eng
Выпуск #3-4/2025
О.В.Иванов, А.И.Ахметова, И.В.Яминский
РАЗРАБОТКА БИОСОВМЕСТИМОЙ МУЛЬТИЭЛЕКТРОДНОЙ ЯЧЕЙКИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЖИВЫХ СЕТЕЙ НЕЙРОНОВ МЕТОДОМ СКАНИРУЮЩЕЙ КАПИЛЛЯРНОЙ МИКРОСКОПИИ
РАЗРАБОТКА БИОСОВМЕСТИМОЙ МУЛЬТИЭЛЕКТРОДНОЙ ЯЧЕЙКИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЖИВЫХ СЕТЕЙ НЕЙРОНОВ МЕТОДОМ СКАНИРУЮЩЕЙ КАПИЛЛЯРНОЙ МИКРОСКОПИИ
Просмотры: 1123
DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.3-4.166.172
Разработана и охарактеризована инновационная биосовместимая мультиэлектродная ячейка, интегрирующая технологии регистрации электрической активности нейронов с возможностями высокоразрешающей сканирующей капиллярной микроскопии. Предложенная конструкция включает подложку из ITO-покрытого стекла с лазерно-паттернированными электродами, изолированными слоем парилена и функционализированными медно-золотыми микроэлектродами с мемристорными свойствами. Прототип демонстрирует преимущества одновременной регистрации электрической активности и морфологических изменений нейронов, открывая новые возможности для исследования нейрональной пластичности, структурного распределения нервной ткани и скрининга нейроактивных соединений.
Разработана и охарактеризована инновационная биосовместимая мультиэлектродная ячейка, интегрирующая технологии регистрации электрической активности нейронов с возможностями высокоразрешающей сканирующей капиллярной микроскопии. Предложенная конструкция включает подложку из ITO-покрытого стекла с лазерно-паттернированными электродами, изолированными слоем парилена и функционализированными медно-золотыми микроэлектродами с мемристорными свойствами. Прототип демонстрирует преимущества одновременной регистрации электрической активности и морфологических изменений нейронов, открывая новые возможности для исследования нейрональной пластичности, структурного распределения нервной ткани и скрининга нейроактивных соединений.
Теги: biocompatible multielectrode cell electrophysiology neurons scanning capillary microscopy биосовместимая мультиэлектродная ячейка нейроны сканирующая капиллярная микроскопия электрофизиология
Получено: 21.04.2025 г. | Принято: 25.04.2025 г. | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.3-4.166.172
Научная статья
РАЗРАБОТКА БИОСОВМЕСТИМОЙ МУЛЬТИЭЛЕКТРОДНОЙ ЯЧЕЙКИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЖИВЫХ СЕТЕЙ НЕЙРОНОВ МЕТОДОМ СКАНИРУЮЩЕЙ КАПИЛЛЯРНОЙ МИКРОСКОПИИ
О.В.Иванов1, 2, магистр, ORCID: 0000-0003-2765-2116
А.И.Ахметова1, 2, к.ф.-м.н., ст. науч. сотр., вед. спец., ORCID: 0000-0002-5115-8030
И.В.Яминский1, 2, д.ф.-м.н., проф., ген. дир., ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Аннотация. Разработана и охарактеризована инновационная биосовместимая мультиэлектродная ячейка, интегрирующая технологии регистрации электрической активности нейронов с возможностями высокоразрешающей сканирующей капиллярной микроскопии. Предложенная конструкция включает подложку из ITO-покрытого стекла с лазерно-паттернированными электродами, изолированными слоем парилена и функционализированными медно-золотыми микроэлектродами с мемристорными свойствами. Прототип демонстрирует преимущества одновременной регистрации электрической активности и морфологических изменений нейронов, открывая новые возможности для исследования нейрональной пластичности, структурного распределения нервной ткани и скрининга нейроактивных соединений.
Ключевые слова: биосовместимая мультиэлектродная ячейка, сканирующая капиллярная микроскопия, нейроны, электрофизиология
Для цитирования: О.В. Иванов, А.И. Ахметова, И.В. Яминский. Разработка биосовместимой мультиэлектродной ячейки для исследования живых сетей нейронов методом сканирующей капиллярной микроскопии. НАНОИНДУСТРИЯ. 2025. Т. 18. № 3–4. С. 166–172. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.3-4.166.172.
Received: 21.04.2025 | Accepted: 25.04.2025 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.3-4.166.172
Original paper
DEVELOPMENT OF A BIOCOMPATIBLE MULTI-ELECTRODE CELL FOR STUDYING LIVING NEURONAL NETWORKS USING COMBINED SCANNING CAPILLARY MICROSCOPY
O.V.Ivanov1 ,2, Master, ORCID: 0000-0003-2765-2116
A.I.Akhmetova1, 2, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Senior Researcher, Leading Specialist, ORCID: 0000-0002-5115-8030
I.V.Yaminsky1, 2, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Prof., Director, ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Abstract. An innovative biocompatible multielectrode cell integrating neuronal electrical activity recording technologies with high-resolution scanning capillary microscopy capabilities has been developed and characterized. The proposed design includes an ITO-coated glass substrate with laser-patterned electrodes insulated with a 180 nm thick parylene layer and functionalized copper-gold microelectrodes with memristor properties. The prototype demonstrates the advantages of simultaneous recording of neuronal electrical activity and morphological changes, opening up new possibilities for studying neuronal plasticity, structural distribution of nervous tissue, and screening of neuroactive compounds.
Keywords: biocompatible multielectrode cell, scanning capillary microscopy, neurons, electrophysiology
For citation: O.V. Ivanov, A.I. Akhmetova, I.V. Yaminsky. Development of a biocompatible multi-electrode cell for studying living neuronal networks using combined scanning capillary microscopy. NANOINDUSTRY. 2025. Vol. 18. No. 3–4. PP. 166–172. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.3-4.166.172.
ВВЕДЕНИЕ
Ячейки для 3D-визуализации и электрофизиологии. Обзор
Современные нейробиологические исследования требуют интеграции электрофизиологических и микроскопических методов для комплексного анализа структурно-функциональных свойств нейронных сетей. Существующие решения в этой области имеют различные преимущества и ограничения.
Коммерческие мультиэлектродные системы (Multielectrode Arraуs, или MEA-системы) с прозрачными подложками, такие как MEA2100-System от Multichannel Systems, позволяют совместить электрофизиологическую регистрацию с инвертированной оптической микроскопией [1]. Однако эти системы с трудом совместимы с методами микроскопии высокого разрешения из-за большой толщины подложки и сложной системы регистрации электрического сигнала, а также ввиду наличия значительного рабочего расстояния.
Экспериментальные разработки включают системы с интегрированными оптоволоконными датчиками, позволяющими проводить оптическую стимуляцию и регистрацию непосредственно в области расположения MEA-электродов. Такие системы обеспечивают пространственно-совмещенную электрическую и оптическую регистрацию, однако имеют ограниченное пространственное разрешение и требуют сложных технологических процессов для изготовления.
Для преодоления оптических ограничений предложены MEA на основе прозрачных проводящих материалов. Так, Park и соавторы разработали MEA с графеновыми электродами, обеспечивающими оптическую прозрачность >90% в видимом диапазоне [2]. Однако использованные графеновые электроды имеют относительно высокий импеданс (>1 МОм на частоте 1 кГц), что ограничивает их применение для регистрации низкоамплитудных сигналов.
Перспективным направлением является интеграция MEA с методами сканирующей зондовой микроскопии. Системы, сочетающие MEA-регистрацию с атомно-силовой микроскопией, позволяют исследовать корреляцию между морфологическими и электрическими изменениями нейронов. Однако эти системы имеют ограничения, связанные с геометрией и электроизоляцией АСМ-зондов. Есть и некоторая сложность совмещения измерительной системы (как правило оптической) АСМ с жидкой средой культивирования. В этом контексте разработанная биосовместимая ячейка предлагает принципиально новый подход, сочетающий преимущества капиллярной микроскопии и высокоплотных MEA.
Разработка ячейки для 3D-визуализации биообъектов с одновременным проведением электрофизиологических измерений
Подложка и электродная система
Разработанная биосовместимая мультиэлектродная ячейка основана на стеклянной подложке размером 50 × 50 × 1 мм3 с нанесенным покрытием из оксида индия-олова (ITO, Indium Tin Oxide). Выбор ITO обусловлен его оптической прозрачностью (>85% в видимом диапазоне) в сочетании с хорошей электрической проводимостью (поверхностное сопротивление <10 Ом/квадрат), что обеспечивает совместимость с методами оптической микроскопии [3–5].
Формирование структуры электродной системы осуществляется методом лазерного отжига с использованием установки SharpLase SHARPMARK 20-F с Nd:YAG лазером (λ=1064 нм, мощность 20 Вт) в импульсном режиме с опцией High contrast. Данный метод обеспечивает пространственное разрешение позиционирования ~10 мкм, что достаточно для создания прецизионных микроэлектродных структур. Преимуществом лазерного отжига макроэлектродов перед традиционной фотолитографией является значительная эффективность методики и высокая скорость изготовления подложек без использования химических реагентов.
Электродная система включает четыре макроэлектрода (5 × 10 мм) по периферии подложки для интерфейса с регистрирующим оборудованием, токоведущие дорожки с зазором 1 мм между ними и максимальной площадью покрытия для увеличения суммарной емкости ячейки, уменьшения сопротивления каждого из электродов, а также четыре микроэлектрода (300 мкм) в центральной части верхнего слоя ячейки.
Конфигурация электродов оптимизирована для обеспечения максимального пространственного разрешения при минимизации электромагнитных помех между каналами регистрации.
Изоляция и функционализация электродов
Для электрической изоляции токоведущих дорожек и определения активных зон микроэлектродов используется слой парилена-C толщиной 180 нм (рис.1). Париленовый слой был нанесен методом поверхностной полимеризации в газовой фазе с использованием вакуумной системы напыления SCS Labcoater PDS 2010. PDS 2010 преобразует димер парилена (2,2-парациклофан или его производные) в газообразный мономер. Материал полимеризируется на подложке при его нанесении при комнатной температуре. При используемых уровнях вакуума проводящий слой подложки равномерно обрабатывался газообразным мономером с последующим осаждением, в результате чего получалось прочное защитное покрытие.
Функциональные микроэлектроды формируются методом магнетронного напыления последовательно меди и золота на поверхность парилена через маску с отверстиями 300 × 300 мкм. Первый слой напыления производится медью толщиной около 300 нм для последующего формирования филамента в париленовом слое. Перечисленные выше металлы были выбраны из-за их широкого применения в электронной технике, в том числе при изготовлении мемристивных устройств [6]. Золото выбрано как электродный материал благодаря ее высокой биосовместимости, коррозионной стойкости в физиологических растворах и низкому импедансу на границе "электрод – электролит". Медь выбрана в качестве электрохимически активного металла для формирования филаментов сквозь слой париленового изолятора по аналогии с технологией формирования филаментов при изготовлении нейроморфных систем [7].
Инновационным аспектом разработанной ячейки является применение технологии формирования проводящих филаментов для создания электрического контакта между платиновыми микроэлектродами и нижележащими ITO-электродами через слой парилена. Данный процесс осуществляется путем приложения контролируемого напряжения (5–7 В) между платиновым микроэлектродом и соответствующим ITO-контактом с ограничением тока на уровне 100 мкА. Это приводит к локальному электрическому пробою парилена и формированию нанометрового проводящего канала с управляемой омической характеристикой [8].
Особенностью сформированных филаментов является возможность контролируемого изменения их проводимости в зависимости от приложенного напряжения, что может быть использовано для имитации синаптической пластичности при разработке биомиметических нейроинтерфейсов. Кроме того, нелинейная проводимость филаментов обеспечивает естественную фильтрацию высокочастотных составляющих регистрируемых сигналов, улучшая отношение сигнал/шум при записи потенциалов действия. При этом парилен обладает важными свойствами биосовместимости, является химически инертным и обладает гибким набором функциональных свойств [9].
Интеграция культуральной камеры
Для создания культуральной камеры используется модифицированная полистироловая чашка Петри диаметром 40 мм (рис.2). Модификация производится путем механического удаления дна чашки методом абразивной обработки и последующей финишной доводки хирургическим скальпелем для обеспечения ровного края. Полученное полимерное кольцо фиксируется на поверхности электродной подложки с использованием УФ-отверждаемой акриловой смолы, которая, благодаря ее биосовместимости, успешно используется при разработке общедоступных коммерческих вариантов ячеек [10]. Процесс отверждения проводится с использованием УФ-излучения (λ= 365 нм, мощность 100 мВт/см2) в течение 10 мин, что обеспечивает полную полимеризацию адгезива и минимизирует количество непрореагировавших мономеров.
Высота культуральной камеры составляет 5 мм, что обеспечивает общий доступный объем порядка 6 мл при площади культивирования ~12,6 см2. Такая конфигурация оптимизирована для поддержания стабильного объема культуральной среды при минимизации расстояния между поверхностью среды и объективом микроскопа, что может быть важно для методов оптической микроскопии с высоким разрешением при начальном юстировании измерительных зондов.
Интеграция системы поддержания жизнеспособности нейронов
Для длительного исследования живых нейронных сетей in vitro важно воспроизведение физиологических условий, включая температурный режим (37 °C) и газовый состав среды (5% CO₂) [11].
Система поддержания газовой среды основана на непрерывной подаче подготовленной газовой смеси через ячейку с культурой. Газовый поток регулируется ротаметром, подключенным к баллону с редуктором, что позволяет точно дозировать состав газа и скорость его подачи в ячейку. Непрерывная подача газа обеспечивает поддержание постоянной концентрации CO₂ в зоне соприкосновения жидкости с газовой средой и позволяет компенсировать утечки, возникающие через технологические отверстия капиллярного микроскопа.
Микрофлюидная система включает перистальтический насос MasterFlex C/L, термостатированный бак для буфера и замкнутый контур циркуляции биосовместимых трубок FedroTek. Нагрев раствора до 37 °C осуществляется изолированным элементом с ПИД-регулятором, что исключает температурные градиенты и позволяет создать систему с высокой точностью температурной стабилизации. Перистальтика обеспечивает пульсацию потока со скоростью 50–200 мкл/мин, имитируя естественную перфузию тканей, при этом объем ячейки и устройство входящих-выходящих клапанов в объеме ячейки позволяет создать ламинарный поток, что является критически важным для сохранения жизнеспособности клеточных культур. Интеграция обеих подсистем в микроскопический комплекс позволяет проводить долгосрочный мониторинг морфофункциональной динамики нейронов без нарушения физико-химических параметров среды.
ВЫВОДЫ
Разработанная биосовместимая мультиэлектродная ячейка открывает новые возможности для исследования динамики нейронных сетей in vitro. Ключевые преимущества системы:
Мультимодальная регистрация. Синхронная запись электрической активности (частота дискретизации 10 кГц) и СКМ-визуализация с полосой пропускания электрического сигнала в диапазоне 0–10 кГц (1 кадр за 5 мин при поле 50 × 50 мкм²) позволяют коррелировать функциональные и структурные изменения в реальном времени.
Биомиметический интерфейс. Мемристорные филаменты имитируют нелинейные свойства синапсов, обеспечивая двустороннее взаимодействие с нейронной сетью.
Высокая воспроизводимость. Все комплектующие для создания ячейки являются коммерчески доступными.
Перспективные направления применения включают:
БЛАГОДАРНОСТИ
Исследование выполнено в рамках государственного задания МГУ имени М.В.Ломоносова. ПО "ФемтоСкан Онлайн" предоставлено ООО НПП "Центр перспективных технологий". www.femtoscan.ru.
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Soscia D.A. et al. A flexible 3-dimensional microelectrode array for in vitro brain models. Lab on a Chip. 2020. Vol. 20. P. 901. https://doi.org/10.1039/C9LC01148J
Park D.-W. et al. Graphene-based carbon-layered electrode array technology for neural imaging and optogenetic applications. Nature Communications. 2014. Vol. 5. PP. 1–11. https://doi.org/10.1038/ncomms6258
Murali A. et al. Synthesis and Characterization of Indium Oxide Nanoparticles. Nano Letters 2001. Vol. 1 (6). PP. 287–289. https://doi.org/10.1021/nl010013q
Sofi A.H., Shah M.A. The study of the structural and morphology features of indium tin oxide (ITO) nanostructures. 2014. Mater. Res. Express. Vol. 1. P. 015041. https://doi.org/10.1088/2053-1591/1/1/015041
Song J.E. et al. Preparation and characterization of monodispersed indium–tin oxide nanoparticles. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 2005. Vol. 257–258. PP. 539–542. https://doi.org/10.1016/j.colsurfa.2004.07.037
Li Z. et al. Achieving Reliable and Ultrafast Memristors via Artificial Filaments in Silk Fibroin. Advanced Materials. John Wiley and Sons Inc. 2024. Vol. 36. P. 4. https://doi.org/10.1002/adma.202308843
Minnekhanov A.A. et al. Parylene Based Memristive Devices with Multilevel Resistive Switching for Neuromorphic Applications. Sci Rep. 2019. Vol. 9. P. 10800. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47263-9
Minnekhanov A.A. et al. On the resistive switching mechanism of parylene-based memristive devices. Org Electron. Elsevier B. V. 2019. Vol. 74. PP. 89–95. https://doi.org/10.1016/j.orgel.2019.06.052
Cai Y. et al. A flexible organic resistance memory device for wearable biomedical applications. Nanotechnology. Institute of Physics Publishing. 2016. Vol. 27. P. 27. https://doi.org/10.1088/0957-4484/27/27/275206
Buccelli S. et al. A Neuromorphic Prosthesis to Restore Communication in Neuronal Networks. iScience. Elsevier Inc. 2019. Vol. 19. PP. 402–414. https://doi.org/10.1016/j.isci.2019.07.046
Filippova S.Yu. et al. Cultivation of cells in alginate drops as a high-performance method of obtaining cell spheroids for bioprinting. South Russian Journal of Cancer. ANO -Perspective of Oncology, 2023. Vol. 4. No. 2. PP. 47–55. https://doi.org/10.37748/2686-9039-2023-4-2-5
Научная статья
РАЗРАБОТКА БИОСОВМЕСТИМОЙ МУЛЬТИЭЛЕКТРОДНОЙ ЯЧЕЙКИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЖИВЫХ СЕТЕЙ НЕЙРОНОВ МЕТОДОМ СКАНИРУЮЩЕЙ КАПИЛЛЯРНОЙ МИКРОСКОПИИ
О.В.Иванов1, 2, магистр, ORCID: 0000-0003-2765-2116
А.И.Ахметова1, 2, к.ф.-м.н., ст. науч. сотр., вед. спец., ORCID: 0000-0002-5115-8030
И.В.Яминский1, 2, д.ф.-м.н., проф., ген. дир., ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Аннотация. Разработана и охарактеризована инновационная биосовместимая мультиэлектродная ячейка, интегрирующая технологии регистрации электрической активности нейронов с возможностями высокоразрешающей сканирующей капиллярной микроскопии. Предложенная конструкция включает подложку из ITO-покрытого стекла с лазерно-паттернированными электродами, изолированными слоем парилена и функционализированными медно-золотыми микроэлектродами с мемристорными свойствами. Прототип демонстрирует преимущества одновременной регистрации электрической активности и морфологических изменений нейронов, открывая новые возможности для исследования нейрональной пластичности, структурного распределения нервной ткани и скрининга нейроактивных соединений.
Ключевые слова: биосовместимая мультиэлектродная ячейка, сканирующая капиллярная микроскопия, нейроны, электрофизиология
Для цитирования: О.В. Иванов, А.И. Ахметова, И.В. Яминский. Разработка биосовместимой мультиэлектродной ячейки для исследования живых сетей нейронов методом сканирующей капиллярной микроскопии. НАНОИНДУСТРИЯ. 2025. Т. 18. № 3–4. С. 166–172. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.3-4.166.172.
Received: 21.04.2025 | Accepted: 25.04.2025 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.3-4.166.172
Original paper
DEVELOPMENT OF A BIOCOMPATIBLE MULTI-ELECTRODE CELL FOR STUDYING LIVING NEURONAL NETWORKS USING COMBINED SCANNING CAPILLARY MICROSCOPY
O.V.Ivanov1 ,2, Master, ORCID: 0000-0003-2765-2116
A.I.Akhmetova1, 2, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Senior Researcher, Leading Specialist, ORCID: 0000-0002-5115-8030
I.V.Yaminsky1, 2, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Prof., Director, ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Abstract. An innovative biocompatible multielectrode cell integrating neuronal electrical activity recording technologies with high-resolution scanning capillary microscopy capabilities has been developed and characterized. The proposed design includes an ITO-coated glass substrate with laser-patterned electrodes insulated with a 180 nm thick parylene layer and functionalized copper-gold microelectrodes with memristor properties. The prototype demonstrates the advantages of simultaneous recording of neuronal electrical activity and morphological changes, opening up new possibilities for studying neuronal plasticity, structural distribution of nervous tissue, and screening of neuroactive compounds.
Keywords: biocompatible multielectrode cell, scanning capillary microscopy, neurons, electrophysiology
For citation: O.V. Ivanov, A.I. Akhmetova, I.V. Yaminsky. Development of a biocompatible multi-electrode cell for studying living neuronal networks using combined scanning capillary microscopy. NANOINDUSTRY. 2025. Vol. 18. No. 3–4. PP. 166–172. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.3-4.166.172.
ВВЕДЕНИЕ
Ячейки для 3D-визуализации и электрофизиологии. Обзор
Современные нейробиологические исследования требуют интеграции электрофизиологических и микроскопических методов для комплексного анализа структурно-функциональных свойств нейронных сетей. Существующие решения в этой области имеют различные преимущества и ограничения.
Коммерческие мультиэлектродные системы (Multielectrode Arraуs, или MEA-системы) с прозрачными подложками, такие как MEA2100-System от Multichannel Systems, позволяют совместить электрофизиологическую регистрацию с инвертированной оптической микроскопией [1]. Однако эти системы с трудом совместимы с методами микроскопии высокого разрешения из-за большой толщины подложки и сложной системы регистрации электрического сигнала, а также ввиду наличия значительного рабочего расстояния.
Экспериментальные разработки включают системы с интегрированными оптоволоконными датчиками, позволяющими проводить оптическую стимуляцию и регистрацию непосредственно в области расположения MEA-электродов. Такие системы обеспечивают пространственно-совмещенную электрическую и оптическую регистрацию, однако имеют ограниченное пространственное разрешение и требуют сложных технологических процессов для изготовления.
Для преодоления оптических ограничений предложены MEA на основе прозрачных проводящих материалов. Так, Park и соавторы разработали MEA с графеновыми электродами, обеспечивающими оптическую прозрачность >90% в видимом диапазоне [2]. Однако использованные графеновые электроды имеют относительно высокий импеданс (>1 МОм на частоте 1 кГц), что ограничивает их применение для регистрации низкоамплитудных сигналов.
Перспективным направлением является интеграция MEA с методами сканирующей зондовой микроскопии. Системы, сочетающие MEA-регистрацию с атомно-силовой микроскопией, позволяют исследовать корреляцию между морфологическими и электрическими изменениями нейронов. Однако эти системы имеют ограничения, связанные с геометрией и электроизоляцией АСМ-зондов. Есть и некоторая сложность совмещения измерительной системы (как правило оптической) АСМ с жидкой средой культивирования. В этом контексте разработанная биосовместимая ячейка предлагает принципиально новый подход, сочетающий преимущества капиллярной микроскопии и высокоплотных MEA.
Разработка ячейки для 3D-визуализации биообъектов с одновременным проведением электрофизиологических измерений
Подложка и электродная система
Разработанная биосовместимая мультиэлектродная ячейка основана на стеклянной подложке размером 50 × 50 × 1 мм3 с нанесенным покрытием из оксида индия-олова (ITO, Indium Tin Oxide). Выбор ITO обусловлен его оптической прозрачностью (>85% в видимом диапазоне) в сочетании с хорошей электрической проводимостью (поверхностное сопротивление <10 Ом/квадрат), что обеспечивает совместимость с методами оптической микроскопии [3–5].
Формирование структуры электродной системы осуществляется методом лазерного отжига с использованием установки SharpLase SHARPMARK 20-F с Nd:YAG лазером (λ=1064 нм, мощность 20 Вт) в импульсном режиме с опцией High contrast. Данный метод обеспечивает пространственное разрешение позиционирования ~10 мкм, что достаточно для создания прецизионных микроэлектродных структур. Преимуществом лазерного отжига макроэлектродов перед традиционной фотолитографией является значительная эффективность методики и высокая скорость изготовления подложек без использования химических реагентов.
Электродная система включает четыре макроэлектрода (5 × 10 мм) по периферии подложки для интерфейса с регистрирующим оборудованием, токоведущие дорожки с зазором 1 мм между ними и максимальной площадью покрытия для увеличения суммарной емкости ячейки, уменьшения сопротивления каждого из электродов, а также четыре микроэлектрода (300 мкм) в центральной части верхнего слоя ячейки.
Конфигурация электродов оптимизирована для обеспечения максимального пространственного разрешения при минимизации электромагнитных помех между каналами регистрации.
Изоляция и функционализация электродов
Для электрической изоляции токоведущих дорожек и определения активных зон микроэлектродов используется слой парилена-C толщиной 180 нм (рис.1). Париленовый слой был нанесен методом поверхностной полимеризации в газовой фазе с использованием вакуумной системы напыления SCS Labcoater PDS 2010. PDS 2010 преобразует димер парилена (2,2-парациклофан или его производные) в газообразный мономер. Материал полимеризируется на подложке при его нанесении при комнатной температуре. При используемых уровнях вакуума проводящий слой подложки равномерно обрабатывался газообразным мономером с последующим осаждением, в результате чего получалось прочное защитное покрытие.
Функциональные микроэлектроды формируются методом магнетронного напыления последовательно меди и золота на поверхность парилена через маску с отверстиями 300 × 300 мкм. Первый слой напыления производится медью толщиной около 300 нм для последующего формирования филамента в париленовом слое. Перечисленные выше металлы были выбраны из-за их широкого применения в электронной технике, в том числе при изготовлении мемристивных устройств [6]. Золото выбрано как электродный материал благодаря ее высокой биосовместимости, коррозионной стойкости в физиологических растворах и низкому импедансу на границе "электрод – электролит". Медь выбрана в качестве электрохимически активного металла для формирования филаментов сквозь слой париленового изолятора по аналогии с технологией формирования филаментов при изготовлении нейроморфных систем [7].
Инновационным аспектом разработанной ячейки является применение технологии формирования проводящих филаментов для создания электрического контакта между платиновыми микроэлектродами и нижележащими ITO-электродами через слой парилена. Данный процесс осуществляется путем приложения контролируемого напряжения (5–7 В) между платиновым микроэлектродом и соответствующим ITO-контактом с ограничением тока на уровне 100 мкА. Это приводит к локальному электрическому пробою парилена и формированию нанометрового проводящего канала с управляемой омической характеристикой [8].
Особенностью сформированных филаментов является возможность контролируемого изменения их проводимости в зависимости от приложенного напряжения, что может быть использовано для имитации синаптической пластичности при разработке биомиметических нейроинтерфейсов. Кроме того, нелинейная проводимость филаментов обеспечивает естественную фильтрацию высокочастотных составляющих регистрируемых сигналов, улучшая отношение сигнал/шум при записи потенциалов действия. При этом парилен обладает важными свойствами биосовместимости, является химически инертным и обладает гибким набором функциональных свойств [9].
Интеграция культуральной камеры
Для создания культуральной камеры используется модифицированная полистироловая чашка Петри диаметром 40 мм (рис.2). Модификация производится путем механического удаления дна чашки методом абразивной обработки и последующей финишной доводки хирургическим скальпелем для обеспечения ровного края. Полученное полимерное кольцо фиксируется на поверхности электродной подложки с использованием УФ-отверждаемой акриловой смолы, которая, благодаря ее биосовместимости, успешно используется при разработке общедоступных коммерческих вариантов ячеек [10]. Процесс отверждения проводится с использованием УФ-излучения (λ= 365 нм, мощность 100 мВт/см2) в течение 10 мин, что обеспечивает полную полимеризацию адгезива и минимизирует количество непрореагировавших мономеров.
Высота культуральной камеры составляет 5 мм, что обеспечивает общий доступный объем порядка 6 мл при площади культивирования ~12,6 см2. Такая конфигурация оптимизирована для поддержания стабильного объема культуральной среды при минимизации расстояния между поверхностью среды и объективом микроскопа, что может быть важно для методов оптической микроскопии с высоким разрешением при начальном юстировании измерительных зондов.
Интеграция системы поддержания жизнеспособности нейронов
Для длительного исследования живых нейронных сетей in vitro важно воспроизведение физиологических условий, включая температурный режим (37 °C) и газовый состав среды (5% CO₂) [11].
Система поддержания газовой среды основана на непрерывной подаче подготовленной газовой смеси через ячейку с культурой. Газовый поток регулируется ротаметром, подключенным к баллону с редуктором, что позволяет точно дозировать состав газа и скорость его подачи в ячейку. Непрерывная подача газа обеспечивает поддержание постоянной концентрации CO₂ в зоне соприкосновения жидкости с газовой средой и позволяет компенсировать утечки, возникающие через технологические отверстия капиллярного микроскопа.
Микрофлюидная система включает перистальтический насос MasterFlex C/L, термостатированный бак для буфера и замкнутый контур циркуляции биосовместимых трубок FedroTek. Нагрев раствора до 37 °C осуществляется изолированным элементом с ПИД-регулятором, что исключает температурные градиенты и позволяет создать систему с высокой точностью температурной стабилизации. Перистальтика обеспечивает пульсацию потока со скоростью 50–200 мкл/мин, имитируя естественную перфузию тканей, при этом объем ячейки и устройство входящих-выходящих клапанов в объеме ячейки позволяет создать ламинарный поток, что является критически важным для сохранения жизнеспособности клеточных культур. Интеграция обеих подсистем в микроскопический комплекс позволяет проводить долгосрочный мониторинг морфофункциональной динамики нейронов без нарушения физико-химических параметров среды.
ВЫВОДЫ
Разработанная биосовместимая мультиэлектродная ячейка открывает новые возможности для исследования динамики нейронных сетей in vitro. Ключевые преимущества системы:
Мультимодальная регистрация. Синхронная запись электрической активности (частота дискретизации 10 кГц) и СКМ-визуализация с полосой пропускания электрического сигнала в диапазоне 0–10 кГц (1 кадр за 5 мин при поле 50 × 50 мкм²) позволяют коррелировать функциональные и структурные изменения в реальном времени.
Биомиметический интерфейс. Мемристорные филаменты имитируют нелинейные свойства синапсов, обеспечивая двустороннее взаимодействие с нейронной сетью.
Высокая воспроизводимость. Все комплектующие для создания ячейки являются коммерчески доступными.
Перспективные направления применения включают:
- создание биочипов для скрининга препаратов против болезни Альцгеймера с возможностью отслеживания β-амилоид-индуцированной синаптической дисфункции;
- исследование механизмов эпилептогенеза через пространственно-временной анализ распространения патологической активности;
- разработка нейроинтерфейсов нового поколения с обратной связью на основе морфофункциональных параметров.
БЛАГОДАРНОСТИ
Исследование выполнено в рамках государственного задания МГУ имени М.В.Ломоносова. ПО "ФемтоСкан Онлайн" предоставлено ООО НПП "Центр перспективных технологий". www.femtoscan.ru.
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Soscia D.A. et al. A flexible 3-dimensional microelectrode array for in vitro brain models. Lab on a Chip. 2020. Vol. 20. P. 901. https://doi.org/10.1039/C9LC01148J
Park D.-W. et al. Graphene-based carbon-layered electrode array technology for neural imaging and optogenetic applications. Nature Communications. 2014. Vol. 5. PP. 1–11. https://doi.org/10.1038/ncomms6258
Murali A. et al. Synthesis and Characterization of Indium Oxide Nanoparticles. Nano Letters 2001. Vol. 1 (6). PP. 287–289. https://doi.org/10.1021/nl010013q
Sofi A.H., Shah M.A. The study of the structural and morphology features of indium tin oxide (ITO) nanostructures. 2014. Mater. Res. Express. Vol. 1. P. 015041. https://doi.org/10.1088/2053-1591/1/1/015041
Song J.E. et al. Preparation and characterization of monodispersed indium–tin oxide nanoparticles. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 2005. Vol. 257–258. PP. 539–542. https://doi.org/10.1016/j.colsurfa.2004.07.037
Li Z. et al. Achieving Reliable and Ultrafast Memristors via Artificial Filaments in Silk Fibroin. Advanced Materials. John Wiley and Sons Inc. 2024. Vol. 36. P. 4. https://doi.org/10.1002/adma.202308843
Minnekhanov A.A. et al. Parylene Based Memristive Devices with Multilevel Resistive Switching for Neuromorphic Applications. Sci Rep. 2019. Vol. 9. P. 10800. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47263-9
Minnekhanov A.A. et al. On the resistive switching mechanism of parylene-based memristive devices. Org Electron. Elsevier B. V. 2019. Vol. 74. PP. 89–95. https://doi.org/10.1016/j.orgel.2019.06.052
Cai Y. et al. A flexible organic resistance memory device for wearable biomedical applications. Nanotechnology. Institute of Physics Publishing. 2016. Vol. 27. P. 27. https://doi.org/10.1088/0957-4484/27/27/275206
Buccelli S. et al. A Neuromorphic Prosthesis to Restore Communication in Neuronal Networks. iScience. Elsevier Inc. 2019. Vol. 19. PP. 402–414. https://doi.org/10.1016/j.isci.2019.07.046
Filippova S.Yu. et al. Cultivation of cells in alginate drops as a high-performance method of obtaining cell spheroids for bioprinting. South Russian Journal of Cancer. ANO -Perspective of Oncology, 2023. Vol. 4. No. 2. PP. 47–55. https://doi.org/10.37748/2686-9039-2023-4-2-5
Отзывы читателей
