eng
Выпуск #7/2016
А.Ахметова, Г.Мешков, И.Назаров, О.Синицына, И.Яминский
Обнаружение вирусов и бактерий в сканирующей зондовой микроскопии
Обнаружение вирусов и бактерий в сканирующей зондовой микроскопии
Просмотры: 3968
Рассмотрены перспективы применения проточной жидкостной ячейки и специализированного биочипа для фиксации биообъектов.
DOI:10.22184/1993-8578.2016.69.7.80.85
DOI:10.22184/1993-8578.2016.69.7.80.85
Теги: biochip flow-through liquid cell scanning probe microscope биочип проточная жидкостная ячейка сканирующий зондовый микроскоп
Наблюдение бактериальных клеток в сканирующий зондовый микроскоп (СЗМ) является рутинной операцией [1]. В качестве подложки, на которую наносят бактериальные клетки, удобно использовать свежесколотую слюду. Для формирования однородной монослойной пленки бактерий островкового вида целесообразно использовать суспензию бактерий в дистиллированной воде с концентрацией около 109 ед./мл, нанося каплю объемом в 4 мкл на подложку из слюды размером 10 × 10 мкм2.
При анализе бактериальных клеток следует учитывать различие в результатах измерений размеров и структуры поверхности бактерий на воздухе и в жидкости [2]. Если наблюдать в одних и тех же условиях различные штаммы бактерий, то регистрируемые различия могут давать ценную диагностическую информацию. Например, удается обнаружить различный характер морфологии внешней мембраны исходного штамма бактерий Escherichia coli K62 и его трансдуктантного штамма с внедренным в ДНК дополнительным геномом rfb-a3,4, ответственным за синтез O-специфических боковых цепей липополисахаридов, типичных для возбудителя дизентерии – Shigella flexneri [3]. Для трансдуктантного штамма хорошо заметна ламеллярная упаковка липополисахаридов. Такой штамм можно эффективно использовать для вакцинации населения в случае возникновения острых очагов эпидемии дизентерии.
Для вирусологии сканирующая зондовая микроскопия может быть полезна как в целях диагностики, так и при разработке антивирусных препаратов. Вирусы имеют палочковидную или икосаэдрическую формы, что упрощает их идентификацию с помощью СЗМ [4]. Если для фиксации вирусных частиц использовать аффинные поверхности, то СЗМ может применяться как диагностический прибор, позволяющий обнаруживать единичные вирусы. Разработка подложек для специфического связывания вирусных частиц является важным направлением современных и будущих исследований. Простые методы структурирования, например придание поверхности регулярного рельефа, могут способствовать повышению избирательной сорбции вирусных частиц на ней [5, 6]. Помимо исследования самих вирусов, не менее важной задачей является изучение свойств белков, обеспечивающих физико-химическую стабильность [7] и межклеточный транспорт вирусов [8, 9, 10], а также другие важные функции.
При изучении бактериальных клеток и вирусных частиц авторами использовался усовершенствованный СЗМ "ФемтоСкан" (рис.1) и программное обеспечение "ФемтоСкан Онлайн" [11]. Для эффективного применения современных СЗМ с целью обнаружения таких патогенов, как бактериальные клетки и вирусные частицы, требуется не только усовершенствование приборной базы зондовой микроскопии, но и сопряжение ее с дополнительными инструментами. Так, нами разработана конструкция проточной жидкостной ячейки, в которую помещается специализированный биочип. Последний представляет собой подложку с сенсорными слоями, обеспечивающими связывание бактерий или вирусов с его поверхностью за счет биоспецифического взаимодействия.
Ранее для обнаружения вируса гриппа А мы использовали кремниевый кантилевер атомно-силового микроскопа [12]. Регистрация связывания вирусных частиц с сенсорной поверхностью кантилевера, расположенной только на одной из его сторон, осуществлялось путем измерения статического изгиба с помощью системы "Биоскан" (Академия биосенсоров, Россия, www.biosensoracademy.com). Этот вариант обеспечил чувствительность на уровне 106 вирионов в мл. В качестве основы сенсорного слоя была применена кремниевая пластина с нанесенной на одну из ее сторон пленкой золота. Поверхность золота была модифицирована 3-аминопропилтриметоксисиланом, после чего выполнялась иммобилизация на модифицированной поверхности полиакриламида, содержащего сиаловые кислоты Neu5Ac2-3Gal1-4Glc. Эти сиаловые кислоты идентичны рецепторам эпителиальных клеток, связывание с которыми осуществляет гемагглютинин вируса гриппа в процессе вирусного инфицирования. Использование высокоизбирательных подложек для фиксации на их поверхности вирусных частиц является непременным условием проведения клинической диагностики заболеваний. Разработка соответствующих сенсорных слоев с требуемыми рецепторными свойствами – одна из важных и сложных задач нашего проекта.
Просвечивающая электронная микроскопия позволяет визуализировать отдельные вирусные частицы в вакууме с разрешением, обеспечивающим наблюдение структуры наружной мембраны вируса. На рис.2 представлено изображение вируса гриппа А (A / Duck / Moscow / 4182 / 2008) с частично разрушенной мембраной. Обладая высоким пространственным разрешением, просвечивающая электронная микроскопия является хорошим помощником при детальных медицинских исследованиях, однако, этот метод не подходит для массового использования. Сканирующая зондовая микроскопия дает возможность обнаружения вирусных частиц непосредственно в биологической жидкости. Как было отмечено выше, ключевым для применения этого метода является создание биочипа с высокоспецифической избирательностью по отношению к выявляемой мишени – конкретному вирусу. Использование в качестве несущей основы и регистрирующего элемента пьезокерамической пластины предложено в работе [13]. При попадании вирусной частицы на поверхность биочипа происходит изменение амплитуды и частоты резонансных колебаний пьезокерамической пластины, которое можно с высокой точностью зарегистрировать с помощью компактной радиоизмерительной схемы.
Желательно, чтобы усовершенствованный для задач медицинской диагностики СЗМ был укомплектован полностью герметичной проточной ячейкой. В существующих коммерческих моделях СЗМ герметичность последней обеспечивается при ее сборке из нескольких деталей, в том числе уплотнительных колец, непосредственно в процессе установки образца в микроскоп. Такие проточные ячейки достаточно дорогие (3 000–8 000 долл. США), поэтому их использование в качестве одноразовых элементов представляется в высшей степени нерентабельным. Кроме того, в большинстве случаев снятие образца сопровождается одновременной разгерметизацией проточной жидкостной ячейки.
Нами разработана оригинальная конструкция проточной жидкостной ячейки, которую можно ставить на микроскоп и снимать с него в полностью герметичном состоянии. Основные материалы ячейки – оргстекло и силиконовая резина, а стоимость изготовления составляет около 300 руб., что позволяет использовать ее как одноразовую. В настоящее время на конструкцию проточной жидкостной ячейки подается заявка на патент. С помощью проточной ячейки можно выполнять не только промывку сенсорной поверхности биочипа для удаления неспецифически связанных на поверхности структур, но и ее регенерацию при использовании соответствующих реагентов.
Если в качестве основы биочипа для проточной жидкостной ячейки СЗМ "ФемтоСкан" использовать пьезокерамический диск, то обнаружение вирусных и бактериальных патогенов можно одновременно проводить двумя различными способами: по изменению амплитуды и резонансных колебаний диска и по изменению профиля поверхности биочипа при присоединении вирусной частицы. Таким образом, повышается надежность и достоверность измерений, что очень важно при диагностике инфекционных заболеваний.
В начальных экспериментах для изготовления биочипов нами использовались пьезокерамические диски толщиной 0,1 мм и диаметром от 3 до 16 мм. Чувствительность биосенсора обратно пропорциональна его геометрическим размерам, поэтому перспективным является использование пьезодисков микронной толщины. Однако для этого надо преодолеть серьезные технологические трудности. Мы будем рады тем читателям, которые смогут оказать нам необходимую технологическую помощь.
При регистрации механического резонанса биочипа мы используем измерительную систему СЗМ, которая включает синтезатор частоты (диапазон 0,01 Гц – 10 МГц), входной усилитель, детектор среднеквадратичного значения и синхронный детектор. Блок-схема измерительной установки и резонансная кривая механических колебаний биочипа приведены на рис.4.
НИОКТР выполняется в МГУ им. М.В.Ломоносова при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (проект 02.G25.31.0135).
ЛИТЕРАТУРА
Bolshakova A.V., Kiselyova O.I., Yaminsky I.V. Microbial surfaces investigated using atomic force microscopy // Biotechnology Progress. 2004. V. 20. № 6. P. 1615–1622.
Bolshakova A.V., Kiselyova O.I., Filonov A.S., Frolova O.Yu., Lyubchenko Yu.L., Yaminsky I.V. Comparative studies of bacteria with atomic force microscopy operating in different modes // Ultramicroscopy. 2001. 86 (1–2). 121–128.
Яминский И.В., Демин В.В., Бондаренко В.М. Различия в клеточной поверхности гибридных бактерий Escherichia coli K12, наследующих rfb-а3,4 ген Shigella flexneri, выявляемые с помощью атомно-силовой микроскопии // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1997. № 6. С. 15–18.
Dubrovin E.V., Drygin Yu.F., Novikov V.K., Yaminsky I.V. Atomic force microscopy as a tool of inspection of viral infection // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. Vol. 3. Iss. 2. 2007. Р. 128–131.
Волынский А.Л., Баженов С.Л., Лебедева О.В., Яминский И.В., Озерин А.Н., Бакеев Н.Ф. Явление потери устойчивости жесткого покрытия при деформировании полимера-подложки. Высокомолекулярные соединения. 1997. Т. 39. № 11. С. 1805–1811.
Ivanov V.F., Gribkova O.L., Novikov S.V., Nekrasov A.A., Isakova A.A., Vannikov A.V., Meshkov G.B., Yaminsky I.V. Redox heterogeneity in polyaniline films: from molecular to macroscopic scale // Synthetic Metals. 2005. 152. 1–3. SI. 153–156.
Kiselyova O.I., Yaminsky I.V., Karpova O.V., Rodionova N.P., Kozlovsky S.V., Arkhipenko M.V., Atabekov J.G. AFM study of potato virus X disassembly induced by movement protein // Journal of Molecular Biology. 2003. 332. Р. 321–325.
Makarov V.V., Rybakova E.N., Efimov A.V., Dobrov E.N., Serebryakova M.V., Solovyev A.G., Yaminsky I.V., Taliansky M.E., Morozov S.Y., Kalinina N.O. Domain organization of the N-terminal portion of hordeivirus movement protein TGBpl // Journal of general virology. 2009. 90. Part 12. 3022–3032.
Kiselyova O.I., Yaminsky I.V., Karger E.M., Frolova O.Yu., Dorokhov Y.L., Atabekov J.G. Visualization by atomic force microscopy of tobacco mosaic virus movement protein-RNA complexes formed in vitro // Journal of General Virology. 2001. 82. 1503–1508.
Karpova O.V., Zayakina O.V., Arkhipenko M.V., Sheval E.V., Kiselyova O.I., Poljakov V.Yu., Yaminsky I.V., Rodionova N.P., Atabekov J.G. Potato virus X RNA-mediated assembly of singletailed ternary ‘coat protein-RNA-movementprotein’ complexes // Journal of General Virology. 2006. 87. 2731–2740.
Яминский И., Филонов А., Синицына О., Мешков Г. Программное обеспечение "ФемтоСкан Онлайн" // Наноиндустрия. 2016. № 2 (64). C.42–46.
Gorelkin P.V., Erofeev A.S., Kiselev G.A., Kolesov D.V., Dubrovin E.V. Yaminsky I.V. Synthetic sialylglycopolymer receptor for virus detection using cantilever-based sensors // Analyst. 2015. 140. 6131–6137.
Киселев Г., Горелкин П., Ерофеев А., Колесов Д.,
Яминский И. Детекция вирусов с помощью пьезоэлектрических кантилеверов // Наноиндустрия. 2015. 4(58). 62–67.
При анализе бактериальных клеток следует учитывать различие в результатах измерений размеров и структуры поверхности бактерий на воздухе и в жидкости [2]. Если наблюдать в одних и тех же условиях различные штаммы бактерий, то регистрируемые различия могут давать ценную диагностическую информацию. Например, удается обнаружить различный характер морфологии внешней мембраны исходного штамма бактерий Escherichia coli K62 и его трансдуктантного штамма с внедренным в ДНК дополнительным геномом rfb-a3,4, ответственным за синтез O-специфических боковых цепей липополисахаридов, типичных для возбудителя дизентерии – Shigella flexneri [3]. Для трансдуктантного штамма хорошо заметна ламеллярная упаковка липополисахаридов. Такой штамм можно эффективно использовать для вакцинации населения в случае возникновения острых очагов эпидемии дизентерии.
Для вирусологии сканирующая зондовая микроскопия может быть полезна как в целях диагностики, так и при разработке антивирусных препаратов. Вирусы имеют палочковидную или икосаэдрическую формы, что упрощает их идентификацию с помощью СЗМ [4]. Если для фиксации вирусных частиц использовать аффинные поверхности, то СЗМ может применяться как диагностический прибор, позволяющий обнаруживать единичные вирусы. Разработка подложек для специфического связывания вирусных частиц является важным направлением современных и будущих исследований. Простые методы структурирования, например придание поверхности регулярного рельефа, могут способствовать повышению избирательной сорбции вирусных частиц на ней [5, 6]. Помимо исследования самих вирусов, не менее важной задачей является изучение свойств белков, обеспечивающих физико-химическую стабильность [7] и межклеточный транспорт вирусов [8, 9, 10], а также другие важные функции.
При изучении бактериальных клеток и вирусных частиц авторами использовался усовершенствованный СЗМ "ФемтоСкан" (рис.1) и программное обеспечение "ФемтоСкан Онлайн" [11]. Для эффективного применения современных СЗМ с целью обнаружения таких патогенов, как бактериальные клетки и вирусные частицы, требуется не только усовершенствование приборной базы зондовой микроскопии, но и сопряжение ее с дополнительными инструментами. Так, нами разработана конструкция проточной жидкостной ячейки, в которую помещается специализированный биочип. Последний представляет собой подложку с сенсорными слоями, обеспечивающими связывание бактерий или вирусов с его поверхностью за счет биоспецифического взаимодействия.
Ранее для обнаружения вируса гриппа А мы использовали кремниевый кантилевер атомно-силового микроскопа [12]. Регистрация связывания вирусных частиц с сенсорной поверхностью кантилевера, расположенной только на одной из его сторон, осуществлялось путем измерения статического изгиба с помощью системы "Биоскан" (Академия биосенсоров, Россия, www.biosensoracademy.com). Этот вариант обеспечил чувствительность на уровне 106 вирионов в мл. В качестве основы сенсорного слоя была применена кремниевая пластина с нанесенной на одну из ее сторон пленкой золота. Поверхность золота была модифицирована 3-аминопропилтриметоксисиланом, после чего выполнялась иммобилизация на модифицированной поверхности полиакриламида, содержащего сиаловые кислоты Neu5Ac2-3Gal1-4Glc. Эти сиаловые кислоты идентичны рецепторам эпителиальных клеток, связывание с которыми осуществляет гемагглютинин вируса гриппа в процессе вирусного инфицирования. Использование высокоизбирательных подложек для фиксации на их поверхности вирусных частиц является непременным условием проведения клинической диагностики заболеваний. Разработка соответствующих сенсорных слоев с требуемыми рецепторными свойствами – одна из важных и сложных задач нашего проекта.
Просвечивающая электронная микроскопия позволяет визуализировать отдельные вирусные частицы в вакууме с разрешением, обеспечивающим наблюдение структуры наружной мембраны вируса. На рис.2 представлено изображение вируса гриппа А (A / Duck / Moscow / 4182 / 2008) с частично разрушенной мембраной. Обладая высоким пространственным разрешением, просвечивающая электронная микроскопия является хорошим помощником при детальных медицинских исследованиях, однако, этот метод не подходит для массового использования. Сканирующая зондовая микроскопия дает возможность обнаружения вирусных частиц непосредственно в биологической жидкости. Как было отмечено выше, ключевым для применения этого метода является создание биочипа с высокоспецифической избирательностью по отношению к выявляемой мишени – конкретному вирусу. Использование в качестве несущей основы и регистрирующего элемента пьезокерамической пластины предложено в работе [13]. При попадании вирусной частицы на поверхность биочипа происходит изменение амплитуды и частоты резонансных колебаний пьезокерамической пластины, которое можно с высокой точностью зарегистрировать с помощью компактной радиоизмерительной схемы.
Желательно, чтобы усовершенствованный для задач медицинской диагностики СЗМ был укомплектован полностью герметичной проточной ячейкой. В существующих коммерческих моделях СЗМ герметичность последней обеспечивается при ее сборке из нескольких деталей, в том числе уплотнительных колец, непосредственно в процессе установки образца в микроскоп. Такие проточные ячейки достаточно дорогие (3 000–8 000 долл. США), поэтому их использование в качестве одноразовых элементов представляется в высшей степени нерентабельным. Кроме того, в большинстве случаев снятие образца сопровождается одновременной разгерметизацией проточной жидкостной ячейки.
Нами разработана оригинальная конструкция проточной жидкостной ячейки, которую можно ставить на микроскоп и снимать с него в полностью герметичном состоянии. Основные материалы ячейки – оргстекло и силиконовая резина, а стоимость изготовления составляет около 300 руб., что позволяет использовать ее как одноразовую. В настоящее время на конструкцию проточной жидкостной ячейки подается заявка на патент. С помощью проточной ячейки можно выполнять не только промывку сенсорной поверхности биочипа для удаления неспецифически связанных на поверхности структур, но и ее регенерацию при использовании соответствующих реагентов.
Если в качестве основы биочипа для проточной жидкостной ячейки СЗМ "ФемтоСкан" использовать пьезокерамический диск, то обнаружение вирусных и бактериальных патогенов можно одновременно проводить двумя различными способами: по изменению амплитуды и резонансных колебаний диска и по изменению профиля поверхности биочипа при присоединении вирусной частицы. Таким образом, повышается надежность и достоверность измерений, что очень важно при диагностике инфекционных заболеваний.
В начальных экспериментах для изготовления биочипов нами использовались пьезокерамические диски толщиной 0,1 мм и диаметром от 3 до 16 мм. Чувствительность биосенсора обратно пропорциональна его геометрическим размерам, поэтому перспективным является использование пьезодисков микронной толщины. Однако для этого надо преодолеть серьезные технологические трудности. Мы будем рады тем читателям, которые смогут оказать нам необходимую технологическую помощь.
При регистрации механического резонанса биочипа мы используем измерительную систему СЗМ, которая включает синтезатор частоты (диапазон 0,01 Гц – 10 МГц), входной усилитель, детектор среднеквадратичного значения и синхронный детектор. Блок-схема измерительной установки и резонансная кривая механических колебаний биочипа приведены на рис.4.
НИОКТР выполняется в МГУ им. М.В.Ломоносова при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (проект 02.G25.31.0135).
ЛИТЕРАТУРА
Bolshakova A.V., Kiselyova O.I., Yaminsky I.V. Microbial surfaces investigated using atomic force microscopy // Biotechnology Progress. 2004. V. 20. № 6. P. 1615–1622.
Bolshakova A.V., Kiselyova O.I., Filonov A.S., Frolova O.Yu., Lyubchenko Yu.L., Yaminsky I.V. Comparative studies of bacteria with atomic force microscopy operating in different modes // Ultramicroscopy. 2001. 86 (1–2). 121–128.
Яминский И.В., Демин В.В., Бондаренко В.М. Различия в клеточной поверхности гибридных бактерий Escherichia coli K12, наследующих rfb-а3,4 ген Shigella flexneri, выявляемые с помощью атомно-силовой микроскопии // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1997. № 6. С. 15–18.
Dubrovin E.V., Drygin Yu.F., Novikov V.K., Yaminsky I.V. Atomic force microscopy as a tool of inspection of viral infection // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. Vol. 3. Iss. 2. 2007. Р. 128–131.
Волынский А.Л., Баженов С.Л., Лебедева О.В., Яминский И.В., Озерин А.Н., Бакеев Н.Ф. Явление потери устойчивости жесткого покрытия при деформировании полимера-подложки. Высокомолекулярные соединения. 1997. Т. 39. № 11. С. 1805–1811.
Ivanov V.F., Gribkova O.L., Novikov S.V., Nekrasov A.A., Isakova A.A., Vannikov A.V., Meshkov G.B., Yaminsky I.V. Redox heterogeneity in polyaniline films: from molecular to macroscopic scale // Synthetic Metals. 2005. 152. 1–3. SI. 153–156.
Kiselyova O.I., Yaminsky I.V., Karpova O.V., Rodionova N.P., Kozlovsky S.V., Arkhipenko M.V., Atabekov J.G. AFM study of potato virus X disassembly induced by movement protein // Journal of Molecular Biology. 2003. 332. Р. 321–325.
Makarov V.V., Rybakova E.N., Efimov A.V., Dobrov E.N., Serebryakova M.V., Solovyev A.G., Yaminsky I.V., Taliansky M.E., Morozov S.Y., Kalinina N.O. Domain organization of the N-terminal portion of hordeivirus movement protein TGBpl // Journal of general virology. 2009. 90. Part 12. 3022–3032.
Kiselyova O.I., Yaminsky I.V., Karger E.M., Frolova O.Yu., Dorokhov Y.L., Atabekov J.G. Visualization by atomic force microscopy of tobacco mosaic virus movement protein-RNA complexes formed in vitro // Journal of General Virology. 2001. 82. 1503–1508.
Karpova O.V., Zayakina O.V., Arkhipenko M.V., Sheval E.V., Kiselyova O.I., Poljakov V.Yu., Yaminsky I.V., Rodionova N.P., Atabekov J.G. Potato virus X RNA-mediated assembly of singletailed ternary ‘coat protein-RNA-movementprotein’ complexes // Journal of General Virology. 2006. 87. 2731–2740.
Яминский И., Филонов А., Синицына О., Мешков Г. Программное обеспечение "ФемтоСкан Онлайн" // Наноиндустрия. 2016. № 2 (64). C.42–46.
Gorelkin P.V., Erofeev A.S., Kiselev G.A., Kolesov D.V., Dubrovin E.V. Yaminsky I.V. Synthetic sialylglycopolymer receptor for virus detection using cantilever-based sensors // Analyst. 2015. 140. 6131–6137.
Киселев Г., Горелкин П., Ерофеев А., Колесов Д.,
Яминский И. Детекция вирусов с помощью пьезоэлектрических кантилеверов // Наноиндустрия. 2015. 4(58). 62–67.
Отзывы читателей
