eng
Выпуск #1/2022
И.В.Яминский, А.И.Ахметова
СКАНИРУЮЩАЯ ЗОНДОВАЯ МИКРОСКОПИЯ БАКТЕРИЙ: ГЕНОТИП И ФЕНОТИП
СКАНИРУЮЩАЯ ЗОНДОВАЯ МИКРОСКОПИЯ БАКТЕРИЙ: ГЕНОТИП И ФЕНОТИП
Просмотры: 376
10.22184/1993-8578.2022.15.1.38.43
Получено: 5.01.2022 г. | Принято: 16.01.2022 г. | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2022.15.1.38.43
Научная статья
СКАНИРУЮЩАЯ ЗОНДОВАЯ МИКРОСКОПИЯ БАКТЕРИЙ: ГЕНОТИП И ФЕНОТИП
И.В.Яминский1, 2, 3, д.ф.-м.н., проф. физического и химического факультетов МГУ имени М.В. Ломоносова, генеральный директор Центра перспективных технологий, директор Энергоэффективных технологий, ORCID: 0000-0001-8731-3947
А.И.Ахметова1 ,2, 3, инженер НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ, ведущий специалист Центра перспективных технологий и Энергоэффективных технологий, ORCID: 0000-0002-5115-8030 /
yaminsky@nanoscopy.ru
Аннотация. Свойства и внешний вид бактериальной клетки определяется во многом генотипом – последовательностью оснований в ее ДНК. И можно было бы считать, что для детального анализа достаточно задокументировать всего лишь саму молекулу ДНК. К сожалению, это верно, но далеко не в полной мере. Например, рассмотрим важный случай для клинической диагностики, когда врачу надо обнаружить у пациента возбудителя бактериальной инфекции и оценить его устойчивость к антибиотику. Ситуация типичная для современных больниц, особенно при возникновении внутрибольничных инфекций. Тактика разумных действий может состоять во взятии пробы, наращивании и выделении клеток, извлечении из них ДНК, проведении генетического исследования, например в простейшем случае ПЦР-теста. Вопрос состоит в том, достаточно ли этого.
Ключевые слова: сканирующая зондовая микроскопия, генотип, фенотип, ПЦР-тест, ФемтоСкан Онлайн, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, 3D view
Для цитирования: И.В.Яминский, А.И.Ахметова. Сканирующая зондовая микроскопия бактерий: генотип и фенотип. НАНОИНДУСТРИЯ. 2022. Т. 15, № 1. С. 38–43. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2022.15.1.38.43
Received: 5.01.2022 | Accepted: 16.01.2022 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2022.15.1.38.43
Original paper
SCANNING PROBE MICROSCOPY OF BACTERIA: GENOTYPE AND PHENOTYPE
I.V.Yaminskiy1, 2, 3, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Prof. of Lomonosov Moscow State University, Physical and Chemical departments, Director of Advanced Technologies Center, Leading Sci. of INEOS RAS, ORCID: 0000-0001-8731-3947
A.I.Akhmetova1, 2, 3, Engineer of A.N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Leading Specialist of Advanced Technologies Center and of Energy Efficient Technologies, ORCID: 0000-0002-5115-8030 / yaminsky@nanoscopy.ru
Abstract. The properties and appearance of a bacterial cell are largely determined by the genotype – the sequence of bases in its DNA. And one would think that documenting just a DNA molecule itself would be sufficient for a detailed analysis. Unfortunately, this is true, but not to the full. For example, consider the important case for clinical diagnosis, where a physician needs to detect a bacterial pathogen in a patient and assess its resistance to an antibiotic. This is a typical situation in modern hospitals, especially when nosocomial infections occur. Prudent tactics may consist of taking a sample, growing and isolating cells, extracting DNA from them, and performing genetic testing, e.g. in the simplest case of a PCR test. The question is whether this is sufficient enough.
Keywords: scanning probe microscopy, genotype, phenotype, PCR test, FemtoScan Online, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, 3D view
For citation: I.V.Yaminsky, A.I.Akhmetova. Scanning probe microscopy of bacteria: genotype and phenotype. NANOINDUSTRY. 2022. V. 15, no. 1. PP. 38–43. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2022.15.1.38.43
ВВЕДЕНИЕ
Для примера рассмотрим случаи, достаточно редкие, но исключить которые теоретически нельзя. Допустим, что в пробе и в самом организме были только нежизнеспособные или мертвые бактерии, которые уже не могут принести вред организму. ПЦР-тест обнаруживает ДНК и сигналит о наличии опасных возбудителей. Врач в соответствии с рекомендациями прописывает курс антибиотиков, которые в данном случае никакой пользы не принесут, а только вред. Возможен и другой случай, когда бактерии еще живые, но они утратили часть активности ферментов под действием уже проведенного лечения. Опять генетический тест сигналит об опасности, которой уже нет.
У мамонта, пролежавшего 5 млн лет, можно найти цельную ДНК. ДНК есть, а живого мамонта нет. Возможно, в будущем ученые этот пробел исправят. В этом примере получается так, что просто наличие ДНК во взятом образце еще не говорит о наличии самого ее носителя.
Есть закономерный вопрос. Все ли бактерии с одинаковым генотипом будут иметь и одинаковый фенотип? Другими словами, являются ли бактерии-близнецы точными копиями друг друга? Ответ на этот вопрос приоткрывает зондовая микроскопия. Если взять одну бактерию и вырастить колонию на питательной среде, то легко заметить, что бактерии в колонии разного размера и имеют слегка различную форму (рис.1). Часто по краям колонии располагаются бактерии большего размера. Если говорить совсем строго, то в море бактерий не увидишь двух абсолютно одинаковых. Обратную ситуацию мы часто встречаем у близнецов. Полное или очень близкое внешнее сходство.
Какая бактерия потенциально опасна для человека? Та, которая уже занесена учеными в определитель опасных бактерий. Но чтобы бактерия стала реально опасной, она должна жить полноценной жизнью, в том числе двигаться и размножаться путем деления. Например, каждые 20–40 мин. Такие патогенные бактерии представляют наибольшую опасность для развития болезни.
Нужно ли изучать фенотип бактерий, например внешний вид, структуру, особенности и прочее? Причем не статический фенотип, а фенотип в динамике, в развитии. В полное описание бактерии должны входить описание генотипа (генетический протокол) и описание фенотипа в процессе жизнедеятельности. Именно второе описание и позволяет делать сканирующая зондовая микроскопия.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
С 1996 года зондовая микроскопия стала важным инструментом для наблюдения бактериальных клеток. Уже тогда в содружестве с Институтом имени Н. Ф. Гамалеи (ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи" Минздрава России) удалось обнаружить различие в родительском штамме бактерий Escherichia coli и трансдуктантном штамме, полученном из родительского путем добавления rfb-a3,4 гена от Shigella flexneri [1]. Следует отметить, что до настоящего времени не создано полноценного протокола анализа и описания изображения бактериальных клеток, полученных с помощью сканирующей зондовой микроскопии.
Сканирующая зондовая микроскопия дает широкий инструментарий для изучения бактериальных клеток. В его арсенале: получение трехмерного изображения с нанометровой детализацией, составление карт механических локальных свойств поверхности – жесткости, трения, адгезии, износостойкости, сопротивления к разрушению. Наблюдения с живыми бактериями можно проводить в динамике как на воздухе, так и в жидкости.
В настоящей работе нами предприняты попытки разработки функционала программного обеспечения для проведения морфологического анализа бактериальных клеток. Разработанный функционал представляет собой модуль, встраиваемый в программное обеспечение "ФемтоСкан Онлайн", который проводит следующие основные количественные измерения:
Отработка функционала проводилась в основном на примере бактериальных клеток Escherichia coli. На рис.2 представлена колония бактерии кишечной палочки и гистограмма распределения частиц по высоте, на рис.3 – измерение контурной длины выроста кишечной палочки.
Дополнительно анализ проводился на бактериях Klebsiella pneumoniae. На рис.4 и в табл.1 приведены данные измерения шероховатости поверхности бактерии Klebsiella pneumoniae. Анализ шероховатости поверхности проводится по измерениям неровностей на базовой линии или плоскости. Параметр Ra показывает среднее арифметическое отклонение профиля от средней наклонной прямой или плоскости, но данный показатель не является достаточно информативным, так как поверхности могут иметь одинаковую среднюю шероховатость, но иметь разную форму. Поэтому зачастую используется параметр Rq, который показывает среднеквадратичное отклонение профиля поверхности относительно базовой линии. Rmax отражает расстояние между наибольшей впадиной и наибольшим пиком на базовой линии. Rz измеряет неровность профиля по 10 точкам (5 наибольших впадин и 5 наибольших пиков). В случае с бактерией Klebsiella pneumoniae составляет –0,005 нм. Параметр асимметрии Rsk показывает распределение вероятности, что профиль имеет заданную высоту Z. В нашем случае показатель является отрицательным, что характерно для поверхности с четкими глубокими впадинами на гладком плато.
Команда поиска объектов позволяет находить объекты на изображении и характеризовать их. На рис.5 представлено изображение найденного объекта Klebsiella pneumoniae. Автоматически формируются значения периметра, площади, объема, дисперсия высоты объекта, форм-фактора (табл.2).
ВЫВОДЫ
Представленный в статье функционал дает количественную характеристику исследуемого штамма бактерий. Вместе с тем наглядное эмоциональное восприятие получаемых изображений является важной составляющей проводимых наблюдений. В этом направлении большие возможности открывает программное обеспечение "ФемтоСкан Онлайн" [2–5]. Среди них построение изображений бактерий в различных цветовых палитрах для топографии (вида сверху) и трехмерного изображения с настраиваемыми углами наблюдения, режимами подсветки, масштабированием. Программа позволяет осуществлять монтаж пролета над бактерией, создавая таким образом увлекательные видеоролики. Но об этом должен быть отдельный рассказ.
БЛАГОДАРНОСТИ
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Лондонского Королевского Общества № 21-58-10005, РФФИ, проект № 20-32-90036; Фонда содействия инновациям, проект № 71108, договор 0071108, а также при содействии компании ООО "Эндор" (Москва, Россия).
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Yaminsky I.V., Demin V.V., Bondarenko V.M. Differences in Cellular Surface of Hybrid Bacteria Escherichia Coli K12 Inheriting rfb-a3,4 Gene of Shigella Flexneri as Revealed by Atomic Force Microscopy. J. Microbiology, Epidemiology and Immunology, 1997, vol. 6, p. 15.
Yaminsky I.V., Akhmetova A.I., Meshkov G.B. Online software and visualization of nanoobjects in high-resolution microscopy. NANOINDUSTRY, 11. 6 (85), (2018). PP. 414–416.
Yaminsky I.V., Akhmetova A.I. FemtoScan Online software platform for biomedical applications and materials science. Medicine and high technologies, 2. (2018). PP. 10–13.
Filonov A.S., Yaminsky I.V., Akhmetova A.I., Meshkov G.B. FemtoScan Online! Why? Nanoindustry, 84 (5), (2018), pp. 339–342.
Yaminsky I.V., Akhmetova A.I. Atomic force microscopy: study of viruses. NANOINDUSTRY. 2021. 14, 2. PP. 102–106. https://dx.doi.org/10.22184/1993-8578.2021.14.2.102.106.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
Научная статья
СКАНИРУЮЩАЯ ЗОНДОВАЯ МИКРОСКОПИЯ БАКТЕРИЙ: ГЕНОТИП И ФЕНОТИП
И.В.Яминский1, 2, 3, д.ф.-м.н., проф. физического и химического факультетов МГУ имени М.В. Ломоносова, генеральный директор Центра перспективных технологий, директор Энергоэффективных технологий, ORCID: 0000-0001-8731-3947
А.И.Ахметова1 ,2, 3, инженер НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ, ведущий специалист Центра перспективных технологий и Энергоэффективных технологий, ORCID: 0000-0002-5115-8030 /
yaminsky@nanoscopy.ru
Аннотация. Свойства и внешний вид бактериальной клетки определяется во многом генотипом – последовательностью оснований в ее ДНК. И можно было бы считать, что для детального анализа достаточно задокументировать всего лишь саму молекулу ДНК. К сожалению, это верно, но далеко не в полной мере. Например, рассмотрим важный случай для клинической диагностики, когда врачу надо обнаружить у пациента возбудителя бактериальной инфекции и оценить его устойчивость к антибиотику. Ситуация типичная для современных больниц, особенно при возникновении внутрибольничных инфекций. Тактика разумных действий может состоять во взятии пробы, наращивании и выделении клеток, извлечении из них ДНК, проведении генетического исследования, например в простейшем случае ПЦР-теста. Вопрос состоит в том, достаточно ли этого.
Ключевые слова: сканирующая зондовая микроскопия, генотип, фенотип, ПЦР-тест, ФемтоСкан Онлайн, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, 3D view
Для цитирования: И.В.Яминский, А.И.Ахметова. Сканирующая зондовая микроскопия бактерий: генотип и фенотип. НАНОИНДУСТРИЯ. 2022. Т. 15, № 1. С. 38–43. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2022.15.1.38.43
Received: 5.01.2022 | Accepted: 16.01.2022 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2022.15.1.38.43
Original paper
SCANNING PROBE MICROSCOPY OF BACTERIA: GENOTYPE AND PHENOTYPE
I.V.Yaminskiy1, 2, 3, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Prof. of Lomonosov Moscow State University, Physical and Chemical departments, Director of Advanced Technologies Center, Leading Sci. of INEOS RAS, ORCID: 0000-0001-8731-3947
A.I.Akhmetova1, 2, 3, Engineer of A.N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Leading Specialist of Advanced Technologies Center and of Energy Efficient Technologies, ORCID: 0000-0002-5115-8030 / yaminsky@nanoscopy.ru
Abstract. The properties and appearance of a bacterial cell are largely determined by the genotype – the sequence of bases in its DNA. And one would think that documenting just a DNA molecule itself would be sufficient for a detailed analysis. Unfortunately, this is true, but not to the full. For example, consider the important case for clinical diagnosis, where a physician needs to detect a bacterial pathogen in a patient and assess its resistance to an antibiotic. This is a typical situation in modern hospitals, especially when nosocomial infections occur. Prudent tactics may consist of taking a sample, growing and isolating cells, extracting DNA from them, and performing genetic testing, e.g. in the simplest case of a PCR test. The question is whether this is sufficient enough.
Keywords: scanning probe microscopy, genotype, phenotype, PCR test, FemtoScan Online, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, 3D view
For citation: I.V.Yaminsky, A.I.Akhmetova. Scanning probe microscopy of bacteria: genotype and phenotype. NANOINDUSTRY. 2022. V. 15, no. 1. PP. 38–43. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2022.15.1.38.43
ВВЕДЕНИЕ
Для примера рассмотрим случаи, достаточно редкие, но исключить которые теоретически нельзя. Допустим, что в пробе и в самом организме были только нежизнеспособные или мертвые бактерии, которые уже не могут принести вред организму. ПЦР-тест обнаруживает ДНК и сигналит о наличии опасных возбудителей. Врач в соответствии с рекомендациями прописывает курс антибиотиков, которые в данном случае никакой пользы не принесут, а только вред. Возможен и другой случай, когда бактерии еще живые, но они утратили часть активности ферментов под действием уже проведенного лечения. Опять генетический тест сигналит об опасности, которой уже нет.
У мамонта, пролежавшего 5 млн лет, можно найти цельную ДНК. ДНК есть, а живого мамонта нет. Возможно, в будущем ученые этот пробел исправят. В этом примере получается так, что просто наличие ДНК во взятом образце еще не говорит о наличии самого ее носителя.
Есть закономерный вопрос. Все ли бактерии с одинаковым генотипом будут иметь и одинаковый фенотип? Другими словами, являются ли бактерии-близнецы точными копиями друг друга? Ответ на этот вопрос приоткрывает зондовая микроскопия. Если взять одну бактерию и вырастить колонию на питательной среде, то легко заметить, что бактерии в колонии разного размера и имеют слегка различную форму (рис.1). Часто по краям колонии располагаются бактерии большего размера. Если говорить совсем строго, то в море бактерий не увидишь двух абсолютно одинаковых. Обратную ситуацию мы часто встречаем у близнецов. Полное или очень близкое внешнее сходство.
Какая бактерия потенциально опасна для человека? Та, которая уже занесена учеными в определитель опасных бактерий. Но чтобы бактерия стала реально опасной, она должна жить полноценной жизнью, в том числе двигаться и размножаться путем деления. Например, каждые 20–40 мин. Такие патогенные бактерии представляют наибольшую опасность для развития болезни.
Нужно ли изучать фенотип бактерий, например внешний вид, структуру, особенности и прочее? Причем не статический фенотип, а фенотип в динамике, в развитии. В полное описание бактерии должны входить описание генотипа (генетический протокол) и описание фенотипа в процессе жизнедеятельности. Именно второе описание и позволяет делать сканирующая зондовая микроскопия.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
С 1996 года зондовая микроскопия стала важным инструментом для наблюдения бактериальных клеток. Уже тогда в содружестве с Институтом имени Н. Ф. Гамалеи (ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи" Минздрава России) удалось обнаружить различие в родительском штамме бактерий Escherichia coli и трансдуктантном штамме, полученном из родительского путем добавления rfb-a3,4 гена от Shigella flexneri [1]. Следует отметить, что до настоящего времени не создано полноценного протокола анализа и описания изображения бактериальных клеток, полученных с помощью сканирующей зондовой микроскопии.
Сканирующая зондовая микроскопия дает широкий инструментарий для изучения бактериальных клеток. В его арсенале: получение трехмерного изображения с нанометровой детализацией, составление карт механических локальных свойств поверхности – жесткости, трения, адгезии, износостойкости, сопротивления к разрушению. Наблюдения с живыми бактериями можно проводить в динамике как на воздухе, так и в жидкости.
В настоящей работе нами предприняты попытки разработки функционала программного обеспечения для проведения морфологического анализа бактериальных клеток. Разработанный функционал представляет собой модуль, встраиваемый в программное обеспечение "ФемтоСкан Онлайн", который проводит следующие основные количественные измерения:
- определение геометрических размеров объектов: длины, ширины, высоты, площади, объема;
- вычисление контурной длины и форм фактора объектов;
- определение параметров шероховатости поверхности объектов;
- определение гетерогенности микробных и клеточных объектов;
- характеризацию клеточных выростов у бактериальных клеток;
- построение таблицы и гистограммы распределения измеряемых морфологических параметров объектов.
Отработка функционала проводилась в основном на примере бактериальных клеток Escherichia coli. На рис.2 представлена колония бактерии кишечной палочки и гистограмма распределения частиц по высоте, на рис.3 – измерение контурной длины выроста кишечной палочки.
Дополнительно анализ проводился на бактериях Klebsiella pneumoniae. На рис.4 и в табл.1 приведены данные измерения шероховатости поверхности бактерии Klebsiella pneumoniae. Анализ шероховатости поверхности проводится по измерениям неровностей на базовой линии или плоскости. Параметр Ra показывает среднее арифметическое отклонение профиля от средней наклонной прямой или плоскости, но данный показатель не является достаточно информативным, так как поверхности могут иметь одинаковую среднюю шероховатость, но иметь разную форму. Поэтому зачастую используется параметр Rq, который показывает среднеквадратичное отклонение профиля поверхности относительно базовой линии. Rmax отражает расстояние между наибольшей впадиной и наибольшим пиком на базовой линии. Rz измеряет неровность профиля по 10 точкам (5 наибольших впадин и 5 наибольших пиков). В случае с бактерией Klebsiella pneumoniae составляет –0,005 нм. Параметр асимметрии Rsk показывает распределение вероятности, что профиль имеет заданную высоту Z. В нашем случае показатель является отрицательным, что характерно для поверхности с четкими глубокими впадинами на гладком плато.
Команда поиска объектов позволяет находить объекты на изображении и характеризовать их. На рис.5 представлено изображение найденного объекта Klebsiella pneumoniae. Автоматически формируются значения периметра, площади, объема, дисперсия высоты объекта, форм-фактора (табл.2).
ВЫВОДЫ
Представленный в статье функционал дает количественную характеристику исследуемого штамма бактерий. Вместе с тем наглядное эмоциональное восприятие получаемых изображений является важной составляющей проводимых наблюдений. В этом направлении большие возможности открывает программное обеспечение "ФемтоСкан Онлайн" [2–5]. Среди них построение изображений бактерий в различных цветовых палитрах для топографии (вида сверху) и трехмерного изображения с настраиваемыми углами наблюдения, режимами подсветки, масштабированием. Программа позволяет осуществлять монтаж пролета над бактерией, создавая таким образом увлекательные видеоролики. Но об этом должен быть отдельный рассказ.
БЛАГОДАРНОСТИ
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Лондонского Королевского Общества № 21-58-10005, РФФИ, проект № 20-32-90036; Фонда содействия инновациям, проект № 71108, договор 0071108, а также при содействии компании ООО "Эндор" (Москва, Россия).
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Yaminsky I.V., Demin V.V., Bondarenko V.M. Differences in Cellular Surface of Hybrid Bacteria Escherichia Coli K12 Inheriting rfb-a3,4 Gene of Shigella Flexneri as Revealed by Atomic Force Microscopy. J. Microbiology, Epidemiology and Immunology, 1997, vol. 6, p. 15.
Yaminsky I.V., Akhmetova A.I., Meshkov G.B. Online software and visualization of nanoobjects in high-resolution microscopy. NANOINDUSTRY, 11. 6 (85), (2018). PP. 414–416.
Yaminsky I.V., Akhmetova A.I. FemtoScan Online software platform for biomedical applications and materials science. Medicine and high technologies, 2. (2018). PP. 10–13.
Filonov A.S., Yaminsky I.V., Akhmetova A.I., Meshkov G.B. FemtoScan Online! Why? Nanoindustry, 84 (5), (2018), pp. 339–342.
Yaminsky I.V., Akhmetova A.I. Atomic force microscopy: study of viruses. NANOINDUSTRY. 2021. 14, 2. PP. 102–106. https://dx.doi.org/10.22184/1993-8578.2021.14.2.102.106.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
Отзывы читателей
