eng
Выпуск #7-8/2018
А.Ахметова, И.Яминский
Быстродействующая сканирующая зондовая микроскопия
Быстродействующая сканирующая зондовая микроскопия
Просмотры: 3074
Быстродействующая сканирующая зондовая микроскопия позволяет изучать живые объекты на молекулярном уровне с миллисекундным временным разрешением, что открывает новые возможности для биомедицины. Применяется при решении комплексных задач: определения бактериальной антибиотикорезистентности, скрининга лекарств с использованием единичной клетки, адресной доставки веществ в область биоткани и биообъекта, раннее обнаружение биологических агентов.
DOI: 10.22184/1993-8578.2018.11.7-8.530.533
DOI: 10.22184/1993-8578.2018.11.7-8.530.533
Теги: antibiotic resistance biomedicine image processing and analysis remote control scanning probe microscopy targeted delivery of biomolecules three-dimensional images антибиотикорезистентность биомедицина обработка сканирующая зондовая микроскопия
В настоящее время не удается визуализировать биологические процессы (рост бактерий и клеток, инфицирование клеток вирусом, конформационные переходы в хромосомах и пр.) в естественных средах с высоким пространственным разрешением (на уровне долей нанометра) и необходимой временной детализацией в единицы миллисекунд и менее. Для получения изображения размером 512 × 512 точек методом традиционной зондовой микроскопии при частоте сканирования 2 Гц потребуется примерно 4 мин [1].
Но с развитием техники быстродействующей зондовой микроскопии визуализация этих процессов вполне осуществима. Также с ее помощью возможна реализация нового подхода к определению антибиотикорезистентности бактериальных клеток: прекращение колебаний мембраны клетки, обусловленное внутренними метаболическими процессами под действием конкретного антибиотика, служит индикатором эффективности используемого антимикробного препарата. Структурные и динамические характеристики белковой молекулы играют центральную роль в обеспечении их биологических функций. Быстродействующая сканирующая зондовая микроскопия открывает широкие перспективы изучения белковых макромолекул в динамике. Она становится практическим инструментом при проектировании белковых и ДНК биочипов, перспективных для дальнейшего использования в медицинской диагностике. При этом становится возможным широкое использование биосенсоров, построенных на биоспецифическом взаимодействии без использования каких-либо маркеров.
Другим примером применения быстродействующей сканирующей зондовой микроскопии является разработка оригинальных методов скрининга новых лекарственных средств с участием одиночных клеток высших организмов. В этом случае возможно использовать быстродействующую многоканальную сканирующую капиллярную микроскопию, в которой каждый из каналов выполняет свою функциональную роль: доставку лекарства в клетку, измерение активности клетки, определение электрохимических параметров клетки (наличие активных форм кислорода в непосредственной близости от мембраны клеток, потенциал мембраны, проводимость ионных каналов и пр.) [2].
В области медицинской диагностики с помощью быстродействующей зондовой микроскопии решается задача раннего обнаружения биологических агентов: вирусов и бактериальных клеток. Для достижения чувствительности на уровне единичных вирусов нами запатентована конструкция проточной ячейки зондового микроскопа с установленным в нем пьезокерамическим биочипом [2]. В экспериментах используются различные штаммы вируса гриппа А и сенсорные слои на основе полисахаридов с пришитыми сиаловыми кислотами, обеспечивающие высокую избирательность [3]. Также для этих целей было разработано кантилеверное биосенсорное устройство (регистрация статического изгиба кантилевера) с чувствительностью сто миллионов вирусов в 1 мл жидкости [4].
В настоящее время мы работаем над установкой, позволяющей проводить все вышеперечисленные исследования, в частности, над созданием оригинальных программных и аппаратных комплексов сверхбыстрой цифровой обработки больших потоков данных в режиме реального времени на предельно высокой скорости, необходимых для создания биологического сканирующего зондового микроскопа.
Наша научная группа имеет большой практический опыт в зондовой микроскопии. Разработанные сканирующие зондовые микроскопы серии "ФемтоСкан" и программное обеспечение "ФемтоСкан Онлайн" активно используются во многих зарубежных и отечественных научных центрах (например, в Медицинском центре Университета Небраски (США), Университете г. Катанья (Италия), Амурском государственном университете, Алтайском государственном политехническом университете им. И.И.Ползунова, Брянском государственном университете имени академика И.Г.Петровского, Тамбовском государственном университете имени Г.Р.Державина, в МГУ имени М.В.Ломоносова и др.) при проведении медико-биологических и материаловедческих исследованиях. В МГУ имени М.В.Ломоносова в обучении и при проведении научных исследований успешно работает 18 микроскопов "ФемтоСкан". В лабораторном практикуме сканирующей зондовой микроскопии установлено шесть микроскопов "ФемтоСкан" с полным интернет-доступом ко всем режимам измерений. По отзывам пользователей, эти микроскопы удобны и надежны в использовании, не имеют отказов в эксплуатации, позволяют проводить широкий спектр измерений более чем в 100 различных режимах. Более продвинутая модель "ФемтоСкан Х" (рис.1) позволяет достигать скорости сканирования одного кадра 4 096 × 4 096 точек за 34 с [6]. При разрешении 128 × 128 точек уже достигается видеорежим 30 кадров в секунду. В настоящее время проводится работа по увеличению скорости снятия изображения примерно в 100 раз с использованием высокоскоростной электроники и сверхбыстрой механики. Это позволит снятие мегабайтного изображения поверхности в видеорежиме. Для достижения этой задачи используются комбинированные цифро-аналоговые и аналого-цифровые преобразователи, быстродействующие fpga-контроллеры, цифровые синтезаторы частоты и другие элементы быстродействующей электроники. Сканер выполнен в виде многозвенной структуры. У каждого звена своя резонансная частота и, соответственно, разный диапазон скоростей сканирования, как у коробки передач в автомобиле. Зонд имеет миниатюрную конструкцию, обеспечивающую высокую скорость отклика при крайне малых размерах и массе. Резонансная частота кантилевера должна находиться в диапазоне сотен мегагерц.
Повышение быстродействия зондовой микроскопии до значений десятков кадров в секунду позволяет существенно повысить временное разрешение и наблюдать многие процессы на поверхности в режиме реального времени [7]. Изучение картины деления бактериальной клетки, определение спектра характерных механических колебаний мембраны клетки в различных циклах жизнедеятельности – с помощью быстродействующей сканирующей зондовой микроскопии эти процессы предстают совершенно под другим углом.
Таким образом, сканирующая зондовая микроскопия в настоящее время является передовым методом для характеристики динамики сложного молекулярно-биологического механизма in vivo.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, проект № 17-52-560001.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Lyubchenko Yu.L. Direct AFM visualization of the nanoscale dynamics of biomolecular complexes. Journal of Physics D: Applied Physics, 2018, 51, 403001 (17pp).
Yaminsky I.V. Scanning capillary microscopy // Nanoindustry, 2016, № 1 (63), 76–79.
Yaminsky I.V., Akhmetova A.I., Sosnin V.S., Yaminsky D.I., Meshkov G.B., Olenin A.V. Flowing liquid cell for scanning probe microscopy. Patent RF # 2645884 28.02.18.
Yaminsky I.V., Akhmetova A.I., Meshkov G.B. Physical methods for detecting viruses and bacteria using scanning probe microscopy tools // Nanoindustry, 2017. № 3 (73), 56–59.
Nazarov I.A., Akhmetova A.I., Yaminsky I.V., Meshkov G.B., Sagitova A.V. Biosensor device for detection of biological micro- and nano-objects. Patent RF # 2016141844 17.11.17.
Filonov A., Savinov S., Sinitsyna O., Meshkov G., and Yaminsky I. The FemtoScan X is a new scanning probe microscope. Nanoindustry, 2012, № 3 (33), 48–49.
Magazov I., Savinov S., Yaminsky I. Electronics for Nanotechnology // Nanoindustry, 2011, № 5 (29), 74–75.
Но с развитием техники быстродействующей зондовой микроскопии визуализация этих процессов вполне осуществима. Также с ее помощью возможна реализация нового подхода к определению антибиотикорезистентности бактериальных клеток: прекращение колебаний мембраны клетки, обусловленное внутренними метаболическими процессами под действием конкретного антибиотика, служит индикатором эффективности используемого антимикробного препарата. Структурные и динамические характеристики белковой молекулы играют центральную роль в обеспечении их биологических функций. Быстродействующая сканирующая зондовая микроскопия открывает широкие перспективы изучения белковых макромолекул в динамике. Она становится практическим инструментом при проектировании белковых и ДНК биочипов, перспективных для дальнейшего использования в медицинской диагностике. При этом становится возможным широкое использование биосенсоров, построенных на биоспецифическом взаимодействии без использования каких-либо маркеров.
Другим примером применения быстродействующей сканирующей зондовой микроскопии является разработка оригинальных методов скрининга новых лекарственных средств с участием одиночных клеток высших организмов. В этом случае возможно использовать быстродействующую многоканальную сканирующую капиллярную микроскопию, в которой каждый из каналов выполняет свою функциональную роль: доставку лекарства в клетку, измерение активности клетки, определение электрохимических параметров клетки (наличие активных форм кислорода в непосредственной близости от мембраны клеток, потенциал мембраны, проводимость ионных каналов и пр.) [2].
В области медицинской диагностики с помощью быстродействующей зондовой микроскопии решается задача раннего обнаружения биологических агентов: вирусов и бактериальных клеток. Для достижения чувствительности на уровне единичных вирусов нами запатентована конструкция проточной ячейки зондового микроскопа с установленным в нем пьезокерамическим биочипом [2]. В экспериментах используются различные штаммы вируса гриппа А и сенсорные слои на основе полисахаридов с пришитыми сиаловыми кислотами, обеспечивающие высокую избирательность [3]. Также для этих целей было разработано кантилеверное биосенсорное устройство (регистрация статического изгиба кантилевера) с чувствительностью сто миллионов вирусов в 1 мл жидкости [4].
В настоящее время мы работаем над установкой, позволяющей проводить все вышеперечисленные исследования, в частности, над созданием оригинальных программных и аппаратных комплексов сверхбыстрой цифровой обработки больших потоков данных в режиме реального времени на предельно высокой скорости, необходимых для создания биологического сканирующего зондового микроскопа.
Наша научная группа имеет большой практический опыт в зондовой микроскопии. Разработанные сканирующие зондовые микроскопы серии "ФемтоСкан" и программное обеспечение "ФемтоСкан Онлайн" активно используются во многих зарубежных и отечественных научных центрах (например, в Медицинском центре Университета Небраски (США), Университете г. Катанья (Италия), Амурском государственном университете, Алтайском государственном политехническом университете им. И.И.Ползунова, Брянском государственном университете имени академика И.Г.Петровского, Тамбовском государственном университете имени Г.Р.Державина, в МГУ имени М.В.Ломоносова и др.) при проведении медико-биологических и материаловедческих исследованиях. В МГУ имени М.В.Ломоносова в обучении и при проведении научных исследований успешно работает 18 микроскопов "ФемтоСкан". В лабораторном практикуме сканирующей зондовой микроскопии установлено шесть микроскопов "ФемтоСкан" с полным интернет-доступом ко всем режимам измерений. По отзывам пользователей, эти микроскопы удобны и надежны в использовании, не имеют отказов в эксплуатации, позволяют проводить широкий спектр измерений более чем в 100 различных режимах. Более продвинутая модель "ФемтоСкан Х" (рис.1) позволяет достигать скорости сканирования одного кадра 4 096 × 4 096 точек за 34 с [6]. При разрешении 128 × 128 точек уже достигается видеорежим 30 кадров в секунду. В настоящее время проводится работа по увеличению скорости снятия изображения примерно в 100 раз с использованием высокоскоростной электроники и сверхбыстрой механики. Это позволит снятие мегабайтного изображения поверхности в видеорежиме. Для достижения этой задачи используются комбинированные цифро-аналоговые и аналого-цифровые преобразователи, быстродействующие fpga-контроллеры, цифровые синтезаторы частоты и другие элементы быстродействующей электроники. Сканер выполнен в виде многозвенной структуры. У каждого звена своя резонансная частота и, соответственно, разный диапазон скоростей сканирования, как у коробки передач в автомобиле. Зонд имеет миниатюрную конструкцию, обеспечивающую высокую скорость отклика при крайне малых размерах и массе. Резонансная частота кантилевера должна находиться в диапазоне сотен мегагерц.
Повышение быстродействия зондовой микроскопии до значений десятков кадров в секунду позволяет существенно повысить временное разрешение и наблюдать многие процессы на поверхности в режиме реального времени [7]. Изучение картины деления бактериальной клетки, определение спектра характерных механических колебаний мембраны клетки в различных циклах жизнедеятельности – с помощью быстродействующей сканирующей зондовой микроскопии эти процессы предстают совершенно под другим углом.
Таким образом, сканирующая зондовая микроскопия в настоящее время является передовым методом для характеристики динамики сложного молекулярно-биологического механизма in vivo.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, проект № 17-52-560001.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Lyubchenko Yu.L. Direct AFM visualization of the nanoscale dynamics of biomolecular complexes. Journal of Physics D: Applied Physics, 2018, 51, 403001 (17pp).
Yaminsky I.V. Scanning capillary microscopy // Nanoindustry, 2016, № 1 (63), 76–79.
Yaminsky I.V., Akhmetova A.I., Sosnin V.S., Yaminsky D.I., Meshkov G.B., Olenin A.V. Flowing liquid cell for scanning probe microscopy. Patent RF # 2645884 28.02.18.
Yaminsky I.V., Akhmetova A.I., Meshkov G.B. Physical methods for detecting viruses and bacteria using scanning probe microscopy tools // Nanoindustry, 2017. № 3 (73), 56–59.
Nazarov I.A., Akhmetova A.I., Yaminsky I.V., Meshkov G.B., Sagitova A.V. Biosensor device for detection of biological micro- and nano-objects. Patent RF # 2016141844 17.11.17.
Filonov A., Savinov S., Sinitsyna O., Meshkov G., and Yaminsky I. The FemtoScan X is a new scanning probe microscope. Nanoindustry, 2012, № 3 (33), 48–49.
Magazov I., Savinov S., Yaminsky I. Electronics for Nanotechnology // Nanoindustry, 2011, № 5 (29), 74–75.
Отзывы читателей
