eng
Выпуск #4/2009
В.Копачевский, А.Качинский, А.Кузмин, П.Прасад.
Рамановская микроспектроскопия и КАРС-микроскопия для биологических применений
Рамановская микроспектроскопия и КАРС-микроскопия для биологических применений
Просмотры: 2469
Методом КАРС получены цифровые изображения распределения липидов в клетке. В качестве образца использовались человеческие раковые Mia-PaCa pancriatic клетки. На примере F-САRS изображения ТЕ мозговых клеток проиллюстрирована возможность применения Рамановских меток для повышения селективности изображения.
Прогресс клеточной биологии и медицины связан с методами и оборудованием, позволяющими проводить бесконтактный структурный анализ биологических образцов и процессов в них с высоким разрешением и в реальном времени. Оптическая лазерная микроскопия обладает неоспоримыми преимуществами и успешно дополняет физико-химические, радиационные, электронно-лучевые методы анализа. Конфокальная флуоресцентная лазерная микроскопия в сочетании с достижениями в нанофотонике и синтезе флуоресцентных меток, селективно взаимодействующих с компонентами клетки, позволяет изучать состав и структурные превращения клетки. Для нефлуоресцирующих образцов либо биологически не совместимых с внедряемыми флуоресцентными метками в силу их токсичности, либо подверженных сильному фотовыцветанию флуорофоров в качестве контрастного механизма формирования сигнала могут быть использованы молекулярные колебательные свойства входящих в состав биологических объектов органических соединений.
К числу перспективных направлений оптического анализа биологических обьектов на клеточном уровне, основанных на характерных колебательных резонансах, относятся Рамановская микроспектроскопия, микроскопия Спонтанного рамановского рассеяния (СРР) и Когерентного анти-стоксового рамановского рассеяния (КАРС). В отличие от СРР с присущими ему ограничениями вследствие слабости сигнала и большой величины автофлуоресцентного фона, КАРС-отклик среды нелинейно зависит от мощности возбуждающего сигнала и, как минимум, на пять порядков превышает сигнал СРР.
Широкое применение оптических методов активного и спонтанного Рамановского рассеяний связано с перспективами в изучении меж- и внутриклеточных взаимодействий, селективных процессов на уровне мембраны, цитоплазмы, липидов, ядер и присущих им РНК- и ДНК-взаимодействий.
Диагностика и лечение онкологических заболеваний напрямую связаны с методами и оборудованием для бесконтактного структурного клеточного анализа биологических образцов и in situ процессов в них. Разработка лекарственных препаратов и методов лечения таких заболеваний базируется на осмыслении происходящих в клетке процессов, изучении внутриклеточных превращений и их особенностей, селективных свойств взаимодействия реагентов на клеточном уровне. При этом эффективность препаратов определяется главным образом управляемостью процессов их селективного взаимодействия с внутриклеточной структурой.
Когда на среду с отличной от нуля нелинейной восприимчивостью третьего порядка χ(3) падают две согласованные по времени и пространству световые волны (рис.1): E(νp), большей частоты νp – волна "накачки" и E(νs), меньшей частоты νs – "Стоксова" волна, они взаимодействуют, вызывая биения электромагнитного поля на частоте νp – νs . В случае их резонанса с колебательным состоянием определенной химической связи среды νp – νs = νvib происходит вынужденное рассеяние второго фотона волны накачки E(νp) на сфазированном колебательном состоянии νvib с генерацией новой волны Eas (2νp – νs ).
Сигнал КАРС пропорционален квадрату интенсивности волны накачки, прямо пропорционален интенсивности Стоксовой волны, квадрату вкладов в тензор χ(3), который включает сумму откликов всех молекул, присутствующих в зоне взаимодействия в фокальной перетяжке лазерного излучения. КАРС-сигнал пропорционален соответственно квадрату концентрации молекул, вносящих вклад в χ(3). Это позволяет при определенных условиях с учетом селективности и неинвазивности метода использовать КАРС для количественных измерений концентрации химической субстанции в образце.
Примеры применения КАРС-микроскопии для получения изображений биологических объектов
Упрощенная схема микроскопа, в котором используется сигнал КАРС, приведена на рис.2.
Для оценки пространственного разрешения микроскопа использовался образец водно-дисперсионного раствора полистириновых микросфер, помещенный в стандартный микроскоп-слайд (стеклянная подложка толщиной 1 мм – двухсторонняя, самоклеющаяся пластиковая прокладка толщиной 100 мкм и покровное стекло толщиной 170 мкм). Образец представлял собой слабоконцентрированную смесь полистириновых микросфер с калиброванным диаметром 1587±25, 760±10 и 535±10 нм.
Как видно (рис.3б), шарики в 760 и 535 мкм четко различимы (на рисунке приведен разброс значений диаметров). Оценочная величина пространственного разрешения F-КАРС-изображения составляет порядка 200 нм, что хорошо согласуется с представлением о нелинейной природе формирования изображения и о возможности его превышения относительно оптического разрешения, определяемого критерием Релея.
Ниже приведены примеры спектров биологических образцов, полученных на Рамановском микроспектрометре. В структуру линий биологических субстанций вносят вклад различные химические образования и химические связи. Адекватная интерпретация Рамановских спектров на основе анализа химического состава и соответствующих колебательных состояний молекул, образующих биологические объекты, весьма важна для понимания структуры клетки и процессов в ней.
В табл.приведены примеры колебательных резонансов, основообразующих химических связей, составляющих химическую основу различных биокомпонентов клетки. Из разнообразия структурного состава конкретного биологического образования можно выбрать характерные частоты колебательных состояний, концентрация химических связей которых доминирует в конкретном биообразовании и представляет его характеристическую частоту.
На рис.4 показан Рамановский спектр RNA, выделенных по специальному протоколу из TE мозговых клеток животных. Аналогичный спектр DNA, экстрагированный из HeLa-типа клеток, показан на рис.5.
На рис.6 приведен Рамановский спектр ядрышка (nucleolus), входящего в состав ядра ТЕ-типа клетки. Анализируя характерные колебания и проводя последовательность спектральных измерений во времени, по изменению спектра и интенсивности линий или их смещению можно судить о процессах в таких жизненно важных образованиях клетки, как ядрышки внутри клеточного ядра, которые в значительной степени отражают процессы регенерации RNA и, используя КАРС-микроскоп, обосновано выбирая характеристические резонансы из спектров, можно успешно визуализировать селективные изображения.
На рис.7 приведены цифровые изображения нескольких Mia-PaCa клеток. Левая колонка соответствует изображениям, полученным в канале проходящего через образец лазерного излучения с длиной волны 1064 нм, а правая –
F-КАРС-изображениям. Видно, что данный резонанс селективно визуализирует липиды, распределенные по клетке,
а контраст других компонентов ее близок к нулю и не проявляется в изображении.
На рис.8 приведены F-КАРС-изображения ТЕ-типа мозговых клеток, полученные при настройке системы в резонанс 2311 см-1 . Пример иллюстрирует возможность использования Рамановских меток, полностью биологически совместимых с клеточной средой, для селективного высококонтрастного имаджинга основополагающих составляющих клетки, таких как ядро и его образующие. Четко видны область ядра, нюклеоплазма и нюклеолы.
Следует также отметить, что наряду с широкими возможностями КАРС-микроскопии, она является в значительной степени менее разрушительной и более свободной от стресса химического и лучевого воздействия, чем лазерная флуоресцентная микроскопия с использованием меток различного типа, включая органические красители, наночастицы на их основе, полупроводниковые квантовые точки.
К числу перспективных направлений оптического анализа биологических обьектов на клеточном уровне, основанных на характерных колебательных резонансах, относятся Рамановская микроспектроскопия, микроскопия Спонтанного рамановского рассеяния (СРР) и Когерентного анти-стоксового рамановского рассеяния (КАРС). В отличие от СРР с присущими ему ограничениями вследствие слабости сигнала и большой величины автофлуоресцентного фона, КАРС-отклик среды нелинейно зависит от мощности возбуждающего сигнала и, как минимум, на пять порядков превышает сигнал СРР.
Широкое применение оптических методов активного и спонтанного Рамановского рассеяний связано с перспективами в изучении меж- и внутриклеточных взаимодействий, селективных процессов на уровне мембраны, цитоплазмы, липидов, ядер и присущих им РНК- и ДНК-взаимодействий.
Диагностика и лечение онкологических заболеваний напрямую связаны с методами и оборудованием для бесконтактного структурного клеточного анализа биологических образцов и in situ процессов в них. Разработка лекарственных препаратов и методов лечения таких заболеваний базируется на осмыслении происходящих в клетке процессов, изучении внутриклеточных превращений и их особенностей, селективных свойств взаимодействия реагентов на клеточном уровне. При этом эффективность препаратов определяется главным образом управляемостью процессов их селективного взаимодействия с внутриклеточной структурой.
Когда на среду с отличной от нуля нелинейной восприимчивостью третьего порядка χ(3) падают две согласованные по времени и пространству световые волны (рис.1): E(νp), большей частоты νp – волна "накачки" и E(νs), меньшей частоты νs – "Стоксова" волна, они взаимодействуют, вызывая биения электромагнитного поля на частоте νp – νs . В случае их резонанса с колебательным состоянием определенной химической связи среды νp – νs = νvib происходит вынужденное рассеяние второго фотона волны накачки E(νp) на сфазированном колебательном состоянии νvib с генерацией новой волны Eas (2νp – νs ).
Сигнал КАРС пропорционален квадрату интенсивности волны накачки, прямо пропорционален интенсивности Стоксовой волны, квадрату вкладов в тензор χ(3), который включает сумму откликов всех молекул, присутствующих в зоне взаимодействия в фокальной перетяжке лазерного излучения. КАРС-сигнал пропорционален соответственно квадрату концентрации молекул, вносящих вклад в χ(3). Это позволяет при определенных условиях с учетом селективности и неинвазивности метода использовать КАРС для количественных измерений концентрации химической субстанции в образце.
Примеры применения КАРС-микроскопии для получения изображений биологических объектов
Упрощенная схема микроскопа, в котором используется сигнал КАРС, приведена на рис.2.
Для оценки пространственного разрешения микроскопа использовался образец водно-дисперсионного раствора полистириновых микросфер, помещенный в стандартный микроскоп-слайд (стеклянная подложка толщиной 1 мм – двухсторонняя, самоклеющаяся пластиковая прокладка толщиной 100 мкм и покровное стекло толщиной 170 мкм). Образец представлял собой слабоконцентрированную смесь полистириновых микросфер с калиброванным диаметром 1587±25, 760±10 и 535±10 нм.
Как видно (рис.3б), шарики в 760 и 535 мкм четко различимы (на рисунке приведен разброс значений диаметров). Оценочная величина пространственного разрешения F-КАРС-изображения составляет порядка 200 нм, что хорошо согласуется с представлением о нелинейной природе формирования изображения и о возможности его превышения относительно оптического разрешения, определяемого критерием Релея.
Ниже приведены примеры спектров биологических образцов, полученных на Рамановском микроспектрометре. В структуру линий биологических субстанций вносят вклад различные химические образования и химические связи. Адекватная интерпретация Рамановских спектров на основе анализа химического состава и соответствующих колебательных состояний молекул, образующих биологические объекты, весьма важна для понимания структуры клетки и процессов в ней.
В табл.приведены примеры колебательных резонансов, основообразующих химических связей, составляющих химическую основу различных биокомпонентов клетки. Из разнообразия структурного состава конкретного биологического образования можно выбрать характерные частоты колебательных состояний, концентрация химических связей которых доминирует в конкретном биообразовании и представляет его характеристическую частоту.
На рис.4 показан Рамановский спектр RNA, выделенных по специальному протоколу из TE мозговых клеток животных. Аналогичный спектр DNA, экстрагированный из HeLa-типа клеток, показан на рис.5.
На рис.6 приведен Рамановский спектр ядрышка (nucleolus), входящего в состав ядра ТЕ-типа клетки. Анализируя характерные колебания и проводя последовательность спектральных измерений во времени, по изменению спектра и интенсивности линий или их смещению можно судить о процессах в таких жизненно важных образованиях клетки, как ядрышки внутри клеточного ядра, которые в значительной степени отражают процессы регенерации RNA и, используя КАРС-микроскоп, обосновано выбирая характеристические резонансы из спектров, можно успешно визуализировать селективные изображения.
На рис.7 приведены цифровые изображения нескольких Mia-PaCa клеток. Левая колонка соответствует изображениям, полученным в канале проходящего через образец лазерного излучения с длиной волны 1064 нм, а правая –
F-КАРС-изображениям. Видно, что данный резонанс селективно визуализирует липиды, распределенные по клетке,
а контраст других компонентов ее близок к нулю и не проявляется в изображении.
На рис.8 приведены F-КАРС-изображения ТЕ-типа мозговых клеток, полученные при настройке системы в резонанс 2311 см-1 . Пример иллюстрирует возможность использования Рамановских меток, полностью биологически совместимых с клеточной средой, для селективного высококонтрастного имаджинга основополагающих составляющих клетки, таких как ядро и его образующие. Четко видны область ядра, нюклеоплазма и нюклеолы.
Следует также отметить, что наряду с широкими возможностями КАРС-микроскопии, она является в значительной степени менее разрушительной и более свободной от стресса химического и лучевого воздействия, чем лазерная флуоресцентная микроскопия с использованием меток различного типа, включая органические красители, наночастицы на их основе, полупроводниковые квантовые точки.
Отзывы читателей
