eng
В связи с расширением применения полимерезной цепной реакции (ПЦР) требования к ее скорости и качеству результатов постоянно возрастают. Описываемая методика быстрой ПЦР имеет существенные преимущества перед аналогами и отвечает требованиям современной медицины.
Теги: rapid pcr technology real-time thermocycler qtowe thermocycler speedcycler2 амплификатор qtower амплификатор speedcycler2 реал-тайм технология быстрой пцр
Специалисты отмечают, что для нагрева и охлаждения блоков прибора используются различные методы, в частности, лампы, резистивные нагреватели, водяное охлаждение. Вместе с тем предпочтение отдается элементам Пельтье, поскольку их применение позволяет создать надежный и компактный прибор [2, 3, 6, 7]. Недостаток существующих приборов – малая скорость нагрева и охлаждения (1–2°С/с) достаточно крупных образцов (200–300 мкм) вследствие использования металлических блоков большого объема и относительно толстых стенок пластиковых лунок. В связи с этим на цикл затрачивается 3–8 мин, а общая продолжительность стандартного эксперимента ПЦР составляет 1,5–3 ч.
Предложенная методика позволяет существенно ускорить проведение ПЦР-исследований без снижения их качества. Быстрая ПЦР применима для широкого круга исследований, связанных с живыми организмами (медицинская, ветеринарная и генодиагностика, биотехнологии, криминалистика, установление отцовства, мутагенез, персонализированная медицина, выявление различных микроорганизмов, типирование, контроль качества сельскохозяйственной продукции, выявление нарушений в работе организма и предрасположенности к ряду заболеваний). На рис.1 представлен прибор qTOWER, в котором по схеме, приведенной на рис.2, реализуется методика быстрой ПЦР.
Методика быстрой ПЦР
Поскольку контроль температурных циклов – одна из главных функций ПЦР, были проведены эксперименты с коммерчески доступными системами. Это позволило создать термин "быстрая ПЦР", так как 30 циклов амплификации удалось осуществить менее, чем за 30 мин [4, 5].
Преимуществом быстрой ПЦР, помимо сокращения затрачиваемого на исследование времени, является улучшение ее качества. В самом деле, благодаря высокой скорости охлаждения и малому времени отжига праймеры с матрицей связываются точнее, что в свою очередь обеспечивает более высокую специфичность продуктов амплификации.
Быстрые алгоритмы управления активируют элементы Пельтье, которые практически мгновенно регулируют температуру блока. Передача энергии в реакционную смесь благодаря тонким стенкам лунок происходит быстро. В результате при быстрой ПЦР обеспечивается большая тепловая эффективность. Скорость нагрева и охлаждения достигает более 12°C/с, что позволяет провести цикл за 20 с, а реализовать протоколы ПЦР с 30 циклами за 8–15 мин [4, 5, 7].
Малая продолжительность зависит от высокой скорости изменения температуры амплификатора и очень короткого времени удержания трех температурных фаз ПЦР (денатурации, отжига, элонгации – этапа биосинтеза молекул нуклеиновых кислот) (рис.3). В обычных амплификаторах большая часть времени уходит на изменение температуры металлического блока и пластиковых стенок форм, в которых находятся образцы. Продолжительность же температурных циклов в быстрой ПЦР почти полностью связана с химическими (денатурация цепочек ДНК) или биохимическими (синтез ДНК) процессами [7].
Высокая скорость
и специфичность
Практическая полезность амплификатора определяется рабочими параметрами (скоростями нагрева и охлаждения, т.е. тепловой эффективностью). Однако более важны характеристики молекулярно-биологических экспериментов (продолжительность протоколов ПЦР, выход и качество продуктов). В частности, в медицинской диагностике и в криминалистике от скорости ПЦР зависит продолжительность серии анализов. В предложенном методе реализована возможность проведения ПЦР с высокими скоростью и точностью воспроизведения ДНК, что особенно важно при клонировании или секвенировании ДНК и генов [6, 7].
В быстрой ПЦР используются стандартные ферменты, буферы и другие компоненты. Конечная концентрация компонентов при быстрой ПЦР соответствует ей при стандартном процессе. Таким образом, пользователь имеет возможность продолжать работать со своими реагентами и получать более специфичные и точные результаты за относительно короткий промежуток времени.
В целом следует подчеркнуть, что реализована сверхбыстрая амплификация, позволяющая достичь значительно более высокой специфичности продуктов ПЦР при обработке ДНК-фрагментов разной длины и происхождения. Важно отметить, что преимущества ПЦР достигнуты благодаря комбинации элементов Пельтье и микропланшета в качестве носителя образца.
Амплификаторы для быстрой ПЦР (SpeedCycler2 и qTOWER) разработаны в рамках совместного проекта Analytik Jena, Life Science, Hans-Knöll-Institut für Naturstoff Forschung (Германия) и группы компаний AWTech (Россия).
Литература
1. Mullis K. The Polymerase Chain Reaction, Nobel Lecture, December 8, 1993. LEX PRIX NOBEL. The Nobel Prizes. Almqvist and Wiksell Int., Stockholm, Sweden.
2. Saiki R.K. et al. – Science, 1985, v.230, р.1350.
3. Mullis K.B. – Scientific American, 1990, v.56.
4. Mullis K., Ferre F. and Gibbs R. Rapid Cycle DNA Amplification In, The polymerase chain reaction. – FL, Springer, 1994, р.174–181.
5. Innis M., Gelfand D., Sninsky J. Rapid Thermal Cycling & PCR Kinetics In: PCR Methods Manual. – San Diego, Academic Press, 1999, 211–229.
6. Seise В., Brinker А. et al. Chip-based detection system for the on-site analysis of animal diseases. – Eng. Life Sci., 2011, v.11, №2, 148–156.
7. Hermann H., Knippschild C., Berka A. Ultrafast DNA amplification with a rapid PCR system, LabTechnology, Biotechnology Division Analytik Jena AG. – Germany, Jena, 2010.
Предложенная методика позволяет существенно ускорить проведение ПЦР-исследований без снижения их качества. Быстрая ПЦР применима для широкого круга исследований, связанных с живыми организмами (медицинская, ветеринарная и генодиагностика, биотехнологии, криминалистика, установление отцовства, мутагенез, персонализированная медицина, выявление различных микроорганизмов, типирование, контроль качества сельскохозяйственной продукции, выявление нарушений в работе организма и предрасположенности к ряду заболеваний). На рис.1 представлен прибор qTOWER, в котором по схеме, приведенной на рис.2, реализуется методика быстрой ПЦР.
Методика быстрой ПЦР
Поскольку контроль температурных циклов – одна из главных функций ПЦР, были проведены эксперименты с коммерчески доступными системами. Это позволило создать термин "быстрая ПЦР", так как 30 циклов амплификации удалось осуществить менее, чем за 30 мин [4, 5].
Преимуществом быстрой ПЦР, помимо сокращения затрачиваемого на исследование времени, является улучшение ее качества. В самом деле, благодаря высокой скорости охлаждения и малому времени отжига праймеры с матрицей связываются точнее, что в свою очередь обеспечивает более высокую специфичность продуктов амплификации.
Быстрые алгоритмы управления активируют элементы Пельтье, которые практически мгновенно регулируют температуру блока. Передача энергии в реакционную смесь благодаря тонким стенкам лунок происходит быстро. В результате при быстрой ПЦР обеспечивается большая тепловая эффективность. Скорость нагрева и охлаждения достигает более 12°C/с, что позволяет провести цикл за 20 с, а реализовать протоколы ПЦР с 30 циклами за 8–15 мин [4, 5, 7].
Малая продолжительность зависит от высокой скорости изменения температуры амплификатора и очень короткого времени удержания трех температурных фаз ПЦР (денатурации, отжига, элонгации – этапа биосинтеза молекул нуклеиновых кислот) (рис.3). В обычных амплификаторах большая часть времени уходит на изменение температуры металлического блока и пластиковых стенок форм, в которых находятся образцы. Продолжительность же температурных циклов в быстрой ПЦР почти полностью связана с химическими (денатурация цепочек ДНК) или биохимическими (синтез ДНК) процессами [7].
Высокая скорость
и специфичность
Практическая полезность амплификатора определяется рабочими параметрами (скоростями нагрева и охлаждения, т.е. тепловой эффективностью). Однако более важны характеристики молекулярно-биологических экспериментов (продолжительность протоколов ПЦР, выход и качество продуктов). В частности, в медицинской диагностике и в криминалистике от скорости ПЦР зависит продолжительность серии анализов. В предложенном методе реализована возможность проведения ПЦР с высокими скоростью и точностью воспроизведения ДНК, что особенно важно при клонировании или секвенировании ДНК и генов [6, 7].
В быстрой ПЦР используются стандартные ферменты, буферы и другие компоненты. Конечная концентрация компонентов при быстрой ПЦР соответствует ей при стандартном процессе. Таким образом, пользователь имеет возможность продолжать работать со своими реагентами и получать более специфичные и точные результаты за относительно короткий промежуток времени.
В целом следует подчеркнуть, что реализована сверхбыстрая амплификация, позволяющая достичь значительно более высокой специфичности продуктов ПЦР при обработке ДНК-фрагментов разной длины и происхождения. Важно отметить, что преимущества ПЦР достигнуты благодаря комбинации элементов Пельтье и микропланшета в качестве носителя образца.
Амплификаторы для быстрой ПЦР (SpeedCycler2 и qTOWER) разработаны в рамках совместного проекта Analytik Jena, Life Science, Hans-Knöll-Institut für Naturstoff Forschung (Германия) и группы компаний AWTech (Россия).
Литература
1. Mullis K. The Polymerase Chain Reaction, Nobel Lecture, December 8, 1993. LEX PRIX NOBEL. The Nobel Prizes. Almqvist and Wiksell Int., Stockholm, Sweden.
2. Saiki R.K. et al. – Science, 1985, v.230, р.1350.
3. Mullis K.B. – Scientific American, 1990, v.56.
4. Mullis K., Ferre F. and Gibbs R. Rapid Cycle DNA Amplification In, The polymerase chain reaction. – FL, Springer, 1994, р.174–181.
5. Innis M., Gelfand D., Sninsky J. Rapid Thermal Cycling & PCR Kinetics In: PCR Methods Manual. – San Diego, Academic Press, 1999, 211–229.
6. Seise В., Brinker А. et al. Chip-based detection system for the on-site analysis of animal diseases. – Eng. Life Sci., 2011, v.11, №2, 148–156.
7. Hermann H., Knippschild C., Berka A. Ultrafast DNA amplification with a rapid PCR system, LabTechnology, Biotechnology Division Analytik Jena AG. – Germany, Jena, 2010.
Отзывы читателей
