eng
Выпуск #1/2007
Ю. Копа, К. Момыналиев.
ДНК-макроматрицы и транскрипционное профилирование
ДНК-макроматрицы и транскрипционное профилирование
Просмотры: 4009
Современные ДНК-матрицы являются высокочувствительным и точным аналитическим инструментом для научного исследования различных аспектов биологии клеток. Технология ДНК-матриц находит все более широкое применение в фундаментальных и прикладных исследованиях и может использоваться в диагностике.
Основной задачей постгеномной эры исследований является использование информации о структуре генома для анализа биологических процессов в масштабах всего генома, а также поиска, установления и уточнения функций различных генов. Хотя молекулярная биология традиционно использует редукционный подход для решения биологических задач, давно известно, что экспрессия генов осуществляется путем их взаимодействия друг с другом, причем характерной особенностью процессов взаимодействия является их частая пространственная и временная разделенность. Для полного понимания биологии этих процессов молекулярные взаимодействия необходимо изучать через структуру всего генома. Современные биологические ДНК-матрицы являются высокочувствительным и точным аналитическим инструментом получения и обработки большого количества информации с тем преимуществом, что одновременно и быстро анализируется огромное количество образцов различного биологического материала. Благодаря своим особенностям технология ДНК-матриц все чаще применяется в фундаментальных и прикладных исследованиях, а также может быть использована в диагностических целях. Так, применение ДНК-матриц в научных исследованиях различных аспектов биологии клеток позволяет проводить мониторинг экспрессии всех генов одновременно. Такой метод обеспечивает более целостный подход к изучению клеточной физиологии, тем самым дополняя традиционный "gene-by-gene"подход.
Теоретическая основа для создания биологических матриц появилась достаточно давно. Вскоре после того, как Джеймс Уотсон и Френсис Крик впервые сделали описание двойной спирали ДНК, было показано, что ДНК при нагревании или после обработки щелочью денатурируется, т.е. двойная спираль расплетается с образованием двух одноцепочечных фрагментов ДНК. Обратный процесс, лежащий в основе всех методов, включающих в себя ренатурацию и молекулярную гибридизацию, впервые был описан в 1961 году, когда было показано, что две последовательности ДНК, вовлеченные в образование дуплекса, должны обладать свойством комплементарности, и стабильность образованного дуплекса напрямую зависит от степени комплементарности образовавших его последовательностей. Благодаря открытию принципа комплементарной гибридизации нуклеиновых кислот представилась возможность анализировать степень сродства (гомологии) различных нуклеиновых кислот, стали быстро развиваться и использоваться для решения различных биологических задач методы, основанные на молекулярной гибридизации.
Одним из таких методов является технология ДНК-матриц, в основе которой лежит принцип специфической гибридизации фрагментов ДНК. Суть метода заключается в параллельной гибридизации смеси меченых нуклеиновых кислот (мишеней) с тысячами специфичных фрагментов нуклеиновых кислот (зондами), индентифицируемых пространственным положением в отдельных ячейках на матрице, в одном эксперименте. С помощью ДНК-матриц возможно получение полной и точной картины экспрессии генов в анализируемых образцах. В среднем в клетке постоянно используется только часть генов, в то время как оставшиеся репрессируются на транскрипционном или, что менее вероятно, на трансляционном уровне. Транскрипционный анализ, осуществляемый посредством экспрессионного профилирования на ДНК-матрицах, позволяет судить о процессах, происходящих в клетке, включая каскады биохимических реакций, различные регуляторные механизмы, а также механизмы патогенности (рис.1).
В течение последних лет были разработаны разнообразные методы детекции и количественного определения уровня экспрессии генов, такие как Northern Blotting,
S1-эндонуклеазный анализ гетеродуплексов, Differential Display RT-PCR, тотальное кДНК-секвенирование, серийный анализ экспрессии генов (SAGE), среди которых и два метода на основе матриц – ДНК и олигонуклеотидных. Каждая из перечисленных технологий имеет свои преимущества и ограничения. Однако ДНК-матрицы обеспечивают наиболее эффективный способ сравнения уровнейэкспрессии тысяч генов при исследовании несколькихобразцов.
ДНК-матрицы представляют собой упорядоченную систему фрагментов нуклеиновых кислот, соответствующих определенным генам и находящихся в определенной позиции на матрице, которой может служить нейлоновая мембрана, стеклянная подложка или силикон. ДНК-микроматрицы содержат десятки тысяч элементов размером ~100 мкм в диаметре на стеклянной поверхности площадью в несколько квадратных сантиметров. Плотность нейлоновых матриц чуть меньше: тысячи ген-специфичных фрагментов ДНК (зондов) размещаются на поверхности, по площади не намного превосходящей стеклянные чипы.
В настоящее время в экспрессионном профилировании широко применяются 3 типа ДНК-матриц. Первый тип – это ДНК-матрицы, в которых пробы синтезируются in situ, то есть непосредственно на поверхности чипа. В двух других типах матриц пробы синтезируются независимо и затем наносятся на химически модифицированные стеклянные поверхности чипов. Природа проб позволяет их классифицировать, как двуцепочечные ДНК-матрицы (второй тип) и олигонуклеотидные ДНК-матрицы (третий тип).
Наиболее известными ДНК-матрицами, в изготовлении которых используется in situ-технология, являются матрицы GeneChip, выпускаемые компанией Affymetrix. Химический синтез олигонуклеотидных проб осуществляется на поверхности кварцевого стекла. Эта технология обеспечивает высокоплотное размещение проб – порядка 500 000 на одной ДНК-матрице размером 1,28х1,28 см. Для изготовления матриц GeneChip используется комбинация уникального метода фотолитографии (аналогичный метод используется для производства структур в микроэлектронике) и методов комбинаторной химии. Так как25-мерные последовательности слишком короткие для ген-специфичной гибридизации, каждая проба (match) сопровождается отрицательным контролем с одним отличным основанием в центре 25-мерной нуклеотидной цепи (mismatch). Такая пара проб используется для детекции и предотвращения кросс-гибридизации. Сеть олигонуклеотидов из 11-15 проб (перфектов) и такого же числа парных олигонуклеотидов с заменами (мисматчей) представляют один ген. Высокая плотность размещения проб на такой матрице позволяет иметь большое количество контролей. Автоматизированный процесс изготовления матриц GeneChip гарантирует высокую воспроизводимость результатов и позволяет варьировать условия проведения каждого эксперимента, тогда как обычно ДНК-матрицы гибридизируются с двумя различными флуоресцентно-мечеными мишенями (в качестве метки используется пара Cy-3/Cy-5), чипы Affymetrix – с одной меченой мишенью. Это позволяет использовать различные методы для мечения ДНК-мишеней, упрощает исследования и статистическую обработку результатов.
Для независимого синтеза ДНК-зондов, среди которых выделяют двухцепочечные фрагменты ДНК и олигонуклеотиды, используются различные методы. Один из них – полимеразная цепная реакция – позволяет получить ген-специфичные ампликоны размером от нескольких сотен до нескольких тысяч пар оснований. Обычно, используя специфические праймеры, амплифицируют открытые рамки считывания, представляющие собой потенциальные белок-кодирующие последовательности. Оптимальная длина ампликонов для иммобилизации на ДНК-матрицах составляет 200-800 пар оснований, хотя фрагменты длиной до 1,3 тысяч пар оснований также используются. В таких матрицах каждый ДНК-зонд соответствует одному гену.
Двухнитевые фрагменты ДНК наносятся на положительно заряженную поверхность ДНК-матриц. Для модификации поверхности матриц обычно используется полилизин (poly-L-lysin) или 3-аминопропил-триметоксисилан (APS). Иммобилизация фрагментов ДНК на поверхности матрицы осуществляется благодаря электростатическому взаимодействию отрицательно заряженного фосфатного остова нуклеиновой кислоты и положительно заряженной поверхности матрицы, а также за счет образования ковалентных связей между остатками тимина и аминогруппами, расположенными на поверхности матрицы, при облучении ультрафиолетом. Среди преимуществ изготовленных таким образом матриц следует отметить высокую специфичность при гибридизации, высокую чувствительность и их низкую стоимость. В качестве альтернативы некоторые коммерческие поставщики предлагают большие коллекции 50-80-мерных олигонуклеотидов, синтезированных фосфорамидным методом. И в том, и в другом случае автоматическая локализация ДНК-зондов, находящихся в специальном буфере, на химически модифицированную поверхность матрицы осуществляется механическими роботами. Существуют две технологии нанесения: контактная и бесконтактная. Контактные роботы-принтеры наносят ДНК-зонды на поверхность матриц пинами различной формы (рис. 2), которые погружаются в раствор и переносят маленькие капельки специфических ДНК-зондов на поверхность матрицы. Размер локализованных таким образом ДНК-зондов составляет всего 150 мкм в диаметре. Бесконтактные принтеры используют технологию типа струйного принтера. Основное преимущество таких матриц – их стандартные размеры, что обеспечивает широкий выбор роботов-принтеров, оборудования для проведения гибридизации, лазерных сканеров и программного обеспечения для обработки результатов эксперимента. Исторически первым было изготовление ДНК-матрицы на предметном стекле, поэтому размер матриц 25x75 мм и толщина 1,0-1,2 мм не изменились. Однако плотность размещения ДНК-зондов на таких матрицах ниже по сравнению с матрицами Affymetrix – порядка 10 000-30 000 ДНК-зондов.
Для проведения эксперимента по транскрипционному профилированию готовые ДНК-матрицы гибридизируются со смесью меченой кДНК, полученной в результате реакции обратной транскрипции из мРНК изучаемых образцов. Каждый образец метится либо флуоресцентной (обычно используется пара Cy-3/Cy-5), либо радиоактивной меткой. Если мишени метятся радиоактивным методом, то можно провести только одну гибридизацию в эксперименте. Однако существует проблема подобного "одноканального" эксперимента – вариации в интенсивностях сигналов в пределах одного эксперимента влияют на конечную относительную экспрессионную картину. Эта проблема была решена с появлением "двухканальных" экспериментов, где два исследуемых образца РНК, один из которых, например, выступает в качестве контрольного, флуоресцентно метятся и одновременно гибридизируются с одной матрицей (рис.3). Для двухканального эксперимента мРНК выделяется из двух типов клеток, и один образец метится Сy-3, другой – Cy-5. Можно отметить, что наиболее распространено прямое мечение, когда метка является частью нуклеозид-трифосфата, например, Cy-3 диоксицитозин трифосфат (Cy-3 dCTP) или Cy-3 диоксиуридин трифосфат (Cy-3 dCTP). В случае радиоактивного мечения используются нуклеотиды, содержащие радиоактивный фосфатный остаток (обычно P33). Таким образом, мечение осуществляется путем встраивания нуклеотидов в кДНК в процессе ее синтеза.
Локализуясь в ходе гибридизации на матрице, анализируемые кДНК формируют детектируемые ген-специфичные сигналы – паттерны гибридизации, которые считываются конфокальным лазерным сканером. Для возбуждения поверхности гибридизированных ДНК-матриц в большинстве сканеров используются лазеры с разрешающей способностью в несколько микрон. Разрешающая способность сканера (устройство для сканирования показано на рис. 4) должна превышать величину, равную 10% от размеров локализации ДНК-зонда на матрице, то есть в случае зонда диаметром 150 мкм разрешение при сканировании должно быть, по крайней мере, 15 мкм. В результате сканирования получается изображение в формате TIFF для каждого канала (Cy-3/Cy-5) или GEL (при радиоактивном мечении).
Использование экспрессионных ДНК-матриц для анализа экспрессии всех генов становится все более актуальным в связи с появлением все большего числа полных геномных последовательностей для различных микроорганизмов, поскольку позволяет выявлять закономерности в экспрессии генов. Кроме того, несмотря на то, что ДНК-матрицы широко применяются при мониторинге экспрессии генов для определения их функции и состояния клеток, их также используют для определения числа копий ДНК, генетических мутации и детекции однонуклеотидных полиморфизмов.
В заключение можно привести несколько примеров успешного использования ДНК-матриц для фундаментальных и практических работ. В 2005 г. в журнале Science группой исследователей из компании Perlegen были опубликованы результаты генотипирования 1586383 полиморфизмов единичного нуклеотида (SNP) среди американцев, африканцев и азиатов. Было показано, что помимо общих SNPs (порядка 1200000), для каждой популяции можно выделить группу уникальных полиморфизмов, встречающихся только в определенной популяции. Полученные данные позволяют понять, почему те или иные заболевания встречаются только в определенных популяциях.
Для проведения анализа были сконструированы 49 высокоплотных олигонуклеотидных матриц, каждая из которых была предназначена для выявления 48 000 SNP. Работа была проведена в течение 1 месяца, в то время как использование традиционных методов определения полиморфизма единичных нуклеотидов заняло бы не менее 8 месяцев. В настоящее время компаниями Solexa и Helicos Biosciences предприняты попытки создания технологий на основе ДНК-матриц для определения нуклеотидной последовательности генома человека (порядка 3 млрд. нуклеотидов). Предполагается, что данные технологии позволят снизить стоимость определения генома человека с 15 млн. долл. (исследование занимает 6 месяцев) до 10 тыс. долл. в 2008 году и до 1000 долл. в 2010 году (исследование будет занимать одну неделю).
Одним из интересных направлений исследований является использования ДНК-матриц для открытия новых биологических маркеров различных заболеваний. Например, остро стоит проблема поиска ранних маркеров отторжения пересаженного органа. К сожалению, доступные на сегодняшний день методы (например, иммуногистохимия биопсий трансплантанта) позволяет зафиксировать признаки отторжения на поздних стадиях, что требует значительной иммуносупрессивной терапии. Технология ДНК-матриц является одним из методов выбора, позволяющих найти прогностические маркеры, с помощью которых можно достаточно точно оценить состояние трансплантанта в начальной стадии изменений, и, таким образом, своевременно провести корректировку трансплантанта с помощью незначительной терапии. С помощью этой технологии определен список потенциальных маркеров для ряда заболеваний, которые могут быть использованы в клинической практике.
Перспективы многопараметрического анализа на основе ДНК-матриц в настоящее время связаны с бурным развитием в области нанотехнологий. Прогресс в исследовании геномов обеспечивает значительное увеличение информации относительно механизмов заболеваний, роли целевых генов и белков в патогенезе, а, следовательно, приводит к тому, что все больше дополнительной информации (генов) должно добавляться к индивидуальным ДНК-матрицам. Это может быть достигнуто за счет уменьшения размеров ген-специфических фрагментов ДНК (зондов) до одного микрона или меньше. Обычные системы нанесения ДНК на матрицу позволяют формировать ДНК-матрицу, состоящую из элементов (зондов) размером 100 мкм, в то время как на коммерческих фотолитографических установках можно получать элементы размером до 20 мкм. Недавно NanoInk продемонстрировал DPN (Dip Pen Nanolithography) технологию, с помощью которой можно формировать элементы размером один микрон и меньше.
Известно, что затраты производства микроэлектронных компонентов при использовании фотолитографического процесса растут экспоненциально с уменьшением размеров элементов. Прямое изготовление ДНК-матриц с помощью DPN-технологии позволяет снизить эти производственные затраты и увеличить гибкость дизайна ДНК-матриц.
В настоящее время разработаны методы мягкой литографии, позволяющие иммобилизовать единичные молекулы ДНК на подложку, что делает возможным создание ДНК-наноматриц размером меньше 100 мкм (рис. 5). Потенциально, небольшие количества биологических материалов, как известно, имеют более быструю кинетику и более высокую чувствительность. Вероятно, что нанотехнологии будут использоваться для создания ДНК-чипов следующего поколения.
Теоретическая основа для создания биологических матриц появилась достаточно давно. Вскоре после того, как Джеймс Уотсон и Френсис Крик впервые сделали описание двойной спирали ДНК, было показано, что ДНК при нагревании или после обработки щелочью денатурируется, т.е. двойная спираль расплетается с образованием двух одноцепочечных фрагментов ДНК. Обратный процесс, лежащий в основе всех методов, включающих в себя ренатурацию и молекулярную гибридизацию, впервые был описан в 1961 году, когда было показано, что две последовательности ДНК, вовлеченные в образование дуплекса, должны обладать свойством комплементарности, и стабильность образованного дуплекса напрямую зависит от степени комплементарности образовавших его последовательностей. Благодаря открытию принципа комплементарной гибридизации нуклеиновых кислот представилась возможность анализировать степень сродства (гомологии) различных нуклеиновых кислот, стали быстро развиваться и использоваться для решения различных биологических задач методы, основанные на молекулярной гибридизации.
Одним из таких методов является технология ДНК-матриц, в основе которой лежит принцип специфической гибридизации фрагментов ДНК. Суть метода заключается в параллельной гибридизации смеси меченых нуклеиновых кислот (мишеней) с тысячами специфичных фрагментов нуклеиновых кислот (зондами), индентифицируемых пространственным положением в отдельных ячейках на матрице, в одном эксперименте. С помощью ДНК-матриц возможно получение полной и точной картины экспрессии генов в анализируемых образцах. В среднем в клетке постоянно используется только часть генов, в то время как оставшиеся репрессируются на транскрипционном или, что менее вероятно, на трансляционном уровне. Транскрипционный анализ, осуществляемый посредством экспрессионного профилирования на ДНК-матрицах, позволяет судить о процессах, происходящих в клетке, включая каскады биохимических реакций, различные регуляторные механизмы, а также механизмы патогенности (рис.1).
В течение последних лет были разработаны разнообразные методы детекции и количественного определения уровня экспрессии генов, такие как Northern Blotting,
S1-эндонуклеазный анализ гетеродуплексов, Differential Display RT-PCR, тотальное кДНК-секвенирование, серийный анализ экспрессии генов (SAGE), среди которых и два метода на основе матриц – ДНК и олигонуклеотидных. Каждая из перечисленных технологий имеет свои преимущества и ограничения. Однако ДНК-матрицы обеспечивают наиболее эффективный способ сравнения уровнейэкспрессии тысяч генов при исследовании несколькихобразцов.
ДНК-матрицы представляют собой упорядоченную систему фрагментов нуклеиновых кислот, соответствующих определенным генам и находящихся в определенной позиции на матрице, которой может служить нейлоновая мембрана, стеклянная подложка или силикон. ДНК-микроматрицы содержат десятки тысяч элементов размером ~100 мкм в диаметре на стеклянной поверхности площадью в несколько квадратных сантиметров. Плотность нейлоновых матриц чуть меньше: тысячи ген-специфичных фрагментов ДНК (зондов) размещаются на поверхности, по площади не намного превосходящей стеклянные чипы.
В настоящее время в экспрессионном профилировании широко применяются 3 типа ДНК-матриц. Первый тип – это ДНК-матрицы, в которых пробы синтезируются in situ, то есть непосредственно на поверхности чипа. В двух других типах матриц пробы синтезируются независимо и затем наносятся на химически модифицированные стеклянные поверхности чипов. Природа проб позволяет их классифицировать, как двуцепочечные ДНК-матрицы (второй тип) и олигонуклеотидные ДНК-матрицы (третий тип).
Наиболее известными ДНК-матрицами, в изготовлении которых используется in situ-технология, являются матрицы GeneChip, выпускаемые компанией Affymetrix. Химический синтез олигонуклеотидных проб осуществляется на поверхности кварцевого стекла. Эта технология обеспечивает высокоплотное размещение проб – порядка 500 000 на одной ДНК-матрице размером 1,28х1,28 см. Для изготовления матриц GeneChip используется комбинация уникального метода фотолитографии (аналогичный метод используется для производства структур в микроэлектронике) и методов комбинаторной химии. Так как25-мерные последовательности слишком короткие для ген-специфичной гибридизации, каждая проба (match) сопровождается отрицательным контролем с одним отличным основанием в центре 25-мерной нуклеотидной цепи (mismatch). Такая пара проб используется для детекции и предотвращения кросс-гибридизации. Сеть олигонуклеотидов из 11-15 проб (перфектов) и такого же числа парных олигонуклеотидов с заменами (мисматчей) представляют один ген. Высокая плотность размещения проб на такой матрице позволяет иметь большое количество контролей. Автоматизированный процесс изготовления матриц GeneChip гарантирует высокую воспроизводимость результатов и позволяет варьировать условия проведения каждого эксперимента, тогда как обычно ДНК-матрицы гибридизируются с двумя различными флуоресцентно-мечеными мишенями (в качестве метки используется пара Cy-3/Cy-5), чипы Affymetrix – с одной меченой мишенью. Это позволяет использовать различные методы для мечения ДНК-мишеней, упрощает исследования и статистическую обработку результатов.
Для независимого синтеза ДНК-зондов, среди которых выделяют двухцепочечные фрагменты ДНК и олигонуклеотиды, используются различные методы. Один из них – полимеразная цепная реакция – позволяет получить ген-специфичные ампликоны размером от нескольких сотен до нескольких тысяч пар оснований. Обычно, используя специфические праймеры, амплифицируют открытые рамки считывания, представляющие собой потенциальные белок-кодирующие последовательности. Оптимальная длина ампликонов для иммобилизации на ДНК-матрицах составляет 200-800 пар оснований, хотя фрагменты длиной до 1,3 тысяч пар оснований также используются. В таких матрицах каждый ДНК-зонд соответствует одному гену.
Двухнитевые фрагменты ДНК наносятся на положительно заряженную поверхность ДНК-матриц. Для модификации поверхности матриц обычно используется полилизин (poly-L-lysin) или 3-аминопропил-триметоксисилан (APS). Иммобилизация фрагментов ДНК на поверхности матрицы осуществляется благодаря электростатическому взаимодействию отрицательно заряженного фосфатного остова нуклеиновой кислоты и положительно заряженной поверхности матрицы, а также за счет образования ковалентных связей между остатками тимина и аминогруппами, расположенными на поверхности матрицы, при облучении ультрафиолетом. Среди преимуществ изготовленных таким образом матриц следует отметить высокую специфичность при гибридизации, высокую чувствительность и их низкую стоимость. В качестве альтернативы некоторые коммерческие поставщики предлагают большие коллекции 50-80-мерных олигонуклеотидов, синтезированных фосфорамидным методом. И в том, и в другом случае автоматическая локализация ДНК-зондов, находящихся в специальном буфере, на химически модифицированную поверхность матрицы осуществляется механическими роботами. Существуют две технологии нанесения: контактная и бесконтактная. Контактные роботы-принтеры наносят ДНК-зонды на поверхность матриц пинами различной формы (рис. 2), которые погружаются в раствор и переносят маленькие капельки специфических ДНК-зондов на поверхность матрицы. Размер локализованных таким образом ДНК-зондов составляет всего 150 мкм в диаметре. Бесконтактные принтеры используют технологию типа струйного принтера. Основное преимущество таких матриц – их стандартные размеры, что обеспечивает широкий выбор роботов-принтеров, оборудования для проведения гибридизации, лазерных сканеров и программного обеспечения для обработки результатов эксперимента. Исторически первым было изготовление ДНК-матрицы на предметном стекле, поэтому размер матриц 25x75 мм и толщина 1,0-1,2 мм не изменились. Однако плотность размещения ДНК-зондов на таких матрицах ниже по сравнению с матрицами Affymetrix – порядка 10 000-30 000 ДНК-зондов.
Для проведения эксперимента по транскрипционному профилированию готовые ДНК-матрицы гибридизируются со смесью меченой кДНК, полученной в результате реакции обратной транскрипции из мРНК изучаемых образцов. Каждый образец метится либо флуоресцентной (обычно используется пара Cy-3/Cy-5), либо радиоактивной меткой. Если мишени метятся радиоактивным методом, то можно провести только одну гибридизацию в эксперименте. Однако существует проблема подобного "одноканального" эксперимента – вариации в интенсивностях сигналов в пределах одного эксперимента влияют на конечную относительную экспрессионную картину. Эта проблема была решена с появлением "двухканальных" экспериментов, где два исследуемых образца РНК, один из которых, например, выступает в качестве контрольного, флуоресцентно метятся и одновременно гибридизируются с одной матрицей (рис.3). Для двухканального эксперимента мРНК выделяется из двух типов клеток, и один образец метится Сy-3, другой – Cy-5. Можно отметить, что наиболее распространено прямое мечение, когда метка является частью нуклеозид-трифосфата, например, Cy-3 диоксицитозин трифосфат (Cy-3 dCTP) или Cy-3 диоксиуридин трифосфат (Cy-3 dCTP). В случае радиоактивного мечения используются нуклеотиды, содержащие радиоактивный фосфатный остаток (обычно P33). Таким образом, мечение осуществляется путем встраивания нуклеотидов в кДНК в процессе ее синтеза.
Локализуясь в ходе гибридизации на матрице, анализируемые кДНК формируют детектируемые ген-специфичные сигналы – паттерны гибридизации, которые считываются конфокальным лазерным сканером. Для возбуждения поверхности гибридизированных ДНК-матриц в большинстве сканеров используются лазеры с разрешающей способностью в несколько микрон. Разрешающая способность сканера (устройство для сканирования показано на рис. 4) должна превышать величину, равную 10% от размеров локализации ДНК-зонда на матрице, то есть в случае зонда диаметром 150 мкм разрешение при сканировании должно быть, по крайней мере, 15 мкм. В результате сканирования получается изображение в формате TIFF для каждого канала (Cy-3/Cy-5) или GEL (при радиоактивном мечении).
Использование экспрессионных ДНК-матриц для анализа экспрессии всех генов становится все более актуальным в связи с появлением все большего числа полных геномных последовательностей для различных микроорганизмов, поскольку позволяет выявлять закономерности в экспрессии генов. Кроме того, несмотря на то, что ДНК-матрицы широко применяются при мониторинге экспрессии генов для определения их функции и состояния клеток, их также используют для определения числа копий ДНК, генетических мутации и детекции однонуклеотидных полиморфизмов.
В заключение можно привести несколько примеров успешного использования ДНК-матриц для фундаментальных и практических работ. В 2005 г. в журнале Science группой исследователей из компании Perlegen были опубликованы результаты генотипирования 1586383 полиморфизмов единичного нуклеотида (SNP) среди американцев, африканцев и азиатов. Было показано, что помимо общих SNPs (порядка 1200000), для каждой популяции можно выделить группу уникальных полиморфизмов, встречающихся только в определенной популяции. Полученные данные позволяют понять, почему те или иные заболевания встречаются только в определенных популяциях.
Для проведения анализа были сконструированы 49 высокоплотных олигонуклеотидных матриц, каждая из которых была предназначена для выявления 48 000 SNP. Работа была проведена в течение 1 месяца, в то время как использование традиционных методов определения полиморфизма единичных нуклеотидов заняло бы не менее 8 месяцев. В настоящее время компаниями Solexa и Helicos Biosciences предприняты попытки создания технологий на основе ДНК-матриц для определения нуклеотидной последовательности генома человека (порядка 3 млрд. нуклеотидов). Предполагается, что данные технологии позволят снизить стоимость определения генома человека с 15 млн. долл. (исследование занимает 6 месяцев) до 10 тыс. долл. в 2008 году и до 1000 долл. в 2010 году (исследование будет занимать одну неделю).
Одним из интересных направлений исследований является использования ДНК-матриц для открытия новых биологических маркеров различных заболеваний. Например, остро стоит проблема поиска ранних маркеров отторжения пересаженного органа. К сожалению, доступные на сегодняшний день методы (например, иммуногистохимия биопсий трансплантанта) позволяет зафиксировать признаки отторжения на поздних стадиях, что требует значительной иммуносупрессивной терапии. Технология ДНК-матриц является одним из методов выбора, позволяющих найти прогностические маркеры, с помощью которых можно достаточно точно оценить состояние трансплантанта в начальной стадии изменений, и, таким образом, своевременно провести корректировку трансплантанта с помощью незначительной терапии. С помощью этой технологии определен список потенциальных маркеров для ряда заболеваний, которые могут быть использованы в клинической практике.
Перспективы многопараметрического анализа на основе ДНК-матриц в настоящее время связаны с бурным развитием в области нанотехнологий. Прогресс в исследовании геномов обеспечивает значительное увеличение информации относительно механизмов заболеваний, роли целевых генов и белков в патогенезе, а, следовательно, приводит к тому, что все больше дополнительной информации (генов) должно добавляться к индивидуальным ДНК-матрицам. Это может быть достигнуто за счет уменьшения размеров ген-специфических фрагментов ДНК (зондов) до одного микрона или меньше. Обычные системы нанесения ДНК на матрицу позволяют формировать ДНК-матрицу, состоящую из элементов (зондов) размером 100 мкм, в то время как на коммерческих фотолитографических установках можно получать элементы размером до 20 мкм. Недавно NanoInk продемонстрировал DPN (Dip Pen Nanolithography) технологию, с помощью которой можно формировать элементы размером один микрон и меньше.
Известно, что затраты производства микроэлектронных компонентов при использовании фотолитографического процесса растут экспоненциально с уменьшением размеров элементов. Прямое изготовление ДНК-матриц с помощью DPN-технологии позволяет снизить эти производственные затраты и увеличить гибкость дизайна ДНК-матриц.
В настоящее время разработаны методы мягкой литографии, позволяющие иммобилизовать единичные молекулы ДНК на подложку, что делает возможным создание ДНК-наноматриц размером меньше 100 мкм (рис. 5). Потенциально, небольшие количества биологических материалов, как известно, имеют более быструю кинетику и более высокую чувствительность. Вероятно, что нанотехнологии будут использоваться для создания ДНК-чипов следующего поколения.
Отзывы читателей
