859. No. 5. PP. 756–66. http://dx.doi.org/10.1016/j.bbamem.2017.01.013
Zhou Y., Qin Y., Sun C., Liu K., Zhang W., Gaman M.-A. Cell-bound membrane vesicles contain antioxidative proteins and probably have an antioxidative function in cells or a therapeutic potential. J Drug Deliv Sci Technol. 2023. Vol. 81.
Zhang X., Chen Y., Chen Y. An AFM-based pit-measuring method for indirect measurements of cell-surface membrane vesicles. Biochem Biophys Res Commun [Internet]. 2014. Vol. 446. No. 1. PP. 375–9. http://dx.doi.org/10.1016/j.bbrc. 2014.02.114
Linares R., Tan S., Gounou C., Brisson A.R. Imaging and Quantification of Extracellular Vesicles by Transmission Electron Microscopy. Methods Mol Biol. 2017. Vol. 1545. PP. 43–54.
Medalia O., Weber I., Frangakis A.S., Nicastro D., Baumeister W. Macromolecular Architecture in Eukaryotic Cells Visualized by Cryoelectron Tomography. Science. 2002. Vol. 298. No. 11. PP. 1209–13.
Hampton C.M., Strauss J.D., Ke Z., Dillard R.S., Jason E., Alonas E., et al. Correlated fluorescence microscopy and cryo-electron tomography of virus-infected or transfected mammalian cells. Nat Protoc. 2017. Vol. 12. No. 1. PP. 150–67.
Braet F., Bomans P., Wisse E., Frederik P. The observation of intact hepatic endothelial cells by cryo-electron microscopy. J Microsc. 2003. Vol. 212. PP. 175–85.
Sartori-rupp A., Cervantes D.C., Pepe A., Gousset K., Delage E., Corroyer-dulmont S., et al. Correlative cryo-electron microscopy reveals the structure of TNTs in neuronal cells. Nat Commun [Internet]. 2019. Vol. 10. PP. 1–16. http://dx.doi.org/10.1038/s41467-018-08178-7
Sartori A., Gatz R., Beck F., Rigort A., Baumeister W., Plitzko J.M. Correlative microscopy : Bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography. J Struct Biol. 2007. Vol. 160. No. 2. PP. 135–45.
Emelyanov A., Shtam T., Kamyshinsky R., Garaeva L., Verlov N., Miliukhina I., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid. PLoS One. 2020. Vol. 15. No. 1. PP. 1–11.
Skryabin G.O., Komelkov A.V., Zhordania K.I., Bagrov D.V., Enikeev A.D., Galetsky S.A., et al. Integrated miRNA Profiling of Extracellular Vesicles from Uterine Aspirates , Malignant Ascites and Primary-Cultured Ascites Cells for Ovarian Cancer Screening. Pharmaceutics. 2024. Vol. 16. No. 7.
Kwok Z.H., Wang C., Jin Y. Extracellular Vesicle Transportation and Uptake by Recipient Cells : A Critical Process to Regulate Human Diseases. Process. 2021. Vol. 9. No. 2.
Liu Y.J., Wang C. A review of the regulatory mechanisms of extracellular vesicles ‑ mediated intercellular communication. Cell Commun Signal [Internet]. 2023. Vol. 21. No. 1. PP. 1–12. https://doi.org/10.1186/s12964-023-01103-6
Научная статья
ПРЯМАЯ ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ НА МЕМБРАНЕ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ/СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА МЕТОДОМ КРИОЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ
А.В.Моисеенко1, науч. сотр., ORCID: 0000-0003-1112-2356
Н.А.Басалова2, к.б.н., мл. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-2597-8879
Д.В.Багров1, к.ф.-м.н., вед. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-6355-7282
Т.С.Трифонова1, лаборант-исследователь, ORCID: 0000-0003-2042-5244
М.А.Виговский2, лаборант-исследователь, ORCID: 0000-0003-2103-8158
У.Д.Дьячкова2, лаборант-исследователь, ORCID: 0000-0002-6119-8976
О.А.Григорьева2, к.б.н., ORCID: 0000-0003-2954-2420
Е.С.Новоселецкая2, к.б.н., ORCID: 0000-0002-0922-9157
А.Ю.Ефименко2, д.м.н., зав. лаб., ORCID: 0000-0002-0696-1369
О.С.Соколова1, д.б.н., проф., ORCID: 0000-0003-4678-232X / sokolova@mail.bio.msu.ru
Аннотация. Внеклеточные везикулы (ВВ) играют важную роль в межклеточной коммуникации и влияют на множество физиологических и патологических процессов. Мембранно-ассоциированные внеклеточные везикулы (МАВ) представляют собой особый малоизученный класс внеклеточных везикул. В данной работе продемонстрировано использование метода крио-электронной микроскопии (крио-ЭМ) для изучения МАВ, секретируемых мезенхимными стволовыми/стромальными клетками человека (МСК). С помощью крио-ЭМ удалось обнаружить везикулы с диаметром от 50 до 750 нм, расположенные вблизи поверхности клеток. Полученные результаты помогут в дальнейшем изучении физиологической роли МАВ и установлении их связи с клеточными мембранами.
Ключевые слова: криоэлектронная микроскопия, внеклеточные везикулы, мембранно-ассоциированные везикулы, стволовые клетки
Для цитирования: А.В. Моисеенко, Н.А. Басалова, Д.В. Багров, Т.С. Трифонова, М.А. Виговский, У.Д. Дьячкова, О.А. Григорьева, Е.С. Новоселецкая, А.Ю. Ефименко, О.С. Соколова. Прямая визуализация внеклеточных везикул на мембране мезенхимных стволовых/стромальных клеток человека методом криоэлектронной микроскопии. НАНОИНДУСТРИЯ. 2024. Т. 17. № 7–8. С. 434–443. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.7-8.434.443.
Received: 8.10.2024 | Accepted: 11.10.2024 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.7-8.434.443
Original paper
DIRECT VISUALIZATION OF EXTRACELLULAR VESICLES ON THE MEMBRANE OF HUMAN MESENCHYMAL STEM/STROMAL CELLS BY CRYO-ELECTRON MICROSCOPY
A.V.Moiseenko1, Researcher, ORCID: 0000-0003-1112-2356
N.A.Basalova2, Cand. of Sci. (Biology), Junior Research Assistant, ORCID: 0000-0002-2597-8879
D.V.Bagrov1, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Leading Researcher, ORCID: 0000-0002-6355-7282
T.S.Trifonova1, Laboratory assistant, ORCID: 0000-0003-2042-5244
M.A.Vigovsky2, Laboratory assistant, ORCID: 0000-0003-2103-8158
U.D.Dyachkova2, Laboratory assistant, ORCID: 0000-0002-6119-8976
O.A.Grigorieva2, Cand. of Sci. (Biology), ORCID: 0000-0003-2954-2420
E.S.Novoseletskaya2, Cand. of Sci. (Biology), ORCID: 0000-0002-0922-9157
A.Yu.Efimenko2, Doct. of Sci. (Physiology), Head of Laboratory, ORCID: 0000-0002-0696-1369
O.S.Sokolova1, Doct. of Sci. (Biology), Prof., ORCID: 0000-0003-4678-232X / sokolova@mail.bio.msu.ru
Abstract. Extracellular vesicles (EVs) play an important role in intercellular communication and influence a wide range of physiological and pathological processes. Membrane-associated extracellular vesicles (MAVs) represent a distinct and poorly understood class of EVs. This study demonstrates the application of cryo-electron microscopy (cryo-EM) to investigate MAVs secreted by human mesenchymal stem/stromal cells (MSCs). Cryo-EM revealed vesicles ranging in diameter from 50 to 750 nm located near the cell surface. The results obtained will facilitate further studies on the physiological role of MAVs and their association with cell membranes.
Keywords: cryo-electron microscopy, extracellular vesicles, membrane-associated vesicles, stem cells
For citation: A.V. Moiseenko, N.A. Basalova, D.V. Bagrov, T.S. Trifonova, M.A. Vigorsky, U.D. Dyachkova, O.A. Grigorieva, E.S. Novoseletskaya, A.Yu. Efimenko, O.S. Sokolova. Direct visualization of extracellular vesicles on the membrane of human mesenchymal stem/stromal cells by cryo-electron microscopy. NANOINDUSTRY. 2024. Vol. 17. No. 7–8. PP. 434–443. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.7-8.434.443.
ВВЕДЕНИЕ
Перенос биологически активных факторов в составе внеклеточных везикул (ВВ), секретируемых мезенхимными стволовыми/стромальными клетками (МСК), согласно современным данным, лежит в основе межклеточной коммуникации при реализации многих механизмов регенераторного действия этих клеток. Использование ВВ МСК рассматривают как перспективный терапевтический подход в лечении различных патологических процессов. Например, ВВ МСК могут стимулировать регенерацию тканей [1, 2], регулировать работу иммунной системы [3, 4], помочь в лечении фибротических, онкологических и инфекционных заболеваний [5, 6].
Термин "внеклеточные везикулы" относится к частицам, которые высвобождаются из клеток, ограниченных липидным бислоем; они не могут самостоятельно реплицироваться (т.е. не содержат функционального ядра) [7]. В настоящее время выделяют несколько классов ВВ (например, экзосомы, микровезикулы и апоптотические тельца). Однако классификация подтипов ВВ осложнена тем, что нет единого консенсуса специалистов из-за ограничений технических возможностей методов разделения разных подтипов [8].
На поверхности многих животных клеток существуют мембранные везикулоподобные частицы, размер которых варьируется от десятков нанометров до 1–2 мкм. Эти частицы долгое время рассматривались как предшественники ВВ (в частности, микровезикул или микрочастиц), которые прикреплены к мембране до момента высвобождения в межклеточное пространство. В настоящее время в русскоязычной литературе нет общепринятого термина для обозначения этих ВВ. Группа исследователей под руководством Йон Чена, в исследованиях которой был впервые описан данный класс ВВ для клеток человека (клетки эндотелия пупочного канатика (HUVEC), клетки гепатомы (HepG-2)), предложила термин cell-bound membrane vesicles [9], и далее нами будет использован термин "мембранно-ассоциированные везикулы" (МАВ). Было показано, что МАВ являются отдельным классом ВВ, так как у МАВ отсутствует солокализация с предполагаемыми поверхностными маркерами экзосом (белками CD31, CD63 и другими), они устойчивы к обработке детергентами, но растворимы в органических соединениях, кроме того, отсутствует самопроизвольное высвобождение МАВ с поверхности клеток.
На сегодняшний день структура, состав и функции МАВ все еще остаются малоизученными. В работах [9, 10] для визуализации МАВ использовали метод конфокальной микроскопии с дифференциальным интерференционным контрастом; кроме того, после открепления от мембраны детергентом их исследовали с помощью просвечивающей электронной микроскопии с негативным контрастированием и использованием метода динамического рассеяния света. По данным последнего, их средний размер составил 443±6 нм, что находится на пределе разрешения оптической микроскопии и, очевидно, ее использование не всегда позволяет увидеть ВВ. Была высказана гипотеза о применимости атомно-силовой микроскопии для визуализации МАВ на высушенных клетках [11], однако при этом могут возникать сложности с идентификацией лопнувших МАВ на изображениях. Таким образом, представляется перспективным развитие подходов, предполагающих минимальную обработку образцов и использование электронной микроскопии и, в частности, криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) для визуализации и изучения МАВ.
Этот метод подразумевает быструю заморозку образцов, находящихся на специальных металлических сетках, покрытых тонкой углеродной подложкой. Их особенность состоит в том, что в подложке присутствуют многочисленные отверстия; они могут быть расположены регулярно или хаотическим образом. Крио ЭМ с успехом используют для визуализации отдельных ВВ [12], целых клеток [13], а также изучения взаимодействия между эукариотическими клетками и вирусами, которые близки к ВВ по размерам [14].
Однако, использование крио ЭМ для визуализации МАВ непосредственно на клетках является новым подходом. Эксперименты, описанные в данной работе, могут заложить методическую основу для исследования физиологической роли МАВ. Кроме того, учитывая нарастающую заинтересованность медицины в применении ВВ от МСК человека в качестве терапевтического средства, описание механизмов и биологических свойств различных ВВ, продуцируемых данным типом клеток, является актуальной фундаментальной и прикладной задачей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культивирование клеток. В данной работе были использованы иммортализованные МСК, выделенные из жировой ткани человека (ATCC, ASC52telo). Линия клеток была предоставлена биобанком из коллекции Центра регенеративной медицины МНОИ МГУ имени М.В. Ломоносова, (https://human.depo.msu.ru). МСК были выращены на поверхности перфорированной тонкой углеродной подложки C-flat 1.2/1.3, закрепленной на золотой поддерживающей сеточке для электронной микроскопии (Protochips, США).
Для этого сеточки были размещены в лунках 12-луночного планшета и простерилизованы ультрафиолетом (3 раза по 30 мин в условиях стерильного ламинарного бокса). В каждую лунку планшета были высажены МСК в концентрации 40000 кл/лунка в среде ДМЕМ-Ф12 (Capricorn, Германия) с добавлением 7% фетальной бычьей сыворотки (Lacopa, Россия) и 1х пеницилина-стрептомицина (Gibco, США). Через сутки культивирования была проведена оценка состояния культуры с помощью фазово-контрастной микроскопии (Leica DM IL LED, Германия).
Крио-ЭМ. Перед заморозкой для крио-ЭМ сеточки отмывали в сбалансированном солевом буфере Хенкса (ПанЭко, Россия), после чего замораживали в жидком этане при температуре –180 °С в установке EM GP2 (Leica Microsystems, Германия). При этом излишки жидкости удаляли промакиванием фильтровальной бумагой Whatman #1 с тыльной стороны углеродной подложки продолжительностью 10 с. Это позволило минимизировать вероятность открепления клеток от поверхности подложки вследствие контакта с фильтровальной бумагой. Исследования методом крио-ЭМ производили на просвечивающем электронном микроскопе JEM-2100 (Jeol, Япония) при ускоряющем напряжении 200 кВ. Изображения были получены с помощью детектора прямого обнаружения электронов DE-20 (Direct Electron, США) в режиме накопления (integration), при номинальном дефокусе –10 мкм, суммарной дозе облучения каждой области съемки не более 20 е/А2 и при увеличении микроскопа, соответствующего размеру пикселя 5.7А на изображении. На полученных сериях изображений произведена коррекция дрейфа, гауссова фильтрация и коррекция контраста.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В результате проведенных экспериментов были отработаны протоколы посадки МСК на золотые сетки и подготовки образцов для дальнейшего изучения методом крио-ЭМ. Были получены фотографии в процессе культивирования МСК на золотых сетках (рис.1a). Клетки распластаны по поверхности углеродной пленки, покрывающей золотую сетку, и их края видны во многих ячейках. Далее, сетки с МСК подвергались быстрой заморозке. На рис.1b показано изображение края клетки, полученное методом крио-ЭМ. Видно, что углеродная подложка не сплошная, а содержит регулярно расположенные круглые отверстия с диаметром 1.2 мкм, заполненные льдом. На изображении клетка выглядит более темной, чем чистая подложка, также присутствуют небольшие фрагменты кристаллического льда, не препятствующие изучению периферийных областей клеток. На качественном уровне полученные нами изображения аналогичны изображениям, которые приводятся в литературе для клеток печени [15] или нейронов [16].
Изображения, полученные методом крио-ЭМ, обладают низким контрастом. Это вызвано тем, что исследуемые объекты состоят из атомов элементов с низким атомным номером, слабо рассеивающих электроны на большие углы. Кроме того, характерная толщина препарата для исследования в ПЭМ составляет порядка 50–100 нм (для аморфных биологических объектов, состоящих из атомов с низким атомным номером). Поэтому избыточная толщина даже периферийной области клеток представляет собой серьезный ограничивающий фактор. Для увеличения контраста мы использовали дефокусировку объективной линзы микроскопа, позволяющую усилить фазовый контраст на изображениях. Также для наглядности и удобства интерпретации изображений на них вручную выделяли цветом основные структуры, представляющие интерес.
Наиболее контрастные структуры, видимые на изображениях – это отверстия в углеродной подложке и частицы кристаллического льда, а представляющие интерес для анализа биологические структуры имеют низкий контраст. В данном исследовании нами впервые были получены изображения МАВ, продуцируемые МСК, методом крио-ЭМ. На краю клетки, где ее толщина минимальна, можно увидеть клеточную мембрану МСК и отдельные везикулы (рис.2). В некоторых случаях внутри клетки удавалось наблюдать вытянутые характерные структуры, пучки волокон, которые были интерпретированы как фибриллы актина. Аналогичные структуры наблюдались методом крио-ЭМ в катехоламинергических нейрональных клетках мыши [16] и кератиноцитах человека [17].
Клеточные мембраны обладают сравнительно высоким контрастом в крио-ЭМ, и это позволяет интерпретировать расположенные вблизи клеток частицы, окруженные мембраной, как ВВ. Нам удалось наблюдать везикулы разной геометрии, размером от 50 до 750 нм. Эти значения представляются реалистичными, с учетом общих представлений о размерах ВВ [8] и имеющихся данных о размерах МАВ [9, 10]. Многие ВВ содержали не один липидный бислой, а два (рис.3) или более. Наличие нескольких липидных бислоев может являться причиной устойчивости МАВ к детергентам. Однако, данное предположение необходимо подтвердить дополнительными экспериментами. Ранее метод крио-ЭМ позволил обнаружить аналогичные многослойные ВВ, выделенные из образцов различного происхождения [18, 19], их физиологическая роль не до конца ясна.
На полученных изображениях встречались как ВВ, непосредственно контактирующие с мембраной (рис.3), так и расположенные вблизи нее, на расстоянии менее 50 нм (рис.2). Наличие наблюдаемых частиц рядом с МСК может быть интерпретировано одним из трех способов.
Во-первых, это могут быть ВВ, секретируемые клеткой, которая находится в поле зрения. Во-вторых, это могут быть ВВ, которые были секретированы другой клеткой, а клетка, находящаяся в поле зрения, связала их на своей поверхности. На сегодняшний день большинство экспериментальных данных свидетельствует о том, что ВВ обычно интернализуются в эндосомальный компартмент путем эндоцитоза. Однако точные механизмы, управляющие эндоцитозом ВВ, остаются весьма спорными. Были предложены различные механизмы захвата ВВ клеткой-реципиентом, включая клатрин-опосредованный эндоцитоз, кавеолин – зависимый эндоцитоз, микропиноцитоз и фагоцитоз. Кроме того, была показана роль белков липидных рафтов и специфических белок-белковых взаимодействий в интернализации ВВ. Как правило, стыковке и последующему эндоцитозу ВВ способствуют белок-белковые взаимодействия с мембранными рецепторами, лигандами или контактными белками клеток-реципиентов. Такие белки, как тетраспанины, лектины, протеогликаны и интегрины могут быть вовлечены в эти специфические взаимодействия, влияющие на интернализацию ВВ [20]. Слияние – еще один путь интернализации ВВ, при котором мембрана ВВ непосредственно сливается с плазматической мембраной клетки-реципиента. Помимо интернализации, ВВ могут активировать внутриклеточные сигнальные пути путем прямого взаимодействия с поверхностными рецепторами или лигандами клеток-мишеней. Сигнализация ВВ может влиять на фенотип клеток через мембраносвязанные морфогены, такие как Wnt и лиганд Notch DII4. Также сигнализация ВВ может влиять на подвижность, миграцию и инвазивность опухолевых клеток [21].
Наконец, наблюдаемые нами ВВ могут быть МАВ в моменте биогенеза, связанные с поверхностью клетки, находящейся в поле зрения. Именно эта интерпретация представляется наиболее вероятной, поскольку перед замораживанием клеточная культура была отмыта от остатков культуральной среды, которые могли бы содержать свободно секретируемые ВВ.
Изображения, полученные в описываемых экспериментах, не позволяют однозначно выбрать одну из этих трех интерпретаций. Чтобы доказать, что наблюдаемые частицы действительно являются МАВ, представляются целесообразными несколько экспериментов. Во-первых, можно подавлять секрецию ВВ, чтобы исключить их из рассмотрения, однако добиться полного прекращения секреторной активности клетки крайне сложно. Во-вторых, можно обработать клетки ферментами или детергентами, чтобы открепить МАВ от их поверхности, и проанализировать состояние примембранного пространства после такой обработки. В-третьих, может быть полезно использование иммуномечения коллоидным золотом, которое поможет выявить частицы, имеющие на своей поверхности специфические белковые маркеры, чтобы уточнить происхождение этих частиц. Однако, для уточнения белковых маркеров специфических для МАВ, как отдельного подкласса ВВ, необходимы дополнительные исследования.
ВЫВОДЫ
ВВ являются сложным для исследования объектом из-за их гетерогенности и вариабельности [8], а МАВ представляются особенно сложным специфическим классом ВВ. Методы микроскопии высокого разрешения с успехом используются в исследованиях ВВ, и можно надеяться, что применение крио-ЭМ позволит лучше понять происхождение и физиологическую роль МАВ.
В данной работе мы впервые изучили возможность детекции МАВ на МСК человека и продемонстрировали, что метод крио-ЭМ выявляет ВВ, расположенные вблизи поверхности клеток или непосредственно на ней. Для этого клетки культивируют на золотой сетке для крио-ЭМ и замораживают целиком, а исследования проводят на краях распластанных клеток, где толщина цитоплазмы сравнительно мала и позволяет получать информативные изображения. Дальнейшие эксперименты по удалению МАВ с поверхности клеток с помощью ферментативной обработки и анализу полученных клеточных культур и выделенных МАВ методом крио-ЭМ, а также по иммуномечению этих объектов, помогут более полно интерпретировать получаемые изображения.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа выполнена при поддержке Междисциплинарной научно-образовательной школы Московского государственного университета "Молекулярные технологии живых систем и синтетическая биология" (#24-Ш04-14). Работа выполнена с использованием уникальной научной установки "Трехмерная электронная микроскопия и спектроскопия" Биологического факультета МГУ.
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Басалова Н.А., Джауари С.С., Юршев Ю.А., Примак А.Л., Ефименко А.Ю., Ткачук В.А., et al. State-of-the-art: применение внеклеточных везикул и препаратов на их основе для нейропротекции. Нейрохимия. 2023. Т. 40. No 4. С. 367–80.
Williams T., Salmanian G., Burns M., Maldonado V., Smith E., Porter R.M., et al. Versatility of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in tissue repair and regenerative applications International Society for Cellular Therapy. Biochimie [Internet]. 2023. Vol. 207. PP. 33–48. https://doi.org/10.1016/j.biochi.2022.11.011
Wang J., Xia J., Huang R., Hu Y., Fan J., Shu Q., et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles alter disease outcomes via endorsement of macrophage polarization. Stem Cell Res Ther. 2020. Vol. 11. No. 1. PP. 1–12.
Guo L., Lai P., Wang Y., Huang T., Chen X., Geng S. International Immunopharmacology Extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells prevent skin fibrosis in the cGVHD mouse model by suppressing the activation of macrophages and B cells immune response. Int Immunopharmacol [Internet]. 2020. Vol. 84. No. 4. P. 106541. https://doi.org/10.1016/j.intimp. 2020.106541
Basalova N., Arbatskiy M., Popov V., Grigorieva O., Vigovskiy M., Zaytsev I., et al. Mesenchymal stromal cells facilitate resolution of pulmonary fibrosis by miR-29c and miR-129 intercellular transfer. Exp Mol Med. 2023. Vol. 55. No. 7. PP. 1399–412.
Manzoor T., Saleem A., Farooq N., Dar L.A., Nazir J., Saleem S., et al. Extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells – a novel therapeutic tool in infectious diseases. Inflamm Regen [Internet]. 2023. Vol. 43. https://doi.org/10.1186/s41232-023-00266-6
Welsh J.A., Arkesteijn G.J.A., Giebel B., Bremer M., Cimorelli M., Rond L. De., et al. A compendium of single extracellular vesicle flow cytometry. J Extracell Vesicles. 2023. Vol. 12. No. 11.
Welsh J.A, Buzas E.I., Blenkiron C., Driscoll L.O., Cai H., Bussolati B., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 2024. Vol. 13. No. 2.
Tang Q., Zhang X., Zhang W., Zhao S., Chen Y. Identification and characterization of cell-bound membrane vesicles. Biochim Biophys Acta – Biomembr [Internet]. 2017. Vol. 1859. No. 5. PP. 756–66. http://dx.doi.org/10.1016/j.bbamem.2017.01.013
Zhou Y., Qin Y., Sun C., Liu K., Zhang W., Gaman M.-A. Cell-bound membrane vesicles contain antioxidative proteins and probably have an antioxidative function in cells or a therapeutic potential. J Drug Deliv Sci Technol. 2023. Vol. 81.
Zhang X., Chen Y., Chen Y. An AFM-based pit-measuring method for indirect measurements of cell-surface membrane vesicles. Biochem Biophys Res Commun [Internet]. 2014. Vol. 446. No. 1. PP. 375–9. http://dx.doi.org/10.1016/j.bbrc. 2014.02.114
Linares R., Tan S., Gounou C., Brisson A.R. Imaging and Quantification of Extracellular Vesicles by Transmission Electron Microscopy. Methods Mol Biol. 2017. Vol. 1545. PP. 43–54.
Medalia O., Weber I., Frangakis A.S., Nicastro D., Baumeister W. Macromolecular Architecture in Eukaryotic Cells Visualized by Cryoelectron Tomography. Science. 2002. Vol. 298. No. 11. PP. 1209–13.
Hampton C.M., Strauss J.D., Ke Z., Dillard R.S., Jason E., Alonas E., et al. Correlated fluorescence microscopy and cryo-electron tomography of virus-infected or transfected mammalian cells. Nat Protoc. 2017. Vol. 12. No. 1. PP. 150–67.
Braet F., Bomans P., Wisse E., Frederik P. The observation of intact hepatic endothelial cells by cryo-electron microscopy. J Microsc. 2003. Vol. 212. PP. 175–85.
Sartori-rupp A., Cervantes D.C., Pepe A., Gousset K., Delage E., Corroyer-dulmont S., et al. Correlative cryo-electron microscopy reveals the structure of TNTs in neuronal cells. Nat Commun [Internet]. 2019. Vol. 10. PP. 1–16. http://dx.doi.org/10.1038/s41467-018-08178-7
Sartori A., Gatz R., Beck F., Rigort A., Baumeister W., Plitzko J.M. Correlative microscopy : Bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography. J Struct Biol. 2007. Vol. 160. No. 2. PP. 135–45.
Emelyanov A., Shtam T., Kamyshinsky R., Garaeva L., Verlov N., Miliukhina I., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid. PLoS One. 2020. Vol. 15. No. 1. PP. 1–11.
Skryabin G.O., Komelkov A.V., Zhordania K.I., Bagrov D.V., Enikeev A.D., Galetsky S.A., et al. Integrated miRNA Profiling of Extracellular Vesicles from Uterine Aspirates , Malignant Ascites and Primary-Cultured Ascites Cells for Ovarian Cancer Screening. Pharmaceutics. 2024. Vol. 16. No. 7.
Kwok Z.H., Wang C., Jin Y. Extracellular Vesicle Transportation and Uptake by Recipient Cells : A Critical Process to Regulate Human Diseases. Process. 2021. Vol. 9. No. 2.
Liu Y.J., Wang C. A review of the regulatory mechanisms of extracellular vesicles ‑ mediated intercellular communication. Cell Commun Signal [Internet]. 2023. Vol. 21. No. 1. PP. 1–12. https://doi.org/10.1186/s12964-023-01103-6
Отзывы читателей
