eng
Выпуск #7-8/2021
И.В.Яминский, А.И.Ахметова, С.А.Сенотрусова
Микроскопия сверхвысокого разрешения в биомедицине и биологии
Микроскопия сверхвысокого разрешения в биомедицине и биологии
Просмотры: 1102
DOI: 10.22184/1993-8578.2021.14.7-8.424.428
Оптический микроскоп – распространенный и простой прибор для изучения объектов в микромасштабе, особенно в области биологии, биомедицины, химии. Значительное ограничение в использовании оптической микроскопии – предел оптической дифракции, который составляет примерно 250 нм в белом свете при длине волны около 550 нм и числовой апертуре микроскопа 1,0. Этого разрешения часто недостаточно для визуализации клеточных органелл, тканей, вирусных и бактериальных частиц. Микросфера на поверхности образца может преодолеть это ограничение и визуализировать структуры размером до 25 нм.
Оптический микроскоп – распространенный и простой прибор для изучения объектов в микромасштабе, особенно в области биологии, биомедицины, химии. Значительное ограничение в использовании оптической микроскопии – предел оптической дифракции, который составляет примерно 250 нм в белом свете при длине волны около 550 нм и числовой апертуре микроскопа 1,0. Этого разрешения часто недостаточно для визуализации клеточных органелл, тканей, вирусных и бактериальных частиц. Микросфера на поверхности образца может преодолеть это ограничение и визуализировать структуры размером до 25 нм.
Теги: biomedicine biotechnologies microsphere super-resolution microscopy viral and bacterial particles вирусные и бактериальные частицы микроскопия сверхвысокого разрешения микросфера
МИКРОСКОПИЯ СВЕРХВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ В БИОМЕДИЦИНЕ И БИОЛОГИИ
SUPER-RESOLUTION MICROSCOPY IN BIOMEDICINE AND BIOLOGY
И.В.Яминский1, 2, 3, д.ф.-м.н., профессор МГУ имени М.В.Ломоносова, физический и химический факультеты, генеральный директор Центра перспективных технологий, директор Энергоэффективных технологий, вед. науч. сотр. ИНЭОС РАН (ORCID: 0000-0001-8731-3947), А.И.Ахметова1, 2, 3, инженер НИИ ФХБ имени А.Н.Белозерского МГУ, ведущий специалист Центра перспективных технологий и Энергоэффективных технологий (ORCID: 0000-0002-5115-8030), С.А.Сенотрусова1, 2, студент, (ORCID: 0000-0003-0960-8920) / yaminsky@anoscopy.ru
I.V.Yaminskiy1, 2, 3, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Prof. of Lomonosov Moscow State University, Physical and Chemical departments, Director of Advanced Technologies Center, Leading Sci. of INEOS RAS, A.I.Akhmetova1, 2, 3, Engineer of A.N.Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Leading Specialist of Advanced Technologies Center and of Energy Efficient Technologies, S.A.Senotrusova1, 2, student
DOI: 10.22184/1993-8578.2021.14.7-8.424.428
Получено: 26.11.2021 г.
Оптический микроскоп – это один из самых распространенных и простых приборов для изучения объектов в микромасштабе, особенно в области биологических наук, биомедицины, химии. Значительное ограничение в использовании оптической микроскопии – предел оптической дифракции, который составляет примерно 250 нм в белом свете при длине волны около 550 нм и числовой апертуре микроскопа 1,0. Этого разрешения зачастую недостаточно для решения задач визуализации клеточных органелл, тканей, вирусных и бактериальных частиц. Микросфера, помещенная на поверхность образца, может преодолеть это ограничение и визуализировать структуры размером до 25 нм.
The optical microscope is one of the most common and simple tools for studying objects on the microscale, especially in the biological sciences, biomedicine, and chemistry. A significant limitation for use of the optical microscopy is the optical diffraction limit, which is about 250 nm in white light at a wavelength of about 550 nm and a microscope numerical aperture of 1.0. This resolution is often insufficient for imaging tasks of cell organelles, tissue, viral and bacterial particles. A microsphere placed on the sample surface can overcome this limitation and visualise structures as small as 25 nm.
ВВЕДЕНИЕ
Предел разрешающей способности в оптике был обнаружен немецким физиком Эрнстом Аббе в 1873 году, когда он определил минимальное расстояние между двумя объектами по формуле:
d =λ / (2NA), (1)
где d – минимальное расстояние между двумя структурными элементами, λ – длина волны освещения и NA – числовая апертура используемого объектива [1]. Дифракционный предел Аббе предсказывает размер объектов, различимых в объективе оптического микроскопа. Физическая причина дифракционного предела возникает из-за экспоненциально затухающих волн ближнего поля, которые несут информацию высокого разрешения об объекте и не могут распространяться в дальнем поле [2]. Это ограничивает визуализацию наноразмерных структур.
В медицине и биологии чрезвычайно требуется прибор, который позволит получать оптические изображения с высоким разрешением, превышающим дифракционный предел. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) и сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) часто используются для изображения вирусных и бактериальных частиц с очень высоким разрешением (< 10 нм) в вакууме (рис.1), но они не подходят для изучения живых объектов или взаимодействий вируса с клеткой.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Флуоресцентная оптическая микроскопия – это метод визуализации клеточных структур, бактерий и вирусов с разрешением до 6 нм [3]. Недостаток флуоресцентной оптической визуализации заключается в фотообесцвечивании, которое ограничивает максимальное время воздействия света до десятков секунд [4]. Кроме того, методы флуоресцентной оптической микроскопии зачастую требуют конъюгации флуоресцентных молекул с белками объекта исследования, и одновременно можно визуализировать только один тип окрашенного белка, тогда как в каждой клетке существует множество типов интересующих исследователей белков. Недостаток сканирующей ближнепольной оптической микроскопии заключается в продолжительном снятии кадра, необходимого для получения полного изображения, что затрудняет изучение биологических объектов в динамике.
В связи с этими ограничениями оптической микроскопии были предприняты попытки, позволяющие обойти дифракционный предел путем преобразования затухающих волн ближнего поля в распространяющиеся волны, достигающие дальнего поля. Возможность передачи информации из ближнего поля в дальнее, где она собирается с помощью обычного оптического микроскопа, осуществима благодаря размещению на поверхности образца наноразмерных линз [5], микрокапель полимера [6] или диэлектрических микросфер [7]. Также было предложено использовать микросферы с высоким показателем преломления (n > 1,8), которые полностью погружаются в жидкость или в пластины эластомера [8]. Использование иммерсионных жидкостей позволило получить изображения клеток, субклеточных структур и белков. В работе [9] с помощью линзы из BaTiO3 диаметром 100 мкм и установки для оптической микроскопии получили изображение частиц аденовируса диаметром 75 нм. Микролинзы использовали для визуализации актина [10], для определения флуоресцентно окрашенных центриолей, митохондрий, хромосом, для изучения влияния лечения доксициклином на экспрессию митохондриально-кодируемого белка в клеточной линии печени мыши [11].
В работе [12] сообщается об оптической визуализации объектов с латеральным разрешением 25 нм (∼ λ / 17) при освещении с длиной волны 408 нм путем комбинирования микросфер из плавленого кварца и полистирола с помощью обычного сканирующего лазерного конфокального микроскопа.
Недостатком микролинзовой микроскопии является ограниченное поле зрения, которое не может превышать диаметра линзы или другого объекта, помещенного на образец. Другим ограничивающим фактором является то, что микросферы размещаются на поверхности случайным образом, поэтому только определенная часть объектов может быть визуализирована, а положение линз на образце трудно изменить. Но уже ведутся работы по созданию установок для непрерывного сканирования большого поля обзора изучаемого пространства. Для создания изображений со сверхвысоким разрешением на больших участках микросферу установили на рамке, прикрепленной к объективу микроскопа, которая автоматически шаг за шагом сканирует образец [13].
ВЫВОДЫ
Нашей научной группой также ведутся работы по совершенствованию системы микролинзовой микроскопии, в частности, разрабатывается установка для совмещенной атомно-силовой и микролинзовой микроскопии на базе сканирующего зондового микроскопа "ФемтоСкан Xi" [14]. Микролинза фиксируется на кантилевере для атомно-силовой микроскопии, а сканирование осуществляется параллельно в двух режимах – в ПО отображается топография поверхности и изображение через микролинзу. Получены изображения тестовых образцов с помощью оптического микроскопа и микролинз из оксида титана TiO2. Расстояние между красными метками соответствует примерно 100 нм (рис.2).
БЛАГОДАРНОСТИ
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Лондонского Королевского Общества № 21-58-10005, РФФИ, проект № 20-32-90036. Работа выполнена при финансовой поддержке Фонда содействия инновациям, проект № 71108, договор 0071108.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Abbe E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv. Mikrosk. Anat. 1873, 9, 413–418.
Yan B., Wang Z., Parker A.L., Lai Y.K., Thomas P.J., Yue L., Monks J.N. Superlensing microscope objective lens. Appl. Opt. 56, 3142 (2017). https://doi.org/10.1364/AO.56.003142
Huang B., Wang W., Bates M., Zhuang X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science 319, 810–813 (2008). https://doi.org/10.1126/science.1153529
Renn A., Seelig J., Sandoghdar V. Oxygen-dependent photochemistry of fluorescent dyes studied at the single molecule level. Mol Phys 104, 409–414 (2006).
Gambin Y., Legrand O., Quake S.R. Microfabricated rubber microscope using soft solid immersion lenses, Appl. Phys. Lett. 88, 174102 (2006). https://doi.org/10.1063/1.2194477.
Darafsheh A., Walsh G.F., Dal Negro L., Astratov V.N. Optical super-resolution by high-index liquid immersed microspheres. Appl. Phys. Lett. 101, 141128 (2012). https://doi.org/10.1063/1.4757600
Darafsheh A., Limberopoulos N.I., Derov J.S., Walker D.E., Astratov V.N. Advantages of microsphere-assisted super-resolution imaging technique over solid immersion lens and confocal microscopies. Appl. Phys. Lett. 104, 061117 (2014). https://doi.org/10.1063/1.4864760
Darafsheh A., Guardiola C., Palovcak A., Finlay J.C., Carabe A. Optical super-resolution imaging by high-index microspheres embedded in elastomers. Opt. Lett. 40, 5 (2015). https://doi.org/10.1364/OL.40.000005
Li L., Guo W., Yan Y. et al. Label-free super-resolution imaging of adenoviruses by submerged microsphere optical nanoscopy. Light Sci Appl 2, e104 (2013). https://doi.org/10.1038/lsa.2013.60
Brettin A., Blanchette K.F., et al. Microsphere nanoscopy for imaging of actin proteins, IEEE National Aerospace and Electronics Conference (NAECON) and Ohio Innovation Summit (OIS) 269-271 (2016). https://doi.org/10.1109/NAECON. 2016.7856811.
Yang H., Moullan N., Auwerx J., Gijs M.A.M. Superresolution biological microscopy using virtual imaging by a microsphere nanoscope. Small 10, 1712 (2014). https://doi.org/10.1002/smll.201302942
Yan Y., Li L., Feng C., Guo W., Lee S., Hong M. Microsphere-coupled scanning laser confocal nanoscope for sub-diffraction-limited imaging at 25 nm lateral resolution in the visible spectrum. ACS Nano 8, 1809 (2014). https://doi.org/10.1021/nn406201q
Huszka G., Yang H., Gijs M.A.M. Microsphere-based super-resolution scanning optical microscope. Optics Express Vol. 25, Issue 13, pp. 15079-15092 (2017) https://doi.org/10.1364/OE.25.015079
Akhmetova A.I., Gukasov V.M., Rybakov Y.L., Yaminsky I.V. High-speed scanning probe microscopy in biomedicine. Bio-Medical Engineering, 54(6) 434–437 (2021). http://dx.doi.org/10.1007/s10527-021-10056-4
Декларация о конфликте интересов.
Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
SUPER-RESOLUTION MICROSCOPY IN BIOMEDICINE AND BIOLOGY
И.В.Яминский1, 2, 3, д.ф.-м.н., профессор МГУ имени М.В.Ломоносова, физический и химический факультеты, генеральный директор Центра перспективных технологий, директор Энергоэффективных технологий, вед. науч. сотр. ИНЭОС РАН (ORCID: 0000-0001-8731-3947), А.И.Ахметова1, 2, 3, инженер НИИ ФХБ имени А.Н.Белозерского МГУ, ведущий специалист Центра перспективных технологий и Энергоэффективных технологий (ORCID: 0000-0002-5115-8030), С.А.Сенотрусова1, 2, студент, (ORCID: 0000-0003-0960-8920) / yaminsky@anoscopy.ru
I.V.Yaminskiy1, 2, 3, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Prof. of Lomonosov Moscow State University, Physical and Chemical departments, Director of Advanced Technologies Center, Leading Sci. of INEOS RAS, A.I.Akhmetova1, 2, 3, Engineer of A.N.Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Leading Specialist of Advanced Technologies Center and of Energy Efficient Technologies, S.A.Senotrusova1, 2, student
DOI: 10.22184/1993-8578.2021.14.7-8.424.428
Получено: 26.11.2021 г.
Оптический микроскоп – это один из самых распространенных и простых приборов для изучения объектов в микромасштабе, особенно в области биологических наук, биомедицины, химии. Значительное ограничение в использовании оптической микроскопии – предел оптической дифракции, который составляет примерно 250 нм в белом свете при длине волны около 550 нм и числовой апертуре микроскопа 1,0. Этого разрешения зачастую недостаточно для решения задач визуализации клеточных органелл, тканей, вирусных и бактериальных частиц. Микросфера, помещенная на поверхность образца, может преодолеть это ограничение и визуализировать структуры размером до 25 нм.
The optical microscope is one of the most common and simple tools for studying objects on the microscale, especially in the biological sciences, biomedicine, and chemistry. A significant limitation for use of the optical microscopy is the optical diffraction limit, which is about 250 nm in white light at a wavelength of about 550 nm and a microscope numerical aperture of 1.0. This resolution is often insufficient for imaging tasks of cell organelles, tissue, viral and bacterial particles. A microsphere placed on the sample surface can overcome this limitation and visualise structures as small as 25 nm.
ВВЕДЕНИЕ
Предел разрешающей способности в оптике был обнаружен немецким физиком Эрнстом Аббе в 1873 году, когда он определил минимальное расстояние между двумя объектами по формуле:
d =λ / (2NA), (1)
где d – минимальное расстояние между двумя структурными элементами, λ – длина волны освещения и NA – числовая апертура используемого объектива [1]. Дифракционный предел Аббе предсказывает размер объектов, различимых в объективе оптического микроскопа. Физическая причина дифракционного предела возникает из-за экспоненциально затухающих волн ближнего поля, которые несут информацию высокого разрешения об объекте и не могут распространяться в дальнем поле [2]. Это ограничивает визуализацию наноразмерных структур.
В медицине и биологии чрезвычайно требуется прибор, который позволит получать оптические изображения с высоким разрешением, превышающим дифракционный предел. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) и сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) часто используются для изображения вирусных и бактериальных частиц с очень высоким разрешением (< 10 нм) в вакууме (рис.1), но они не подходят для изучения живых объектов или взаимодействий вируса с клеткой.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Флуоресцентная оптическая микроскопия – это метод визуализации клеточных структур, бактерий и вирусов с разрешением до 6 нм [3]. Недостаток флуоресцентной оптической визуализации заключается в фотообесцвечивании, которое ограничивает максимальное время воздействия света до десятков секунд [4]. Кроме того, методы флуоресцентной оптической микроскопии зачастую требуют конъюгации флуоресцентных молекул с белками объекта исследования, и одновременно можно визуализировать только один тип окрашенного белка, тогда как в каждой клетке существует множество типов интересующих исследователей белков. Недостаток сканирующей ближнепольной оптической микроскопии заключается в продолжительном снятии кадра, необходимого для получения полного изображения, что затрудняет изучение биологических объектов в динамике.
В связи с этими ограничениями оптической микроскопии были предприняты попытки, позволяющие обойти дифракционный предел путем преобразования затухающих волн ближнего поля в распространяющиеся волны, достигающие дальнего поля. Возможность передачи информации из ближнего поля в дальнее, где она собирается с помощью обычного оптического микроскопа, осуществима благодаря размещению на поверхности образца наноразмерных линз [5], микрокапель полимера [6] или диэлектрических микросфер [7]. Также было предложено использовать микросферы с высоким показателем преломления (n > 1,8), которые полностью погружаются в жидкость или в пластины эластомера [8]. Использование иммерсионных жидкостей позволило получить изображения клеток, субклеточных структур и белков. В работе [9] с помощью линзы из BaTiO3 диаметром 100 мкм и установки для оптической микроскопии получили изображение частиц аденовируса диаметром 75 нм. Микролинзы использовали для визуализации актина [10], для определения флуоресцентно окрашенных центриолей, митохондрий, хромосом, для изучения влияния лечения доксициклином на экспрессию митохондриально-кодируемого белка в клеточной линии печени мыши [11].
В работе [12] сообщается об оптической визуализации объектов с латеральным разрешением 25 нм (∼ λ / 17) при освещении с длиной волны 408 нм путем комбинирования микросфер из плавленого кварца и полистирола с помощью обычного сканирующего лазерного конфокального микроскопа.
Недостатком микролинзовой микроскопии является ограниченное поле зрения, которое не может превышать диаметра линзы или другого объекта, помещенного на образец. Другим ограничивающим фактором является то, что микросферы размещаются на поверхности случайным образом, поэтому только определенная часть объектов может быть визуализирована, а положение линз на образце трудно изменить. Но уже ведутся работы по созданию установок для непрерывного сканирования большого поля обзора изучаемого пространства. Для создания изображений со сверхвысоким разрешением на больших участках микросферу установили на рамке, прикрепленной к объективу микроскопа, которая автоматически шаг за шагом сканирует образец [13].
ВЫВОДЫ
Нашей научной группой также ведутся работы по совершенствованию системы микролинзовой микроскопии, в частности, разрабатывается установка для совмещенной атомно-силовой и микролинзовой микроскопии на базе сканирующего зондового микроскопа "ФемтоСкан Xi" [14]. Микролинза фиксируется на кантилевере для атомно-силовой микроскопии, а сканирование осуществляется параллельно в двух режимах – в ПО отображается топография поверхности и изображение через микролинзу. Получены изображения тестовых образцов с помощью оптического микроскопа и микролинз из оксида титана TiO2. Расстояние между красными метками соответствует примерно 100 нм (рис.2).
БЛАГОДАРНОСТИ
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Лондонского Королевского Общества № 21-58-10005, РФФИ, проект № 20-32-90036. Работа выполнена при финансовой поддержке Фонда содействия инновациям, проект № 71108, договор 0071108.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Abbe E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv. Mikrosk. Anat. 1873, 9, 413–418.
Yan B., Wang Z., Parker A.L., Lai Y.K., Thomas P.J., Yue L., Monks J.N. Superlensing microscope objective lens. Appl. Opt. 56, 3142 (2017). https://doi.org/10.1364/AO.56.003142
Huang B., Wang W., Bates M., Zhuang X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science 319, 810–813 (2008). https://doi.org/10.1126/science.1153529
Renn A., Seelig J., Sandoghdar V. Oxygen-dependent photochemistry of fluorescent dyes studied at the single molecule level. Mol Phys 104, 409–414 (2006).
Gambin Y., Legrand O., Quake S.R. Microfabricated rubber microscope using soft solid immersion lenses, Appl. Phys. Lett. 88, 174102 (2006). https://doi.org/10.1063/1.2194477.
Darafsheh A., Walsh G.F., Dal Negro L., Astratov V.N. Optical super-resolution by high-index liquid immersed microspheres. Appl. Phys. Lett. 101, 141128 (2012). https://doi.org/10.1063/1.4757600
Darafsheh A., Limberopoulos N.I., Derov J.S., Walker D.E., Astratov V.N. Advantages of microsphere-assisted super-resolution imaging technique over solid immersion lens and confocal microscopies. Appl. Phys. Lett. 104, 061117 (2014). https://doi.org/10.1063/1.4864760
Darafsheh A., Guardiola C., Palovcak A., Finlay J.C., Carabe A. Optical super-resolution imaging by high-index microspheres embedded in elastomers. Opt. Lett. 40, 5 (2015). https://doi.org/10.1364/OL.40.000005
Li L., Guo W., Yan Y. et al. Label-free super-resolution imaging of adenoviruses by submerged microsphere optical nanoscopy. Light Sci Appl 2, e104 (2013). https://doi.org/10.1038/lsa.2013.60
Brettin A., Blanchette K.F., et al. Microsphere nanoscopy for imaging of actin proteins, IEEE National Aerospace and Electronics Conference (NAECON) and Ohio Innovation Summit (OIS) 269-271 (2016). https://doi.org/10.1109/NAECON. 2016.7856811.
Yang H., Moullan N., Auwerx J., Gijs M.A.M. Superresolution biological microscopy using virtual imaging by a microsphere nanoscope. Small 10, 1712 (2014). https://doi.org/10.1002/smll.201302942
Yan Y., Li L., Feng C., Guo W., Lee S., Hong M. Microsphere-coupled scanning laser confocal nanoscope for sub-diffraction-limited imaging at 25 nm lateral resolution in the visible spectrum. ACS Nano 8, 1809 (2014). https://doi.org/10.1021/nn406201q
Huszka G., Yang H., Gijs M.A.M. Microsphere-based super-resolution scanning optical microscope. Optics Express Vol. 25, Issue 13, pp. 15079-15092 (2017) https://doi.org/10.1364/OE.25.015079
Akhmetova A.I., Gukasov V.M., Rybakov Y.L., Yaminsky I.V. High-speed scanning probe microscopy in biomedicine. Bio-Medical Engineering, 54(6) 434–437 (2021). http://dx.doi.org/10.1007/s10527-021-10056-4
Декларация о конфликте интересов.
Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
Отзывы читателей
