eng
Выпуск #6/2025
А.И.Ахметова, Л.В.Кордюкова, И.В.Яминский
ИССЛЕДОВАНИЕ МОРФОЛОГИИ КОРОНАВИРУСА С ПОМОЩЬЮ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ
ИССЛЕДОВАНИЕ МОРФОЛОГИИ КОРОНАВИРУСА С ПОМОЩЬЮ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ
Просмотры: 1034
DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.6.336.344
Атомно-силовая микроскопия позволяет с высоким разрешением визуализировать оболочечные вирусы, к которым относятся вирусы семейства Coronaviridae, исследовать характер их адсорбции на различных поверхностях, измерять механические свойства вирусов, оценивать влияние изменения среды, температуры на морфологию. С помощью силовых кривых можно посчитать модуль Юнга вирусной частицы, оценить характер взаимодействия между белком оболочки и клеточным рецептором, даже померить силу этого взаимодействия. Все эти возможности не только позволяют характеризовать вирусы, но и помогают предотвращать распространение болезнетворных патогенов в человеческой популяции и выбирать оптимальную стратегию лечения.
Атомно-силовая микроскопия позволяет с высоким разрешением визуализировать оболочечные вирусы, к которым относятся вирусы семейства Coronaviridae, исследовать характер их адсорбции на различных поверхностях, измерять механические свойства вирусов, оценивать влияние изменения среды, температуры на морфологию. С помощью силовых кривых можно посчитать модуль Юнга вирусной частицы, оценить характер взаимодействия между белком оболочки и клеточным рецептором, даже померить силу этого взаимодействия. Все эти возможности не только позволяют характеризовать вирусы, но и помогают предотвращать распространение болезнетворных патогенов в человеческой популяции и выбирать оптимальную стратегию лечения.
Теги: atomic force microscopy biomechanics coronavirus mechanical properties scanning probe microscopy атомно-силовая микроскопия биомеханика коронавирус механические свойства сканирующая зондовая микроскопия
Получено: 5.09.2025 г. | Принято: 10.09.2025 г. | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.6.336.344
Научная статья
ИССЛЕДОВАНИЕ МОРФОЛОГИИ КОРОНАВИРУСА С ПОМОЩЬЮ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ
А.И.Ахметова1, 2, к.ф.-м.н., с.н.с., вед. спец., ORCID: 0000-0002-5115-8030
Л.В.Кордюкова3, д.б.н., вед. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-6089-1103
И.В.Яминский1, 2, д.ф.-м.н., проф., ген. дир., ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Аннотация. Атомно-силовая микроскопия позволяет с высоким разрешением визуализировать оболочечные вирусы, к которым относятся вирусы семейства Coronaviridae, исследовать характер их адсорбции на различных поверхностях, измерять механические свойства вирусов, оценивать влияние изменения среды, температуры на морфологию. С помощью силовых кривых можно посчитать модуль Юнга вирусной частицы, оценить характер взаимодействия между белком оболочки и клеточным рецептором, даже померить силу этого взаимодействия. Все эти возможности не только позволяют характеризовать вирусы, но и помогают предотвращать распространение болезнетворных патогенов в человеческой популяции и выбирать оптимальную стратегию лечения.
Ключевые слова: коронавирус, сканирующая зондовая микроскопия, биомеханика, атомно-силовая микроскопия, механические свойства
Для цитирования: А.И. Ахметова, Л.В. Кордюкова, И.В. Яминский. Исследование морфологии коронавируса с помощью атомно-силовой микроскопии. НАНОИНДУСТРИЯ. 2025. Т. 18. № 6. С. 336–344. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.6.336.344.
ВВЕДЕНИЕ
Коронавирус, вызвавший крупнейшую пандемию 21 века COVID-19 и унесший миллионы человеческих жизней, принадлежит к семейству Coronaviridae РНК-содержащих оболочечных вирусов [1]. Такие вирусы крайне склонны к изменчивости, что позволяет им легко уходить от человеческого иммунитета и сильно осложняет как разработку противовирусных препаратов, так и вакцинопрофилактику. В связи с этим крайне востребованы структурные методы исследования вирионов, нацеленные на выявление особенностей жизненного цикла вируса и поиск новых путей предотвращения распространения вирусной инфекции в человеческой популяции.
Одним из методов, визуализирующих морфологию и пространственную организацию вирусных частиц в различных средах, является атомно-силовая микроскопия (АСМ). Отличительная особенность АСМ – относительно простая пробоподготовка и возможность проводить исследования как на воздухе, так и в жидкости [2].
Для количественных измерений крайне важно удобство и функционал программы для обработки данных. ПО "ФемтоСкан Онлайн" позволяет не только измерить геометрические размеры, оценить шероховатость частиц, но и предоставляет качественную 3D-визуализацию полученных изображений (рис.1) [3].
АСМ стала важным инструментом для изучения оболочечных вирусов, так как этот метод позволяет не только визуализировать внешнюю структуру с нанометровым пространственным разрешением, но и оценить механические свойства вирионов, их устойчивость к механическому воздействию, характер адсорбции вирионов на поверхностях с разными физическими и химическими свойствами, выживаемость вирионов при различных условиях.
Морфология и ультраструктура
Первоначально АСМ позволяла охарактеризовать общую морфологию SARS-CoV-2 частиц с характерной "короной", состоящей из шиповидных структур – спайков, образованных главным вирусным антигеном S-белком. Атомно-силовая микроскопия дает завышенное значение латерального размера вирусных частиц из-за формы кончика кантилевера (см. табл.1). Дополнительное уширение вирусных частиц, расположенных на подложке, может происходить из-за изменения формы со сферической на уплощенную (рис.2).
Кисс и коллеги показали, что поверхность вируса напоминает щетку благодаря гибкости и подвижности шипов [4]. В этой работе они с помощью АСМ оценили влияние температуры на целостность вирусных частиц SARS-CoV-2. Образец нагревали в течение 10 мин при 60, 80 и 90 °C, затем охлаждали до 20 °C и сканировали на АСМ. В первом случае вирионы остались на поверхности подложки с почти неповрежденной структурой, но топография стала менее ровной, что указывает на постепенное исчезновение сглаживания поверхности, а следовательно, и снижение динамики спайков. После термической обработки 90 °C в течение 10 мин и фиксации глутаральдегидом большие области на вирионах оказались лишены спайков, появились небольшие выступы на поверхности. Можно сделать вывод, что вирионы обладают высокой пластичностью и способны восстанавливаться после резких механических воздействий, поверхность вириона постепенно лишается шипов при термическом воздействии.
Динамика поверхностных шипов может играть важную роль в необычно высокой инфекционности вируса, его механические и самовосстанавливающиеся свойства могут также обеспечивать адаптацию к широкому спектру условий окружающей среды.
В работе [5] с помощью АСМ визуализировали вирусные частицы на воздухе, высота (около 25 нм) была намного меньше диаметра, измеренного с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), и эта разница указывала на уплощение вирионов на поверхности слюды. Было показано, что инактивация β-пропиолактоном позволяет сохранить ключевые структурные особенности нативных вирусов.
АСМ позволила охарактеризовать спайк-белок, опосредующий распознавание клеток хозяина и слияние с мембраной [6]. Наномеханический анализ, проведенный в данном исследовании, подтвердил выводы ранее опубликованных работ [7, 8] относительно структуры SARS-CoV-2 о том, что структура вируса может состоять из трех слоев, обладающих механической прочностью. Предположительно, белки и другие компоненты мембраны могут защищать вирус от внешнего воздействия и выполняют структурную функцию. Благодаря этому вирус SARS-CoV-2 может самоорганизовываться после механического воздействия. После многочисленных итераций наноиндентирования, видимо, происходит попытка вирусной частицы заново собрать мембранные белки; однако эта повторная сборка неэффективна из-за постоянного напряжения в поверхностном слое даже при низких скоростях воздействия.
Механические свойства
Оценка подверженности вирусов изменениям среды, воздействию химических веществ и нераспространения на определенных поверхностях является важным аспектом при изучении вирулентности [9, 10]. Этому посвящено довольно много работ, где АСМ как раз позволяет детально рассмотреть морфологические изменения вируса.
АСМ позволяет качественно и количественно исследовать поведение вирусов на различных подложках и оценивать характер их адсорбции на поверхности. С помощью АСМ сравнили влияние TCPS (tissue culture polystyrene, полистирол для тканевых культур) и стеклянных подложек на осаждение и распределение SARS-CoV-2 [11]. Образец вируса SARS-CoV-2 наносили на стеклянные и TCPS-подложки без каких-либо модификаций. Оказалось, что на TCPS-подложке распределение вирионов на поверхности было более плотным и равномерным по сравнению со стеклом. Плотность вирионов, адсорбированных на поверхностях TCPS, оказалась примерно в 3,84 раза выше, чем на стекле. Предположительно активные группы на поверхности TCPS взаимодействуют с мембранными белками SARS-CoV-2, обеспечивая лучшую адгезию по сравнению со стеклом. Осаждение вирионов на обеих поверхностях показало эффект кофейного кольца, наблюдалось увеличение градиента распределения вирионов от центра капли к краям, вблизи "кофейного кольца" – особенно плотная упаковка. Высота вирусных частиц SARS-CoV-2 на стекле и TCPS-подложках отличалась: 42–47 и 62–67 нм, соответственно. Форма вирионов деформировалась и становилась сплющенной на стекле после воздействия 80% этилового спирта.
Также с помощью АСМ изучена морфология и механические свойства живых и инактивированных вирусных частиц SARS-CoV-2 [12]. Визуализация АСМ выявила разницу между структурно неповрежденным инфекционным и инактивированным SARS-CoV-2 при обработке формальдегидом (FA). По АСМ-данным сильнее всего на морфологию и высоту частиц влияет воздействие температурой 58 °C в течение 30 мин, вирус меняет геометрию, высота снижается до 80 нм, а латеральный диаметр увеличивается до 230 нм. Вирусные частицы, инактивированные 1% и 2% FA в течение 30 мин при 20 °C, становятся более рыхлыми, также имеют сниженную высоту и увеличенный латеральный размер по сравнению с инфекционными частицами. Также в данном исследовании выдвинули предположение, что частицы SARS-CoV-2 могут высвобождаться из инфицированных культуральных клеток в виде вирусных "упаковок", содержащих привязанные частицы, так как часть вирусных частиц оказалась встроенной в сеть тонких нитевидных структур, прикрепленных к поверхности.
АСМ также является удобным быстрым методом визуализации возможных структурных дефектов вирионов при получении кандидатных вакцинных штаммов. С помощью АСМ мы исследовали вирионы в составе родительского Омикрон-подобного штамма SARS-CoV-2 FEB2 (рис.3) и его ослабленного –ca-мутанта F-F3, обладающего ts-фенотипом (рис.4) [13]. Видимых изменений морфологии и поверхности вирионов у ослабленного вируса по сравнению с родительским штаммом обнаружено не было. Высота обоих штаммов на графите лежит в пределах 40–60 нм.
Взаимодействие вируса с клеткой
АСМ применяли для визуализации взаимодействия S-белка с рецептором человеческого ангиотензинпревращающего фермента 2 (ACE2, АПФ2) в реальном времени [14]. Было показано, что при 37 °C белок S становится адгезивным, и это свойство позволяет вирусам SARS-CoV-2 формировать стабильные вирусные агрегаты и распространяться в соседние ткани или образовывать респираторные аэрозоли или капли.
Биофизические свойства связывания S-гликопротеина SARS-CoV-2 с рецепторами АПФ2 на модельных поверхностях и на живых клетках оценивали с помощью силовых кривых [15]. АСМ позволила оценить кинетику и динамику взаимодействий, установленных in vitro, и сравнить связывающие свойства субъединицы S1 и RBD. Далее короткие пептиды, полученные из АПФ2, направленные на вирусный S-гликопротеин, тестировались в качестве ингибиторов связывания, в результате чего наблюдалось значительное снижение связывающих свойств.
Биосенсоры
Атомно-силовая микроскопия также позволяет верифицировать результаты работы сенсоров для обнаружения вирусов в биологических жидкостях, в частности, в работе [16] специфичное связывание вирусных частиц с поверхностью SERS-сенсора было подтверждено атомно-силовой микроскопией. По изменению шероховатости поверхности с помощью АСМ зафиксировали поэтапную функционализацию золотого электрода аптамером и показали дальнейшую адсорбцию гликопротеина S и самого вируса на подложке [17].
ВЫВОДЫ
АСМ как метод, не требующий сложной пробоподготовки объекта, продолжает предоставлять важную информацию о биологии вирусов, в том числе опасных патогенов, принадлежащих к группе оболочечных вирусов. Он дает возможность судить о структуре поверхности, особенностях морфологии, помогает отслеживать эффекты от инактивирующих веществ, визуализирует взаимодействия белков оболочки с клеточными рецепторами. АСМ открывает новые возможности для изучения ультраструктуры частиц SARS-CoV-2 в наномасштабе. Карты адгезии показали, что S-белки несут сильный отрицательный заряд по сравнению с остальной мембраной. Эта особенность помогает вирусу прочно присоединяться к рецепторам клеток-хозяев (например, ACE2), которые также имеют заряженные участки. Высокая адгезия обеспечивает первый шаг к успешному заражению. АСМ может использоваться для оценки эффективности сенсоров для обнаружения SARS-CoV-2. Данные о механических свойствах вирусных частиц и их способности не терять стабильность в окружающей среде объясняют, почему коронавирусы сохраняют активность на различных поверхностях. АСМ может выступать в качестве метода для оценки воздействия противовирусных агентов, антител и дезинфицирующих средств на цельные вирионы. Данные АСМ по морфологии и механике являются важным дополнением для других высокоразрешающих методов, таких как крио-ЭМ, ПЭМ и флуоресцентная микроскопия.
Развитие методов АСМ позволяет все лучше понять природу вирусов и содействует разработке противовирусных стратегий. Понимание причин, позволяющих вирусным частицам выдерживать механические повреждения, их способности восстанавливаться после таких повреждений может пролить свет на взаимосвязь между их структурой и функцией. Эти данные помогают в выборе мишени для терапевтического вмешательства и стратегии лечения.
БЛАГОДАРНОСТИ
Исследование выполнено в рамках государственного задания МГУ имени М.В.Ломоносова. ПО "ФемтоСкан Онлайн" предоставлено ООО "НПП "Центр перспективных технологий", www.femtoscan.ru.
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Kordyukova L.V., Shanko A.V. Covid-19: Myths and Reality. Biochemistry. 2021. Vol. 86. No. 7. PP. 964–984. https://doi.org/10.31857/S0320972521070022
Akhmetova A.I., Yaminsky I.V. High resolution imaging of viruses: scanning probe microscopy and related techniques. Methods. 2022. Vol. 197. PP. 30–38. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2021.06.011
Akhmetova A.I., Yaminsky I.V. FemtoScan Online software in virus research. NANOINDUSTRY. 2021. Vol. 14. No. 1(103). PP. 62–67. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2021.14.1.62.67
Kiss B., Kis Z., Pályi B., Kellermayer M.S.Z. Topography, spike dynamics, and nanomechanics of individual native SARS-CoV-2 virions. Nano Letters. 2021. Vol. 21. PP. 2675–2680. https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c 04465
Bagrov D.V., Glukhov G.S. et al. Structural characterization of β-propiolactone inactivated severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2) particles. Microscopy Research and Technique. 2022. Vol. 85. No. 2. PP. 562–569. https://doi.org/10.1002/jemt.23931
Cardoso-Lima R., Souza P.F.N. et al. SARS-CoV-2 Unrevealed: ultrastructural and nanomechanical analysis. Langmuir. 2021. Vol. 37(36). PP. 10762–10769. https://doi.org/10.1021/acs.langmuir.1c 01488
Yao H., Song Y. et al. Molecular Architecture of the SARS-CoV-2 Virus. Cell. 2020. Vol. 183. PP. 730–738.e13. https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.09.018
Astuti I., Ysrafil Y. Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2): An overview of viral structure and host response. Diabetes Metab. Syndr. Clin. Res. Re. V. 2020. Vol. 14. PP. 407–412. https://doi.org/10.1016/j.dsx.2020.04.020
Xue Y., Ma Y. et al. Identification and measurement of biomarkers at single microorganism level for in situ monitoring deep ultraviolet disinfection process. IEEE Trans NanoBioscience. 2024. Vol. 23(2). 242–251. https://doi.org/10.1109/TNB.2023.3312754
Tomás A.L., Reichel A. et al. UV-C irradiation-based inactivation of SARS-CoV-2 in contaminated porous and non-porous surfaces. J Photochem Photobiol B: Biol. 2022. Vol. 234. P. 112531. https://doi.org/10.1016/j.jphotobiol.2022.112531
Celik U., Celik K. et al. Interpretation of SARS-CoV-2 behaviour on different substrates and denaturation of virions using ethanol: an atomic force microscopy study. RSC Ad. V. 2020. Vol. 10. P. 44079 https://doi.org/10.1039/D0RA09083B
Lyonnais S., Hénaut M., Neyret A. et al. Atomic force microscopy analysis of native infectious and inactivated SARS-CoV-2 virions. Sci Rep. 2021. Vol. 11. P. 11885. https://doi.org/10.1038/s41598-021-91371-4
Kordyukova L.V., Moiseenko A.V., Trifonova T.S., Akhmetova A.I., Gracheva A.V., Korchevaya E.R., Yaminsky I.V., Fayzuloev E.B. Study of cold-adapted attenuated SARS-CoV-2 mutants by transmission, cryoelectron and atomic force microscopy. Bulletin of Moscow University. Series 16. Biology. 2025, Vol. 80. In press.
Lim K., Nishide G. et al. Millisecond dynamic of SARS-CoV-2 spike and its interaction with ACE2 receptor and small extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 2021. Vol. 10(14). P. e12170. https://doi.org/10.1002/jev2.12170
Yang J., Petitjean S.J.L. et al. Molecular interaction and inhibition of SARS-CoV-2 binding to the ACE2 receptor. Nat Commun. 2020. Vol. 11. P. 4541. https://doi.org/10.1038/s41467-020-18319-6
Kukushkin V., Ambartsumyan O. et al. Lithographic sers aptasensor for ultrasensitive detection of sars-cov-2 in biological fluids. Nanomaterials. 2022. Vol. 12. No. 21. P. 3854. https://doi.org/10.3390/nano12213854
Kurmangali A., Dukenbayev K., Kanayeva D. Sensitive detection of SARS-CoV-2 variants using an electrochemical impedance spectroscopy based aptasensor. Int J Mol Sci. 2022. Vol. 23(21). P. 13138. https://doi.org/10.3390/ijms232113138
Научная статья
ИССЛЕДОВАНИЕ МОРФОЛОГИИ КОРОНАВИРУСА С ПОМОЩЬЮ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ
А.И.Ахметова1, 2, к.ф.-м.н., с.н.с., вед. спец., ORCID: 0000-0002-5115-8030
Л.В.Кордюкова3, д.б.н., вед. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-6089-1103
И.В.Яминский1, 2, д.ф.-м.н., проф., ген. дир., ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Аннотация. Атомно-силовая микроскопия позволяет с высоким разрешением визуализировать оболочечные вирусы, к которым относятся вирусы семейства Coronaviridae, исследовать характер их адсорбции на различных поверхностях, измерять механические свойства вирусов, оценивать влияние изменения среды, температуры на морфологию. С помощью силовых кривых можно посчитать модуль Юнга вирусной частицы, оценить характер взаимодействия между белком оболочки и клеточным рецептором, даже померить силу этого взаимодействия. Все эти возможности не только позволяют характеризовать вирусы, но и помогают предотвращать распространение болезнетворных патогенов в человеческой популяции и выбирать оптимальную стратегию лечения.
Ключевые слова: коронавирус, сканирующая зондовая микроскопия, биомеханика, атомно-силовая микроскопия, механические свойства
Для цитирования: А.И. Ахметова, Л.В. Кордюкова, И.В. Яминский. Исследование морфологии коронавируса с помощью атомно-силовой микроскопии. НАНОИНДУСТРИЯ. 2025. Т. 18. № 6. С. 336–344. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.6.336.344.
ВВЕДЕНИЕ
Коронавирус, вызвавший крупнейшую пандемию 21 века COVID-19 и унесший миллионы человеческих жизней, принадлежит к семейству Coronaviridae РНК-содержащих оболочечных вирусов [1]. Такие вирусы крайне склонны к изменчивости, что позволяет им легко уходить от человеческого иммунитета и сильно осложняет как разработку противовирусных препаратов, так и вакцинопрофилактику. В связи с этим крайне востребованы структурные методы исследования вирионов, нацеленные на выявление особенностей жизненного цикла вируса и поиск новых путей предотвращения распространения вирусной инфекции в человеческой популяции.
Одним из методов, визуализирующих морфологию и пространственную организацию вирусных частиц в различных средах, является атомно-силовая микроскопия (АСМ). Отличительная особенность АСМ – относительно простая пробоподготовка и возможность проводить исследования как на воздухе, так и в жидкости [2].
Для количественных измерений крайне важно удобство и функционал программы для обработки данных. ПО "ФемтоСкан Онлайн" позволяет не только измерить геометрические размеры, оценить шероховатость частиц, но и предоставляет качественную 3D-визуализацию полученных изображений (рис.1) [3].
АСМ стала важным инструментом для изучения оболочечных вирусов, так как этот метод позволяет не только визуализировать внешнюю структуру с нанометровым пространственным разрешением, но и оценить механические свойства вирионов, их устойчивость к механическому воздействию, характер адсорбции вирионов на поверхностях с разными физическими и химическими свойствами, выживаемость вирионов при различных условиях.
Морфология и ультраструктура
Первоначально АСМ позволяла охарактеризовать общую морфологию SARS-CoV-2 частиц с характерной "короной", состоящей из шиповидных структур – спайков, образованных главным вирусным антигеном S-белком. Атомно-силовая микроскопия дает завышенное значение латерального размера вирусных частиц из-за формы кончика кантилевера (см. табл.1). Дополнительное уширение вирусных частиц, расположенных на подложке, может происходить из-за изменения формы со сферической на уплощенную (рис.2).
Кисс и коллеги показали, что поверхность вируса напоминает щетку благодаря гибкости и подвижности шипов [4]. В этой работе они с помощью АСМ оценили влияние температуры на целостность вирусных частиц SARS-CoV-2. Образец нагревали в течение 10 мин при 60, 80 и 90 °C, затем охлаждали до 20 °C и сканировали на АСМ. В первом случае вирионы остались на поверхности подложки с почти неповрежденной структурой, но топография стала менее ровной, что указывает на постепенное исчезновение сглаживания поверхности, а следовательно, и снижение динамики спайков. После термической обработки 90 °C в течение 10 мин и фиксации глутаральдегидом большие области на вирионах оказались лишены спайков, появились небольшие выступы на поверхности. Можно сделать вывод, что вирионы обладают высокой пластичностью и способны восстанавливаться после резких механических воздействий, поверхность вириона постепенно лишается шипов при термическом воздействии.
Динамика поверхностных шипов может играть важную роль в необычно высокой инфекционности вируса, его механические и самовосстанавливающиеся свойства могут также обеспечивать адаптацию к широкому спектру условий окружающей среды.
В работе [5] с помощью АСМ визуализировали вирусные частицы на воздухе, высота (около 25 нм) была намного меньше диаметра, измеренного с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), и эта разница указывала на уплощение вирионов на поверхности слюды. Было показано, что инактивация β-пропиолактоном позволяет сохранить ключевые структурные особенности нативных вирусов.
АСМ позволила охарактеризовать спайк-белок, опосредующий распознавание клеток хозяина и слияние с мембраной [6]. Наномеханический анализ, проведенный в данном исследовании, подтвердил выводы ранее опубликованных работ [7, 8] относительно структуры SARS-CoV-2 о том, что структура вируса может состоять из трех слоев, обладающих механической прочностью. Предположительно, белки и другие компоненты мембраны могут защищать вирус от внешнего воздействия и выполняют структурную функцию. Благодаря этому вирус SARS-CoV-2 может самоорганизовываться после механического воздействия. После многочисленных итераций наноиндентирования, видимо, происходит попытка вирусной частицы заново собрать мембранные белки; однако эта повторная сборка неэффективна из-за постоянного напряжения в поверхностном слое даже при низких скоростях воздействия.
Механические свойства
Оценка подверженности вирусов изменениям среды, воздействию химических веществ и нераспространения на определенных поверхностях является важным аспектом при изучении вирулентности [9, 10]. Этому посвящено довольно много работ, где АСМ как раз позволяет детально рассмотреть морфологические изменения вируса.
АСМ позволяет качественно и количественно исследовать поведение вирусов на различных подложках и оценивать характер их адсорбции на поверхности. С помощью АСМ сравнили влияние TCPS (tissue culture polystyrene, полистирол для тканевых культур) и стеклянных подложек на осаждение и распределение SARS-CoV-2 [11]. Образец вируса SARS-CoV-2 наносили на стеклянные и TCPS-подложки без каких-либо модификаций. Оказалось, что на TCPS-подложке распределение вирионов на поверхности было более плотным и равномерным по сравнению со стеклом. Плотность вирионов, адсорбированных на поверхностях TCPS, оказалась примерно в 3,84 раза выше, чем на стекле. Предположительно активные группы на поверхности TCPS взаимодействуют с мембранными белками SARS-CoV-2, обеспечивая лучшую адгезию по сравнению со стеклом. Осаждение вирионов на обеих поверхностях показало эффект кофейного кольца, наблюдалось увеличение градиента распределения вирионов от центра капли к краям, вблизи "кофейного кольца" – особенно плотная упаковка. Высота вирусных частиц SARS-CoV-2 на стекле и TCPS-подложках отличалась: 42–47 и 62–67 нм, соответственно. Форма вирионов деформировалась и становилась сплющенной на стекле после воздействия 80% этилового спирта.
Также с помощью АСМ изучена морфология и механические свойства живых и инактивированных вирусных частиц SARS-CoV-2 [12]. Визуализация АСМ выявила разницу между структурно неповрежденным инфекционным и инактивированным SARS-CoV-2 при обработке формальдегидом (FA). По АСМ-данным сильнее всего на морфологию и высоту частиц влияет воздействие температурой 58 °C в течение 30 мин, вирус меняет геометрию, высота снижается до 80 нм, а латеральный диаметр увеличивается до 230 нм. Вирусные частицы, инактивированные 1% и 2% FA в течение 30 мин при 20 °C, становятся более рыхлыми, также имеют сниженную высоту и увеличенный латеральный размер по сравнению с инфекционными частицами. Также в данном исследовании выдвинули предположение, что частицы SARS-CoV-2 могут высвобождаться из инфицированных культуральных клеток в виде вирусных "упаковок", содержащих привязанные частицы, так как часть вирусных частиц оказалась встроенной в сеть тонких нитевидных структур, прикрепленных к поверхности.
АСМ также является удобным быстрым методом визуализации возможных структурных дефектов вирионов при получении кандидатных вакцинных штаммов. С помощью АСМ мы исследовали вирионы в составе родительского Омикрон-подобного штамма SARS-CoV-2 FEB2 (рис.3) и его ослабленного –ca-мутанта F-F3, обладающего ts-фенотипом (рис.4) [13]. Видимых изменений морфологии и поверхности вирионов у ослабленного вируса по сравнению с родительским штаммом обнаружено не было. Высота обоих штаммов на графите лежит в пределах 40–60 нм.
Взаимодействие вируса с клеткой
АСМ применяли для визуализации взаимодействия S-белка с рецептором человеческого ангиотензинпревращающего фермента 2 (ACE2, АПФ2) в реальном времени [14]. Было показано, что при 37 °C белок S становится адгезивным, и это свойство позволяет вирусам SARS-CoV-2 формировать стабильные вирусные агрегаты и распространяться в соседние ткани или образовывать респираторные аэрозоли или капли.
Биофизические свойства связывания S-гликопротеина SARS-CoV-2 с рецепторами АПФ2 на модельных поверхностях и на живых клетках оценивали с помощью силовых кривых [15]. АСМ позволила оценить кинетику и динамику взаимодействий, установленных in vitro, и сравнить связывающие свойства субъединицы S1 и RBD. Далее короткие пептиды, полученные из АПФ2, направленные на вирусный S-гликопротеин, тестировались в качестве ингибиторов связывания, в результате чего наблюдалось значительное снижение связывающих свойств.
Биосенсоры
Атомно-силовая микроскопия также позволяет верифицировать результаты работы сенсоров для обнаружения вирусов в биологических жидкостях, в частности, в работе [16] специфичное связывание вирусных частиц с поверхностью SERS-сенсора было подтверждено атомно-силовой микроскопией. По изменению шероховатости поверхности с помощью АСМ зафиксировали поэтапную функционализацию золотого электрода аптамером и показали дальнейшую адсорбцию гликопротеина S и самого вируса на подложке [17].
ВЫВОДЫ
АСМ как метод, не требующий сложной пробоподготовки объекта, продолжает предоставлять важную информацию о биологии вирусов, в том числе опасных патогенов, принадлежащих к группе оболочечных вирусов. Он дает возможность судить о структуре поверхности, особенностях морфологии, помогает отслеживать эффекты от инактивирующих веществ, визуализирует взаимодействия белков оболочки с клеточными рецепторами. АСМ открывает новые возможности для изучения ультраструктуры частиц SARS-CoV-2 в наномасштабе. Карты адгезии показали, что S-белки несут сильный отрицательный заряд по сравнению с остальной мембраной. Эта особенность помогает вирусу прочно присоединяться к рецепторам клеток-хозяев (например, ACE2), которые также имеют заряженные участки. Высокая адгезия обеспечивает первый шаг к успешному заражению. АСМ может использоваться для оценки эффективности сенсоров для обнаружения SARS-CoV-2. Данные о механических свойствах вирусных частиц и их способности не терять стабильность в окружающей среде объясняют, почему коронавирусы сохраняют активность на различных поверхностях. АСМ может выступать в качестве метода для оценки воздействия противовирусных агентов, антител и дезинфицирующих средств на цельные вирионы. Данные АСМ по морфологии и механике являются важным дополнением для других высокоразрешающих методов, таких как крио-ЭМ, ПЭМ и флуоресцентная микроскопия.
Развитие методов АСМ позволяет все лучше понять природу вирусов и содействует разработке противовирусных стратегий. Понимание причин, позволяющих вирусным частицам выдерживать механические повреждения, их способности восстанавливаться после таких повреждений может пролить свет на взаимосвязь между их структурой и функцией. Эти данные помогают в выборе мишени для терапевтического вмешательства и стратегии лечения.
БЛАГОДАРНОСТИ
Исследование выполнено в рамках государственного задания МГУ имени М.В.Ломоносова. ПО "ФемтоСкан Онлайн" предоставлено ООО "НПП "Центр перспективных технологий", www.femtoscan.ru.
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Kordyukova L.V., Shanko A.V. Covid-19: Myths and Reality. Biochemistry. 2021. Vol. 86. No. 7. PP. 964–984. https://doi.org/10.31857/S0320972521070022
Akhmetova A.I., Yaminsky I.V. High resolution imaging of viruses: scanning probe microscopy and related techniques. Methods. 2022. Vol. 197. PP. 30–38. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2021.06.011
Akhmetova A.I., Yaminsky I.V. FemtoScan Online software in virus research. NANOINDUSTRY. 2021. Vol. 14. No. 1(103). PP. 62–67. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2021.14.1.62.67
Kiss B., Kis Z., Pályi B., Kellermayer M.S.Z. Topography, spike dynamics, and nanomechanics of individual native SARS-CoV-2 virions. Nano Letters. 2021. Vol. 21. PP. 2675–2680. https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c 04465
Bagrov D.V., Glukhov G.S. et al. Structural characterization of β-propiolactone inactivated severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2) particles. Microscopy Research and Technique. 2022. Vol. 85. No. 2. PP. 562–569. https://doi.org/10.1002/jemt.23931
Cardoso-Lima R., Souza P.F.N. et al. SARS-CoV-2 Unrevealed: ultrastructural and nanomechanical analysis. Langmuir. 2021. Vol. 37(36). PP. 10762–10769. https://doi.org/10.1021/acs.langmuir.1c 01488
Yao H., Song Y. et al. Molecular Architecture of the SARS-CoV-2 Virus. Cell. 2020. Vol. 183. PP. 730–738.e13. https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.09.018
Astuti I., Ysrafil Y. Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2): An overview of viral structure and host response. Diabetes Metab. Syndr. Clin. Res. Re. V. 2020. Vol. 14. PP. 407–412. https://doi.org/10.1016/j.dsx.2020.04.020
Xue Y., Ma Y. et al. Identification and measurement of biomarkers at single microorganism level for in situ monitoring deep ultraviolet disinfection process. IEEE Trans NanoBioscience. 2024. Vol. 23(2). 242–251. https://doi.org/10.1109/TNB.2023.3312754
Tomás A.L., Reichel A. et al. UV-C irradiation-based inactivation of SARS-CoV-2 in contaminated porous and non-porous surfaces. J Photochem Photobiol B: Biol. 2022. Vol. 234. P. 112531. https://doi.org/10.1016/j.jphotobiol.2022.112531
Celik U., Celik K. et al. Interpretation of SARS-CoV-2 behaviour on different substrates and denaturation of virions using ethanol: an atomic force microscopy study. RSC Ad. V. 2020. Vol. 10. P. 44079 https://doi.org/10.1039/D0RA09083B
Lyonnais S., Hénaut M., Neyret A. et al. Atomic force microscopy analysis of native infectious and inactivated SARS-CoV-2 virions. Sci Rep. 2021. Vol. 11. P. 11885. https://doi.org/10.1038/s41598-021-91371-4
Kordyukova L.V., Moiseenko A.V., Trifonova T.S., Akhmetova A.I., Gracheva A.V., Korchevaya E.R., Yaminsky I.V., Fayzuloev E.B. Study of cold-adapted attenuated SARS-CoV-2 mutants by transmission, cryoelectron and atomic force microscopy. Bulletin of Moscow University. Series 16. Biology. 2025, Vol. 80. In press.
Lim K., Nishide G. et al. Millisecond dynamic of SARS-CoV-2 spike and its interaction with ACE2 receptor and small extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 2021. Vol. 10(14). P. e12170. https://doi.org/10.1002/jev2.12170
Yang J., Petitjean S.J.L. et al. Molecular interaction and inhibition of SARS-CoV-2 binding to the ACE2 receptor. Nat Commun. 2020. Vol. 11. P. 4541. https://doi.org/10.1038/s41467-020-18319-6
Kukushkin V., Ambartsumyan O. et al. Lithographic sers aptasensor for ultrasensitive detection of sars-cov-2 in biological fluids. Nanomaterials. 2022. Vol. 12. No. 21. P. 3854. https://doi.org/10.3390/nano12213854
Kurmangali A., Dukenbayev K., Kanayeva D. Sensitive detection of SARS-CoV-2 variants using an electrochemical impedance spectroscopy based aptasensor. Int J Mol Sci. 2022. Vol. 23(21). P. 13138. https://doi.org/10.3390/ijms232113138
Отзывы читателей
