eng
Выпуск #3-4/2024
Д.В.Багров, Е.Р.Павлова, А.С.Богданова, А.М.Мойсенович, Т.В.Митько, А.А.Рамонова, Д.В.Клинов
КОРРЕЛЯЦИОННАЯ МИКРОСКОПИЯ СЭМ-КЛСМ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭЛЕКТРОФОРМОВАННЫХ ВОЛОКОН ЖЕЛАТИНА
КОРРЕЛЯЦИОННАЯ МИКРОСКОПИЯ СЭМ-КЛСМ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭЛЕКТРОФОРМОВАННЫХ ВОЛОКОН ЖЕЛАТИНА
Просмотры: 694
DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.3-4.208.218
Наиболее полную информацию о микроструктуре образца можно получить, комбинируя разные виды микроскопии высокого разрешения. Такая комбинация оказывается особенно информативной, если измерения проводятся не просто на одном и том же образце, но и на одной и той же области образца – этот подход называется корреляционной микроскопией. Обычно такие измерения требуют специальной подготовки образца и его перемещения между двумя микроскопами. В данной работе описано использование корреляционной микроскопии, объединяющей сканирующую электронную (СЭМ) и лазерную сканирующую конфокальную (КЛСМ). С помощью этих двух методов исследованы электроформованные волокна желатина, нанесенные на металлизированное стекло. Показана возможность использования корреляционного анализа для совмещения изображений, полученных СЭМ и КЛСМ.
Наиболее полную информацию о микроструктуре образца можно получить, комбинируя разные виды микроскопии высокого разрешения. Такая комбинация оказывается особенно информативной, если измерения проводятся не просто на одном и том же образце, но и на одной и той же области образца – этот подход называется корреляционной микроскопией. Обычно такие измерения требуют специальной подготовки образца и его перемещения между двумя микроскопами. В данной работе описано использование корреляционной микроскопии, объединяющей сканирующую электронную (СЭМ) и лазерную сканирующую конфокальную (КЛСМ). С помощью этих двух методов исследованы электроформованные волокна желатина, нанесенные на металлизированное стекло. Показана возможность использования корреляционного анализа для совмещения изображений, полученных СЭМ и КЛСМ.
Получено: 25.03.2024 г. | Принято: 30.03.2024 г. | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.3-4.208.218
Научная статья
КОРРЕЛЯЦИОННАЯ МИКРОСКОПИЯ СЭМ-КЛСМ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭЛЕКТРОФОРМОВАННЫХ ВОЛОКОН ЖЕЛАТИНА
Д.В.Багров1, к.ф.-м.н., вед. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-6355-7282 / bagrov@mail.bio.msu.ru
Е.Р.Павлова2, к.ф.-м.н., науч. сотр., ORCID: 0000-0002-2511-7622
А.С.Богданова2, 3, мл. науч. сотр., ORCID: 0000-0001-5369-8519
А.М.Мойсенович1, к.б.н., вед. науч. сотр., ORCID: 0000-0001-5379-5829
Т.В.Митько2, 3, к.б.н., мл. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-0107-1906
А.А.Рамонова1, мл. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-3081-4721
Д.В.Клинов2, 3, к.ф.-м.н., зав. лаб., ORCID: 0000-0001-8288-2198
Аннотация. Наиболее полную информацию о микроструктуре образца можно получить, комбинируя разные виды микроскопии высокого разрешения. Такая комбинация оказывается особенно информативной, если измерения проводятся не просто на одном и том же образце, но и на одной и той же области образца – этот подход называется корреляционной микроскопией. Обычно такие измерения требуют специальной подготовки образца и его перемещения между двумя микроскопами. В данной работе описано использование корреляционной микроскопии, объединяющей сканирующую электронную (СЭМ) и лазерную сканирующую конфокальную (КЛСМ). С помощью этих двух методов исследованы электроформованные волокна желатина, нанесенные на металлизированное стекло. Показана возможность использования корреляционного анализа для совмещения изображений, полученных СЭМ и КЛСМ.
Ключевые слова: корреляционная микроскопия, желатин, металлизированное стекло, СЭМ, КЛСМ
Для цитирования: Д.В. Багров, Е.Р. Павлова, А.С. Богданова, А.М. Мойсенович, Т.В. Митько, А.А. Рамонова, Д.В. Клинов. Корреляционная микроскопия СЭМ-КЛСМ и ее применение для исследования электроформованных волокон желатина. НАНОИНДУСТРИЯ. 2024. Т. 17. № 3–4. С. 208–218. https://doi.org/
10.22184/1993-8578.2024.17.3-4.208.218
Received: 25.03.2024 | Accepted: 30.03.2024 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.3-4.208.218
Original paper
SEM-CLSM CORRELATION MICROSCOPY AND ITS APPLICATION TO ELECTROSPUN GELATIN FIBERS
D.V.Bagrov1, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Leading Researcher, ORCID: 0000-0002-6355-7282 / bagrov@mail.bio.msu.ru
E.R.Pavlova2, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Researcher, ORCID: 0000-0002-2511-7622
A.S.Bogdanova2, 3, Junior Researcher, ORCID: 0000-0001-5369-8519
A.M.Moysenovich1, Cand. of Sci. (Biological), Leading Researcher, ORCID: 0000-0001-5379-5829
T.V.Mitko2, 3, Cand. of Sci. (Biological), Junior Researcher, ORCID: 0000-0002-0107-1906
A.A.Ramonova1, Junior Researcher, ORCID: 0000-0002-3081-4721
D.V.Klinov2, 3, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Head of Laboratory, ORCID: 0000-0001-8288-2198
Abstract. The most comprehensive information about microstructure of the sample can be obtained by combining different types of high-resolution microscopy. This combination turns out to be especially informative when measurements are carried out not only on the same image, but on the same area of the sample. This approach is called correlation microscopy. Typically, such experiments require careful preparation of the sample and transferring it between the two microscopes. The current work uses correlation microscopy which combines scanning electron microscopy (SEM) and confocal laser scanning microscopy (CLSM). Electrospun gelatin fibers deposited onto metallized glass are studied using these two methods. The possibility of using correlation analysis to combine images obtained by SEM and CLSM is demonstrated.
Keywords: correlation microscopy, gelatin, metallized glass, SEM, CLSM
For citation: D.V. Bagrov, E.R. Pavlova, A.S. Bogdanova, A.M. Moysenovich, T.V. Mitko, A.A. Ramonova, D.V. Klinov. SEM-CLSM correlation microscopy and its application to electrospun gelatin fibers. NANOINDUSTRY. 2024. Vol. 17. No. 3–4. PP. 208–218. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.3-4.208.218.
ВВЕДЕНИЕ
В начале 21 века на фоне стремительного развития нанотехнологий получили распространение методы микроскопии высокого разрешения: атомно-силовой (АСМ), просвечивающей и сканирующей электронной (ПЭМ и СЭМ), высокоразрешающей оптической и др. Эти методы позволяют не только определить структуру образца с высоким пространственным разрешением, но и измерить некоторые локальные свойства. Например, с помощью АСМ измеряют локальные механические свойства образцов (прежде всего, модуль Юнга и адгезию), а методика рентгеновской микроспектроскопии позволяет определять элементный состав в СЭМ и ПЭМ.
Наиболее полную информацию об исследуемом образце можно получить при использовании нескольких методов. В частности, существует подход под названием “корреляционная микроскопия”, который предполагает получение изображений одной и той же области образца с помощью последовательного использования нескольких разных видов микроскопии. Обычно такие эксперименты предполагают физическое перемещение образца между микроскопами или же использование специализированных комбинированных приборов, которые объединяют в себе несколько видов микроскопии, например, совмещают АСМ и СЭМ [1] или КР-микроспектроскопию и АСМ [2].
В данной работе методы СЭМ и лазерная сканирующая конфокальная микроскопия (КЛСМ) были объединены для изучения локальных свойств электроформованных волокон из желатина. Результатами экспериментов по корреляционной микроскопии были пары изображений, полученных двумя использованными методами. Объектом исследования были желатиновые волокна, изготовленные с помощью электроформования (электроспиннинга). В этом процессе заряженная струя раствора полимера движется в сильном электрическом поле, при этом сила отталкивания между близко расположенными фрагментами струи растягивает ее. После испарения растворителя струя превращается в полимерное волокно, которое интенсивно петляет и образует нетканую мембрану; обычно она формируется на проводящей пластине (коллекторе). В лабораторных установках для инжекции струи обычно используют иглы с внутренним диаметром порядка ~100 мкм, а диаметр волокна лежит в диапазоне ~100 нм – 1 мкм. Метод электроспиннинга традиционно использовали для производства воздушных фильтров [3], кроме того, в последние годы его используют для изготовления раневых покрытий, субстратов для культивирования клеток и других биомедицинских изделий [4].
Наиболее удобным методом визуализации электроформованных волокон является СЭМ. Его используют для того, чтобы измерять диаметры волокон, определять их взаимное расположение [5] и необычные варианты морфологии, например ленты или "бусины-на-нити" [6]. Кроме того, если в состав волокон или на их поверхность нанесен флуоресцентный краситель, то можно также использовать КЛСМ [7]. Несмотря на то, что субмикронный диаметр волокон затрудняет исследование традиционными оптическими методами, а самые тонкие волокна могут иметь диаметр меньше разрешения оптического микроскопа (например, в [8] описаны волокна с диаметрами ~50 нм), в некоторых случаях метод КЛСМ оказывается чрезвычайно полезен. Например, он может использоваться для измерения пористости электроформованной мембраны [9].
Цель данной работы состояла в том, чтобы реализовать метод корреляционной микроскопии СЭМ-КЛСМ на образце электроформованных волокон и сопоставить данные о диаметрах волокон, полученных каждым из двух использованных видов микроскопии. Эти эксперименты в дальнейшем помогут наиболее полно описать структуру электроформованных мембран, а в более широком контексте – помогут развитию корреляционной микроскопии как перспективного подхода в материаловедении и биологии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Приготовление образцов. В качестве образцов использовали отдельные тонкие электроформованные волокна желатина, осажденные на стекла, покрытые тонким слоем металла. Для их приготовления круглые покровные стекла с диаметром 11 мм обрабатывали плазмой с помощью установки для плазменной очистки Zepto B (Diener electronic, Германия) в течение 10 мин при мощности 200 Вт и давлении 600–800 мБар, затем наносили на них тонкий слой металла (~10 нм, сплав золота и палладия) с помощью установки для магнетронного напыления Sputter Coater Q150T (Quorum Technologies, Великобритания). На металлическом напылении делали царапины, которые служили маркерами для выбора области исследования. Эти стекла с покрытиями использовали в качестве коллектора для электроспиннинга. Раствор желатина готовили в 1,1,1,3,3,3-гексафторизопропаноле с концентрацией 100 мг/мл, причем 10% от нее составлял желатин, конъюгированный с FITC.
Электроспиннинг проводили на установке Nanofiber Electrospinning Unit (Китай) при ускоряющем напряжении 30 кВ и расстоянии от иглы до коллектора 30 см. Время напыления было мало – менее 1 мин.
Исследование методом СЭМ. Образцы исследовали с помощью микроскопа Merlin (Zeiss, Германия) при ускоряющем напряжении 1 кВ и электронном токе 70 пА; рабочее расстояние находилось в диапазоне 3,5–4,5 мм. Использовали детектор вторичных электронов Эверхарта-Торнли. Сравнительно малые значения ускоряющего напряжения и тока позволили проводить измерения без напыления металла, которое обычно наносят на поверхность образцов для исследования методом СЭМ. Исследуемые области выбирали так, чтобы их было легко найти относительно меток (царапин в металлическом слое на стекле).
Исследование методом КЛСМ. Образцы исследовали с помощью микроскопа Eclipse Ti-E с конфокальным модулем А1 (Nikon Corporation, Япония). Съемку проводили через покровное стекло, расположенное поверх волокон. Образец поворачивали так, чтобы царапины в металлическом напылении на получаемых изображениях были приблизительно также ориентированы относительно границ кадра, как при исследовании образца на СЭМ. Изображения получали с помощью объектива Apo TIRF Plan Fluor 63×/1,49 и лазера с длиной волны 488 нм.
Анализ изображений. Пары изображений совмещали с помощью модуля bUnwarpJ [10] программы Fiji [11], а затем анализировали с помощью программы Femtoscan Online [12].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Обычно методом электроспиннинга формируют пленки с толщиной ~100 мкм, однако в данном эксперименте с его помощью получали отдельные волокна на подложке – стекле, покрытом тонким проводящим слоем. Приготовленные таким способом образцы исследовали двумя методами: сначала СЭМ, а затем КЛСМ (рис.1). На поверхности напыления была сделана царапина в виде креста, она представляла собой метку, видимую при использовании обоих методов, относительно которой выбирали расположение исследуемой области.
Такая организация измерительной процедуры отличается от обычной практики исследования волокон методом СЭМ. Обычно металлическое напыление находится на волокнах, а в описываемых экспериментах оно было, наоборот, под ними. Это помогало проводить электроспиннинг со сбором волокон на коллекторе, а потребности в проводящем покрытии волокон для измерений методом СЭМ не возникало, так как съемку проводили при низком ускоряющем напряжении (1 кВ) и электронном токе (70 пА).
На рис.2 представлены изображения поверхности, полученные методами СЭМ и КЛСМ. Когда в эксперименте по корреляционной микроскопии два метода используют последовательно, первый из них должен обеспечить навигацию – возможность найти исследуемую область, используя не только основную метку, но и некоторые хорошо заметные особенности поверхности, например, дефекты или объекты с легко узнаваемой морфологией. Второй метод используют для поиска выбранной области, а в результате эксперимента в целом получают пару изображений, которые можно сопоставлять и анализировать.
На рис.2 представлено несколько изображений, которые помогают понять ход описанного процесса. Изображение крупного креста на рис.2, a было получено при сравнительно малом увеличении 300Х, а затем было выбрано поле зрения для исследования при большем увеличении (рис.2b). Именно в этом поле зрения находился фрагмент, который впоследствии был исследован методом КЛСМ. Измерения, выполняемые КЛСМ, позволили получить z-стек, то есть набор срезов на различной глубине, который показывает трехмерную структуру образца. После получения z-стека его проецировали на плоскость, то есть формировали проекцию максимальной интенсивности (рис.2c).
При исследовании методом КЛСМ образец выглядит как набор зеленых волокон на черном фоне (в качестве флуорофора был использован FITC); палитру можно выбрать произвольно, важно, чтобы волокна были светлее фона. Изображение, полученное методом СЭМ, наоборот, выглядит как сравнительно темные волокна на светлом фоне. Для оптимального сопоставления одно из этих изображений необходимо инвертировать (рис.2, d, инвертировано СЭМ-изображение, далее будет продемонстрирован альтернативный вариант). После этого можно использовать корреляционный анализ для вычисления пары преобразований (прямое g+(x,y) и обратное g-(x,y)), которые совместят изображения так, чтобы их корреляция была максимальна. Преобразования g+ и g- представляют собой два поля деформаций; для каждого пикселя изображения с координатами (x, y) они определяют новые координаты. Эти поля деформаций обеспечивают сдвиг и поворот элементов относительно границ каждого кадра, а также более тонкие деформации, например, сжатия или растяжения отдельных участков. Результаты применения преобразований к изображениям показаны на рис.2e, и f, их находили с помощью модуля bUnwarpJ программы Fiji.
На качественном уровне визуально ясно, что изображения, полученные методами СЭМ и КЛСМ, соответствуют одному и тому же участку поверхности, а применение преобразований, делающих корреляцию максимальной, усиливает это сходство. В то же время, эти изображения не должны быть полностью одинаковыми. Действительно, изображение, полученное методом КЛСМ, показывает расположение флуоресцентного красителя внутри волокон, причем мы работаем с проекцией максимальной интенсивности, а значит, искусственно собираем в одном кадре волокна, которые лежат в разных плоскостях. Изображение, полученное методом СЭМ, сформированное в основном с помощью вторичных электронов, содержит резкие изменения яркости на краях волокон. Контраст на этом изображении зависит от рельефа поверхности (эмиссия вторичных электронов зависит от угла наклона поверхности), а также от материала образца. Сложно ожидать полного соответствия в каждом пикселе двух изображений, полученных этими способами. Тем не менее, корреляционный анализ, выполненный с помощью bUnwarpJ, основанный на анализе интенсивностей, давал хороший результат – позволял совмещать изображения так, чтобы визуально расположение волокон хорошо совпадало.
Обсудим некоторые особенности исследуемого образца и его изображений. Во-первых, многие исследованные волокна представляли собой ленты, а не цилиндры, это заметно на рис.2b. Формирование лент из различных полимеров, в том числе из желатина [13], было описано в большом количестве работ, причина этого явления состоит в потере устойчивости при сжатии волокна силой поверхностного натяжения [14, 15]. При движении заряженной струи от шприца к коллектору испарение растворителя происходит так, что на поверхности струи может сформироваться твердая оболочка, обогащенная полимером, а центральная часть струи при этом останется относительно мягкой. Когда на такую систему типа “жесткое покрытие на податливом основании” действует сжимающая сила (при электроспиннинге это сила поверхностного натяжения), система может терять устойчивость, и при этом формируются ленты или волокна с морщинистой поверхностью. По данным СЭМ, типичная толщина лент составляла 300–400 нм (ее можно измерить, когда лента поворачивается боком и "встает на ребро"), а ширина достигала 8 мкм.
Во-вторых, характерный размер электроформованных волокон (характерная ширина лент) лежал в микронном диапазоне, хотя обычно находится в субмикронном. Диаметр волокон определяется условиями электроспиннинга (концентрацией раствора, скоростью его подачи, ускоряющим напряжением и т.д.), и для данной работы сравнительно крупные волокна были удобны, так как их было проще увидеть с помощью КЛСМ.
В-третьих, расположение некоторых волокон было разным на изображениях, полученных методами КЛСМ и СЭМ. Например, на рис.2e, f зеленым треугольником в правой части кадра показана пара волокон, которые по данным СЭМ расположены на расстоянии 2,9 мкм, а по данным КЛСМ непосредственно касаются друг друга. Такие ситуации несколько раз встречались на изображениях и, скорее всего, отражают подвижность волокон, которая приводила к тому, что при переносе образца между микроскопами их расположение изменилось.
В-четвертых, некоторые ленты, отчетливо видимые методом СЭМ, оказывались невидимыми для КЛСМ. Одна из таких лент показана красной стрелкой на рис.2e, f. Природа этого "исчезновения" может быть связана с влиянием поверхности металлизированного стекла, но детальное объяснение этого явления требует более глубокого анализа.
Процедура корреляционного анализа изображений также нуждается в дополнительных комментариях. На рис.3a, b представлена пара изображений, подготовленных для корреляционного анализа. Красными стрелками отмечено местоположение лент, которые не видны на изображении, полученном методом КЛСМ. В данном случае именно оно было инвертировано, поэтому на нем мы видим темные волокна на светлом фоне. В общем случае результат корреляционного анализа может зависеть от того, как были настроены яркость, контраст и гамма на сопоставляемых изображениях. Но в данной работе для каждой сопоставимой пары мы использовали минимальную коррекцию, или не использовали ее вовсе.
Модуль bUnwarpJ [10], использованный в данной работе, допускает возможность расстановки опорных точек пользователем, и эти опорные точки значительно облегчают поиск оптимальных преобразований изображений. На изображениях, представленных на рис.3, опорные точки показаны оранжевым цветом; их количества и точности их расстановки также влияют на результат сопоставления. Обычно для анализа каждой пары изображений было достаточно 10–15 опорных точек.
Сравним, как соотносятся размеры индивидуальных волокон, измеренные методами СЭМ и КЛСМ. Чтобы ответить на этот вопрос, мы измеряли ширину лент на каждом из изображений. Результаты этих измерений представлены на рис.4; каждая точка графика соответствует определенной точке одного из волокон. Видно, что большинство результатов измерений лежат выше линии Y = X, то есть ширина лент, измеренная КЛСМ (DКЛСМ), оказывается систематически больше, чем методом СЭМ (DСЭМ).
Это может быть следствием нескольких факторов. Во-первых, может сказываться нехватка разрешения КЛСМ (флуоресцентный сигнал проходит через металлизированную подложку, это снижает яркость изображения и ухудшает разрешение). Во-вторых, в данном случае мы работаем с проекциями максимальной интенсивности, а на них ширина объектов в общем случае оказывается не ниже, чем на отдельных срезах. В-третьих, мы не можем исключить некоторое механическое смещение волокон. Оно может приводить к их слипанию (рис.2e, f, зеленый треугольник), а в общем случае – и к более сложной деформации, например повороту ленты. Это может объяснить редкую ситуацию, в которой DКЛСМ<DСЭМ (одна точка ниже линии Y = X на рис.4).
В научной литературе можно найти единичные описания экспериментов по корреляционной микроскопии, объединяющей измерения флуоресценции и СЭМ. Например, такой подход использовали для выявления артефактов, вызванных дегидратацией эукариотических клеток (мезенхимальных стволовых клеток человека) при их подготовке для исследования методом СЭМ [16]. Корреляционная микроскопия, объединяющая флуоресцентную микроскопию и СЭМ, была использована, чтобы помочь выполнению манипуляций с образцом в вакуумной камере СЭМ, механическому извлечению ДНК из ядер клеток [17]. Описанные нами в данной работе эксперименты – редкий пример объединения флуоресцентной микроскопии и СЭМ в исследовании образца не биологического, а синтетического происхождения.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В данной работе описана методика корреляционной микроскопии, которая позволяет получить изображения одной и той же области поверхности образца методами СЭМ и КЛСМ последовательно. Эта методика использована для исследования структуры отдельных электроформованных лент из желатина, нанесенных на металлизированное стекло. Оказалось, что типичный размер лент, измеряемый по проекциям максимальной интенсивности, обычно больше, чем их размер, измеряемый по данным СЭМ.
Чтобы сделать последовательное применение двух методов возможным, измерения методом СЭМ проводили без напыления металла на образец, при низком токе. Флуоресцентную метку, необходимую для измерений методом КЛСМ, вносили в электроформованные волокна при их изготовлении.
Несмотря на то, что изображения, получаемые методами СЭМ и КЛСМ, радикально отличаются друг от друга по расположению видимых элементов и механизму возникновения контраста, для их совмещения можно использовать корреляционный анализ. Это сделано с использованием модуля bUnwarpJ программы Fiji.
В данной работе обнаружен ряд необычных эффектов и возможностей для дальнейшего развития. С точки зрения обработки данных представляется рациональным проводить полноценный анализ z-стека, а не проекции максимальной интенсивности, чтобы максимально полно использовать данные, получаемые методом КЛСМ. Это потребует разработки нетривиальной специализированной процедуры корреляционного анализа, которая сопоставляет не пару изображений, а изображение с z-стеком. Создание такой процедуры позволит извлечь максимум информации из описанных экспериментов.
Многие технические аспекты могут быть изменены, чтобы обеспечить лучшее разрешение КЛСМ. Например, вместо FITC можно использовать другой краситель, который флуоресцирует при меньшей длине волны, а также заключать исследуемые образцы в заливочную среду.
Был обнаружен нетривиальный эффект исчезновения флуоресценции желатиновых лент, расположенных непосредственно на металлическом напылении. обычно эффект тушения флуоресценции вблизи поверхности металла проявляется при расстоянии 1–2 нм от нее [18], однако в нашем случае толщина лент выше и механизм данного эффекта требует дальнейшего изучения.
В целом описанные эксперименты помогают развитию микроскопии высокого разрешения и подчеркивают взаимодополняющую роль разных видов микроскопии, в частности СЭМ и КЛСМ.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда, проект №21-74-10042.
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Novotna V., Horak J., Konecny M., Hegrova V., Novotny O., Novacek Z. et al. AFM-in-SEM as a Tool for Comprehensive Sample Surface Analysis. Micros Today. 2020. Vol. 28. PP. 38–46.
Dorozhkin P., Kuznetsov E., Schokin A., Timofeev S., Bykov V. AFM + Raman Microscopy + SNOM + Tip-Enhanced Raman: Instrumentation and Applications. Micros Today. 2010. Vol. 18. PP. 28–32.
Басманов П.И., Кириченко В.Н., Филатов Ю.Н., Юров Ю.Л. Высокоэффективная очистка газов от аэрозолей фильтрами Петрянова. М.: Наука, 2002.
Syed M.H., Khan M.M.R., Zahari M.A.K.M., Beg M.D.H., Abdullah N. A review on current trends and future prospectives of electrospun biopolymeric nanofibers for biomedical applications. Eur Polym J. 2023. Vol. 197. P. 112352.
Bogdanova A.S., Sokolova A.I., Pavlova E.R., Klinov D.V., Bagrov D.V. Investigation of cellular morphology and proliferation on patterned electrospun PLA-gelatin mats. J Biol Phys. 2021. Vol. 47. PP. 205–14.
Pavlova E., Nikishin I., Bogdanova A., Klinov D., Bagrov D. The miscibility and spatial distribution of the components in electrospun polymer–protein mats. RSC Ad. v. 2020. Vol. 10. PP. 4672–4680.
Choong L.T., Yi P., Rutledge G.C. Three-dimensional imaging of electrospun fiber mats using confocal laser scanning microscopy and digital image analysis. J Mater Sci. 2015. Vol. 50. PP. 3014–3030.
Pavlova E.R., Bagrov D.V., Kopitsyna M.N., Shchelokov D.A., Bonartsev A.P., Zharkova I.I. et al. Poly(hydroxybutyrate- co -hydroxyvalerate) and bovine serum albumin blend prepared by electrospinning. J Appl Polym Sci. 2017. Vol. 134. P. 45090.
Mikhutkin A.A., Kamyshinsky R.A., Tenchurin T.K., Shepelev D., Orekhov A.S., Grigoriev T.E. et al. Towards Tissue Engineering: 3D Study of Polyamide-6 Scaffolds. Bionanoscience 2018. Vol. 8. PP. 511–521.
Arganda-Carreras I., Sorzano C.O.S., Marabini R., Carazo J.M., Ortiz-de-Solorzano C., Kybic J. Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization. Lect. Notes Comput. Sci. (including Subser. Lect. Notes Artif. Intell. Lect. Notes Bioinformatics). Vol. 4241. LNCS. 2006. PP. 85–95.
Schindelin J., Arganda-Carreras I., Frise E., Kaynig V., Longair M., Pietzsch T. et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 2012. Vol. 9. PP. 676–682.
Яминский И.В., Ахметова А.И., Мешков Г.Б. Программное обеспечение "ФемтоСкан Онлайн" и визуализация нанообъектов в микроскопии высокого разрешения. НАНОИНДУСТРИЯ. 2018. Т. 11. С. 414–416.
Topuz F., Uyar T. Electrospinning of gelatin with tunable fiber morphology from round to flat/ribbon. Mater Sci Eng C. 2017. Vol. 80. PP. 371–378.
Koombhongse S., Liu W., Reneker D.H. Flat polymer ribbons and other shapes by electrospinning. J Polym Sci Part B Polym Phys. 2001. Vol. 39. PP. 2598–2606.
Wang L., Pai C., Boyce M.C., Rutledge G.C. Wrinkled surface topographies of electrospun polymer fibers. Appl Phys Lett. 2009. Vol. 94. P. 151916.
Katsen-Globa A., Puetz N., Gepp M.M., Neubauer J.C., Zimmermann H. Study of SEM preparation artefacts with correlative microscopy: Cell shrinkage of adherent cells by HMDS-drying. Scanning. 2016. Vol. 38. PP. 625–633.
Gong Z., Chen B.K., Liu J., Zhou C., Anchel D., Li X. et al. Fluorescence and SEM correlative microscopy for nanomanipulation of subcellular structures. Light Sci Appl. 2014. Vol. 3. PP. 224–e224.
Choi B., Iwanaga M., Miyazaki H.T., Sugimoto Y., Ohtake A., Sakoda K. Overcoming metal-induced fluorescence quenching on plasmo-photonic metasurfaces coated by a self-assembled monolayer. Chem Commun. 2015. Vol. 51. PP. 11470–11473.
Научная статья
КОРРЕЛЯЦИОННАЯ МИКРОСКОПИЯ СЭМ-КЛСМ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭЛЕКТРОФОРМОВАННЫХ ВОЛОКОН ЖЕЛАТИНА
Д.В.Багров1, к.ф.-м.н., вед. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-6355-7282 / bagrov@mail.bio.msu.ru
Е.Р.Павлова2, к.ф.-м.н., науч. сотр., ORCID: 0000-0002-2511-7622
А.С.Богданова2, 3, мл. науч. сотр., ORCID: 0000-0001-5369-8519
А.М.Мойсенович1, к.б.н., вед. науч. сотр., ORCID: 0000-0001-5379-5829
Т.В.Митько2, 3, к.б.н., мл. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-0107-1906
А.А.Рамонова1, мл. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-3081-4721
Д.В.Клинов2, 3, к.ф.-м.н., зав. лаб., ORCID: 0000-0001-8288-2198
Аннотация. Наиболее полную информацию о микроструктуре образца можно получить, комбинируя разные виды микроскопии высокого разрешения. Такая комбинация оказывается особенно информативной, если измерения проводятся не просто на одном и том же образце, но и на одной и той же области образца – этот подход называется корреляционной микроскопией. Обычно такие измерения требуют специальной подготовки образца и его перемещения между двумя микроскопами. В данной работе описано использование корреляционной микроскопии, объединяющей сканирующую электронную (СЭМ) и лазерную сканирующую конфокальную (КЛСМ). С помощью этих двух методов исследованы электроформованные волокна желатина, нанесенные на металлизированное стекло. Показана возможность использования корреляционного анализа для совмещения изображений, полученных СЭМ и КЛСМ.
Ключевые слова: корреляционная микроскопия, желатин, металлизированное стекло, СЭМ, КЛСМ
Для цитирования: Д.В. Багров, Е.Р. Павлова, А.С. Богданова, А.М. Мойсенович, Т.В. Митько, А.А. Рамонова, Д.В. Клинов. Корреляционная микроскопия СЭМ-КЛСМ и ее применение для исследования электроформованных волокон желатина. НАНОИНДУСТРИЯ. 2024. Т. 17. № 3–4. С. 208–218. https://doi.org/
10.22184/1993-8578.2024.17.3-4.208.218
Received: 25.03.2024 | Accepted: 30.03.2024 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.3-4.208.218
Original paper
SEM-CLSM CORRELATION MICROSCOPY AND ITS APPLICATION TO ELECTROSPUN GELATIN FIBERS
D.V.Bagrov1, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Leading Researcher, ORCID: 0000-0002-6355-7282 / bagrov@mail.bio.msu.ru
E.R.Pavlova2, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Researcher, ORCID: 0000-0002-2511-7622
A.S.Bogdanova2, 3, Junior Researcher, ORCID: 0000-0001-5369-8519
A.M.Moysenovich1, Cand. of Sci. (Biological), Leading Researcher, ORCID: 0000-0001-5379-5829
T.V.Mitko2, 3, Cand. of Sci. (Biological), Junior Researcher, ORCID: 0000-0002-0107-1906
A.A.Ramonova1, Junior Researcher, ORCID: 0000-0002-3081-4721
D.V.Klinov2, 3, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Head of Laboratory, ORCID: 0000-0001-8288-2198
Abstract. The most comprehensive information about microstructure of the sample can be obtained by combining different types of high-resolution microscopy. This combination turns out to be especially informative when measurements are carried out not only on the same image, but on the same area of the sample. This approach is called correlation microscopy. Typically, such experiments require careful preparation of the sample and transferring it between the two microscopes. The current work uses correlation microscopy which combines scanning electron microscopy (SEM) and confocal laser scanning microscopy (CLSM). Electrospun gelatin fibers deposited onto metallized glass are studied using these two methods. The possibility of using correlation analysis to combine images obtained by SEM and CLSM is demonstrated.
Keywords: correlation microscopy, gelatin, metallized glass, SEM, CLSM
For citation: D.V. Bagrov, E.R. Pavlova, A.S. Bogdanova, A.M. Moysenovich, T.V. Mitko, A.A. Ramonova, D.V. Klinov. SEM-CLSM correlation microscopy and its application to electrospun gelatin fibers. NANOINDUSTRY. 2024. Vol. 17. No. 3–4. PP. 208–218. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2024.17.3-4.208.218.
ВВЕДЕНИЕ
В начале 21 века на фоне стремительного развития нанотехнологий получили распространение методы микроскопии высокого разрешения: атомно-силовой (АСМ), просвечивающей и сканирующей электронной (ПЭМ и СЭМ), высокоразрешающей оптической и др. Эти методы позволяют не только определить структуру образца с высоким пространственным разрешением, но и измерить некоторые локальные свойства. Например, с помощью АСМ измеряют локальные механические свойства образцов (прежде всего, модуль Юнга и адгезию), а методика рентгеновской микроспектроскопии позволяет определять элементный состав в СЭМ и ПЭМ.
Наиболее полную информацию об исследуемом образце можно получить при использовании нескольких методов. В частности, существует подход под названием “корреляционная микроскопия”, который предполагает получение изображений одной и той же области образца с помощью последовательного использования нескольких разных видов микроскопии. Обычно такие эксперименты предполагают физическое перемещение образца между микроскопами или же использование специализированных комбинированных приборов, которые объединяют в себе несколько видов микроскопии, например, совмещают АСМ и СЭМ [1] или КР-микроспектроскопию и АСМ [2].
В данной работе методы СЭМ и лазерная сканирующая конфокальная микроскопия (КЛСМ) были объединены для изучения локальных свойств электроформованных волокон из желатина. Результатами экспериментов по корреляционной микроскопии были пары изображений, полученных двумя использованными методами. Объектом исследования были желатиновые волокна, изготовленные с помощью электроформования (электроспиннинга). В этом процессе заряженная струя раствора полимера движется в сильном электрическом поле, при этом сила отталкивания между близко расположенными фрагментами струи растягивает ее. После испарения растворителя струя превращается в полимерное волокно, которое интенсивно петляет и образует нетканую мембрану; обычно она формируется на проводящей пластине (коллекторе). В лабораторных установках для инжекции струи обычно используют иглы с внутренним диаметром порядка ~100 мкм, а диаметр волокна лежит в диапазоне ~100 нм – 1 мкм. Метод электроспиннинга традиционно использовали для производства воздушных фильтров [3], кроме того, в последние годы его используют для изготовления раневых покрытий, субстратов для культивирования клеток и других биомедицинских изделий [4].
Наиболее удобным методом визуализации электроформованных волокон является СЭМ. Его используют для того, чтобы измерять диаметры волокон, определять их взаимное расположение [5] и необычные варианты морфологии, например ленты или "бусины-на-нити" [6]. Кроме того, если в состав волокон или на их поверхность нанесен флуоресцентный краситель, то можно также использовать КЛСМ [7]. Несмотря на то, что субмикронный диаметр волокон затрудняет исследование традиционными оптическими методами, а самые тонкие волокна могут иметь диаметр меньше разрешения оптического микроскопа (например, в [8] описаны волокна с диаметрами ~50 нм), в некоторых случаях метод КЛСМ оказывается чрезвычайно полезен. Например, он может использоваться для измерения пористости электроформованной мембраны [9].
Цель данной работы состояла в том, чтобы реализовать метод корреляционной микроскопии СЭМ-КЛСМ на образце электроформованных волокон и сопоставить данные о диаметрах волокон, полученных каждым из двух использованных видов микроскопии. Эти эксперименты в дальнейшем помогут наиболее полно описать структуру электроформованных мембран, а в более широком контексте – помогут развитию корреляционной микроскопии как перспективного подхода в материаловедении и биологии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Приготовление образцов. В качестве образцов использовали отдельные тонкие электроформованные волокна желатина, осажденные на стекла, покрытые тонким слоем металла. Для их приготовления круглые покровные стекла с диаметром 11 мм обрабатывали плазмой с помощью установки для плазменной очистки Zepto B (Diener electronic, Германия) в течение 10 мин при мощности 200 Вт и давлении 600–800 мБар, затем наносили на них тонкий слой металла (~10 нм, сплав золота и палладия) с помощью установки для магнетронного напыления Sputter Coater Q150T (Quorum Technologies, Великобритания). На металлическом напылении делали царапины, которые служили маркерами для выбора области исследования. Эти стекла с покрытиями использовали в качестве коллектора для электроспиннинга. Раствор желатина готовили в 1,1,1,3,3,3-гексафторизопропаноле с концентрацией 100 мг/мл, причем 10% от нее составлял желатин, конъюгированный с FITC.
Электроспиннинг проводили на установке Nanofiber Electrospinning Unit (Китай) при ускоряющем напряжении 30 кВ и расстоянии от иглы до коллектора 30 см. Время напыления было мало – менее 1 мин.
Исследование методом СЭМ. Образцы исследовали с помощью микроскопа Merlin (Zeiss, Германия) при ускоряющем напряжении 1 кВ и электронном токе 70 пА; рабочее расстояние находилось в диапазоне 3,5–4,5 мм. Использовали детектор вторичных электронов Эверхарта-Торнли. Сравнительно малые значения ускоряющего напряжения и тока позволили проводить измерения без напыления металла, которое обычно наносят на поверхность образцов для исследования методом СЭМ. Исследуемые области выбирали так, чтобы их было легко найти относительно меток (царапин в металлическом слое на стекле).
Исследование методом КЛСМ. Образцы исследовали с помощью микроскопа Eclipse Ti-E с конфокальным модулем А1 (Nikon Corporation, Япония). Съемку проводили через покровное стекло, расположенное поверх волокон. Образец поворачивали так, чтобы царапины в металлическом напылении на получаемых изображениях были приблизительно также ориентированы относительно границ кадра, как при исследовании образца на СЭМ. Изображения получали с помощью объектива Apo TIRF Plan Fluor 63×/1,49 и лазера с длиной волны 488 нм.
Анализ изображений. Пары изображений совмещали с помощью модуля bUnwarpJ [10] программы Fiji [11], а затем анализировали с помощью программы Femtoscan Online [12].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Обычно методом электроспиннинга формируют пленки с толщиной ~100 мкм, однако в данном эксперименте с его помощью получали отдельные волокна на подложке – стекле, покрытом тонким проводящим слоем. Приготовленные таким способом образцы исследовали двумя методами: сначала СЭМ, а затем КЛСМ (рис.1). На поверхности напыления была сделана царапина в виде креста, она представляла собой метку, видимую при использовании обоих методов, относительно которой выбирали расположение исследуемой области.
Такая организация измерительной процедуры отличается от обычной практики исследования волокон методом СЭМ. Обычно металлическое напыление находится на волокнах, а в описываемых экспериментах оно было, наоборот, под ними. Это помогало проводить электроспиннинг со сбором волокон на коллекторе, а потребности в проводящем покрытии волокон для измерений методом СЭМ не возникало, так как съемку проводили при низком ускоряющем напряжении (1 кВ) и электронном токе (70 пА).
На рис.2 представлены изображения поверхности, полученные методами СЭМ и КЛСМ. Когда в эксперименте по корреляционной микроскопии два метода используют последовательно, первый из них должен обеспечить навигацию – возможность найти исследуемую область, используя не только основную метку, но и некоторые хорошо заметные особенности поверхности, например, дефекты или объекты с легко узнаваемой морфологией. Второй метод используют для поиска выбранной области, а в результате эксперимента в целом получают пару изображений, которые можно сопоставлять и анализировать.
На рис.2 представлено несколько изображений, которые помогают понять ход описанного процесса. Изображение крупного креста на рис.2, a было получено при сравнительно малом увеличении 300Х, а затем было выбрано поле зрения для исследования при большем увеличении (рис.2b). Именно в этом поле зрения находился фрагмент, который впоследствии был исследован методом КЛСМ. Измерения, выполняемые КЛСМ, позволили получить z-стек, то есть набор срезов на различной глубине, который показывает трехмерную структуру образца. После получения z-стека его проецировали на плоскость, то есть формировали проекцию максимальной интенсивности (рис.2c).
При исследовании методом КЛСМ образец выглядит как набор зеленых волокон на черном фоне (в качестве флуорофора был использован FITC); палитру можно выбрать произвольно, важно, чтобы волокна были светлее фона. Изображение, полученное методом СЭМ, наоборот, выглядит как сравнительно темные волокна на светлом фоне. Для оптимального сопоставления одно из этих изображений необходимо инвертировать (рис.2, d, инвертировано СЭМ-изображение, далее будет продемонстрирован альтернативный вариант). После этого можно использовать корреляционный анализ для вычисления пары преобразований (прямое g+(x,y) и обратное g-(x,y)), которые совместят изображения так, чтобы их корреляция была максимальна. Преобразования g+ и g- представляют собой два поля деформаций; для каждого пикселя изображения с координатами (x, y) они определяют новые координаты. Эти поля деформаций обеспечивают сдвиг и поворот элементов относительно границ каждого кадра, а также более тонкие деформации, например, сжатия или растяжения отдельных участков. Результаты применения преобразований к изображениям показаны на рис.2e, и f, их находили с помощью модуля bUnwarpJ программы Fiji.
На качественном уровне визуально ясно, что изображения, полученные методами СЭМ и КЛСМ, соответствуют одному и тому же участку поверхности, а применение преобразований, делающих корреляцию максимальной, усиливает это сходство. В то же время, эти изображения не должны быть полностью одинаковыми. Действительно, изображение, полученное методом КЛСМ, показывает расположение флуоресцентного красителя внутри волокон, причем мы работаем с проекцией максимальной интенсивности, а значит, искусственно собираем в одном кадре волокна, которые лежат в разных плоскостях. Изображение, полученное методом СЭМ, сформированное в основном с помощью вторичных электронов, содержит резкие изменения яркости на краях волокон. Контраст на этом изображении зависит от рельефа поверхности (эмиссия вторичных электронов зависит от угла наклона поверхности), а также от материала образца. Сложно ожидать полного соответствия в каждом пикселе двух изображений, полученных этими способами. Тем не менее, корреляционный анализ, выполненный с помощью bUnwarpJ, основанный на анализе интенсивностей, давал хороший результат – позволял совмещать изображения так, чтобы визуально расположение волокон хорошо совпадало.
Обсудим некоторые особенности исследуемого образца и его изображений. Во-первых, многие исследованные волокна представляли собой ленты, а не цилиндры, это заметно на рис.2b. Формирование лент из различных полимеров, в том числе из желатина [13], было описано в большом количестве работ, причина этого явления состоит в потере устойчивости при сжатии волокна силой поверхностного натяжения [14, 15]. При движении заряженной струи от шприца к коллектору испарение растворителя происходит так, что на поверхности струи может сформироваться твердая оболочка, обогащенная полимером, а центральная часть струи при этом останется относительно мягкой. Когда на такую систему типа “жесткое покрытие на податливом основании” действует сжимающая сила (при электроспиннинге это сила поверхностного натяжения), система может терять устойчивость, и при этом формируются ленты или волокна с морщинистой поверхностью. По данным СЭМ, типичная толщина лент составляла 300–400 нм (ее можно измерить, когда лента поворачивается боком и "встает на ребро"), а ширина достигала 8 мкм.
Во-вторых, характерный размер электроформованных волокон (характерная ширина лент) лежал в микронном диапазоне, хотя обычно находится в субмикронном. Диаметр волокон определяется условиями электроспиннинга (концентрацией раствора, скоростью его подачи, ускоряющим напряжением и т.д.), и для данной работы сравнительно крупные волокна были удобны, так как их было проще увидеть с помощью КЛСМ.
В-третьих, расположение некоторых волокон было разным на изображениях, полученных методами КЛСМ и СЭМ. Например, на рис.2e, f зеленым треугольником в правой части кадра показана пара волокон, которые по данным СЭМ расположены на расстоянии 2,9 мкм, а по данным КЛСМ непосредственно касаются друг друга. Такие ситуации несколько раз встречались на изображениях и, скорее всего, отражают подвижность волокон, которая приводила к тому, что при переносе образца между микроскопами их расположение изменилось.
В-четвертых, некоторые ленты, отчетливо видимые методом СЭМ, оказывались невидимыми для КЛСМ. Одна из таких лент показана красной стрелкой на рис.2e, f. Природа этого "исчезновения" может быть связана с влиянием поверхности металлизированного стекла, но детальное объяснение этого явления требует более глубокого анализа.
Процедура корреляционного анализа изображений также нуждается в дополнительных комментариях. На рис.3a, b представлена пара изображений, подготовленных для корреляционного анализа. Красными стрелками отмечено местоположение лент, которые не видны на изображении, полученном методом КЛСМ. В данном случае именно оно было инвертировано, поэтому на нем мы видим темные волокна на светлом фоне. В общем случае результат корреляционного анализа может зависеть от того, как были настроены яркость, контраст и гамма на сопоставляемых изображениях. Но в данной работе для каждой сопоставимой пары мы использовали минимальную коррекцию, или не использовали ее вовсе.
Модуль bUnwarpJ [10], использованный в данной работе, допускает возможность расстановки опорных точек пользователем, и эти опорные точки значительно облегчают поиск оптимальных преобразований изображений. На изображениях, представленных на рис.3, опорные точки показаны оранжевым цветом; их количества и точности их расстановки также влияют на результат сопоставления. Обычно для анализа каждой пары изображений было достаточно 10–15 опорных точек.
Сравним, как соотносятся размеры индивидуальных волокон, измеренные методами СЭМ и КЛСМ. Чтобы ответить на этот вопрос, мы измеряли ширину лент на каждом из изображений. Результаты этих измерений представлены на рис.4; каждая точка графика соответствует определенной точке одного из волокон. Видно, что большинство результатов измерений лежат выше линии Y = X, то есть ширина лент, измеренная КЛСМ (DКЛСМ), оказывается систематически больше, чем методом СЭМ (DСЭМ).
Это может быть следствием нескольких факторов. Во-первых, может сказываться нехватка разрешения КЛСМ (флуоресцентный сигнал проходит через металлизированную подложку, это снижает яркость изображения и ухудшает разрешение). Во-вторых, в данном случае мы работаем с проекциями максимальной интенсивности, а на них ширина объектов в общем случае оказывается не ниже, чем на отдельных срезах. В-третьих, мы не можем исключить некоторое механическое смещение волокон. Оно может приводить к их слипанию (рис.2e, f, зеленый треугольник), а в общем случае – и к более сложной деформации, например повороту ленты. Это может объяснить редкую ситуацию, в которой DКЛСМ<DСЭМ (одна точка ниже линии Y = X на рис.4).
В научной литературе можно найти единичные описания экспериментов по корреляционной микроскопии, объединяющей измерения флуоресценции и СЭМ. Например, такой подход использовали для выявления артефактов, вызванных дегидратацией эукариотических клеток (мезенхимальных стволовых клеток человека) при их подготовке для исследования методом СЭМ [16]. Корреляционная микроскопия, объединяющая флуоресцентную микроскопию и СЭМ, была использована, чтобы помочь выполнению манипуляций с образцом в вакуумной камере СЭМ, механическому извлечению ДНК из ядер клеток [17]. Описанные нами в данной работе эксперименты – редкий пример объединения флуоресцентной микроскопии и СЭМ в исследовании образца не биологического, а синтетического происхождения.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В данной работе описана методика корреляционной микроскопии, которая позволяет получить изображения одной и той же области поверхности образца методами СЭМ и КЛСМ последовательно. Эта методика использована для исследования структуры отдельных электроформованных лент из желатина, нанесенных на металлизированное стекло. Оказалось, что типичный размер лент, измеряемый по проекциям максимальной интенсивности, обычно больше, чем их размер, измеряемый по данным СЭМ.
Чтобы сделать последовательное применение двух методов возможным, измерения методом СЭМ проводили без напыления металла на образец, при низком токе. Флуоресцентную метку, необходимую для измерений методом КЛСМ, вносили в электроформованные волокна при их изготовлении.
Несмотря на то, что изображения, получаемые методами СЭМ и КЛСМ, радикально отличаются друг от друга по расположению видимых элементов и механизму возникновения контраста, для их совмещения можно использовать корреляционный анализ. Это сделано с использованием модуля bUnwarpJ программы Fiji.
В данной работе обнаружен ряд необычных эффектов и возможностей для дальнейшего развития. С точки зрения обработки данных представляется рациональным проводить полноценный анализ z-стека, а не проекции максимальной интенсивности, чтобы максимально полно использовать данные, получаемые методом КЛСМ. Это потребует разработки нетривиальной специализированной процедуры корреляционного анализа, которая сопоставляет не пару изображений, а изображение с z-стеком. Создание такой процедуры позволит извлечь максимум информации из описанных экспериментов.
Многие технические аспекты могут быть изменены, чтобы обеспечить лучшее разрешение КЛСМ. Например, вместо FITC можно использовать другой краситель, который флуоресцирует при меньшей длине волны, а также заключать исследуемые образцы в заливочную среду.
Был обнаружен нетривиальный эффект исчезновения флуоресценции желатиновых лент, расположенных непосредственно на металлическом напылении. обычно эффект тушения флуоресценции вблизи поверхности металла проявляется при расстоянии 1–2 нм от нее [18], однако в нашем случае толщина лент выше и механизм данного эффекта требует дальнейшего изучения.
В целом описанные эксперименты помогают развитию микроскопии высокого разрешения и подчеркивают взаимодополняющую роль разных видов микроскопии, в частности СЭМ и КЛСМ.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда, проект №21-74-10042.
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Novotna V., Horak J., Konecny M., Hegrova V., Novotny O., Novacek Z. et al. AFM-in-SEM as a Tool for Comprehensive Sample Surface Analysis. Micros Today. 2020. Vol. 28. PP. 38–46.
Dorozhkin P., Kuznetsov E., Schokin A., Timofeev S., Bykov V. AFM + Raman Microscopy + SNOM + Tip-Enhanced Raman: Instrumentation and Applications. Micros Today. 2010. Vol. 18. PP. 28–32.
Басманов П.И., Кириченко В.Н., Филатов Ю.Н., Юров Ю.Л. Высокоэффективная очистка газов от аэрозолей фильтрами Петрянова. М.: Наука, 2002.
Syed M.H., Khan M.M.R., Zahari M.A.K.M., Beg M.D.H., Abdullah N. A review on current trends and future prospectives of electrospun biopolymeric nanofibers for biomedical applications. Eur Polym J. 2023. Vol. 197. P. 112352.
Bogdanova A.S., Sokolova A.I., Pavlova E.R., Klinov D.V., Bagrov D.V. Investigation of cellular morphology and proliferation on patterned electrospun PLA-gelatin mats. J Biol Phys. 2021. Vol. 47. PP. 205–14.
Pavlova E., Nikishin I., Bogdanova A., Klinov D., Bagrov D. The miscibility and spatial distribution of the components in electrospun polymer–protein mats. RSC Ad. v. 2020. Vol. 10. PP. 4672–4680.
Choong L.T., Yi P., Rutledge G.C. Three-dimensional imaging of electrospun fiber mats using confocal laser scanning microscopy and digital image analysis. J Mater Sci. 2015. Vol. 50. PP. 3014–3030.
Pavlova E.R., Bagrov D.V., Kopitsyna M.N., Shchelokov D.A., Bonartsev A.P., Zharkova I.I. et al. Poly(hydroxybutyrate- co -hydroxyvalerate) and bovine serum albumin blend prepared by electrospinning. J Appl Polym Sci. 2017. Vol. 134. P. 45090.
Mikhutkin A.A., Kamyshinsky R.A., Tenchurin T.K., Shepelev D., Orekhov A.S., Grigoriev T.E. et al. Towards Tissue Engineering: 3D Study of Polyamide-6 Scaffolds. Bionanoscience 2018. Vol. 8. PP. 511–521.
Arganda-Carreras I., Sorzano C.O.S., Marabini R., Carazo J.M., Ortiz-de-Solorzano C., Kybic J. Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization. Lect. Notes Comput. Sci. (including Subser. Lect. Notes Artif. Intell. Lect. Notes Bioinformatics). Vol. 4241. LNCS. 2006. PP. 85–95.
Schindelin J., Arganda-Carreras I., Frise E., Kaynig V., Longair M., Pietzsch T. et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 2012. Vol. 9. PP. 676–682.
Яминский И.В., Ахметова А.И., Мешков Г.Б. Программное обеспечение "ФемтоСкан Онлайн" и визуализация нанообъектов в микроскопии высокого разрешения. НАНОИНДУСТРИЯ. 2018. Т. 11. С. 414–416.
Topuz F., Uyar T. Electrospinning of gelatin with tunable fiber morphology from round to flat/ribbon. Mater Sci Eng C. 2017. Vol. 80. PP. 371–378.
Koombhongse S., Liu W., Reneker D.H. Flat polymer ribbons and other shapes by electrospinning. J Polym Sci Part B Polym Phys. 2001. Vol. 39. PP. 2598–2606.
Wang L., Pai C., Boyce M.C., Rutledge G.C. Wrinkled surface topographies of electrospun polymer fibers. Appl Phys Lett. 2009. Vol. 94. P. 151916.
Katsen-Globa A., Puetz N., Gepp M.M., Neubauer J.C., Zimmermann H. Study of SEM preparation artefacts with correlative microscopy: Cell shrinkage of adherent cells by HMDS-drying. Scanning. 2016. Vol. 38. PP. 625–633.
Gong Z., Chen B.K., Liu J., Zhou C., Anchel D., Li X. et al. Fluorescence and SEM correlative microscopy for nanomanipulation of subcellular structures. Light Sci Appl. 2014. Vol. 3. PP. 224–e224.
Choi B., Iwanaga M., Miyazaki H.T., Sugimoto Y., Ohtake A., Sakoda K. Overcoming metal-induced fluorescence quenching on plasmo-photonic metasurfaces coated by a self-assembled monolayer. Chem Commun. 2015. Vol. 51. PP. 11470–11473.
Отзывы читателей
