eng
Выпуск #5/2025
А.И.Ахметова, И.В.Яминский
МОРФОЛОГИЯ КЛЕТОК КРОВИ ПО ДАННЫМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ
МОРФОЛОГИЯ КЛЕТОК КРОВИ ПО ДАННЫМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ
Просмотры: 972
Зондовая микроскопия позволяет исследовать морфологию, наноструктуру мембраны, механические свойства и биохимические взаимодействия клеток крови в течение времени в жидкости и на воздухе. Механические свойства, жесткость и эластичность мембраны можно количественно оценить с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ). АСМ можно применять в различных областях, начиная от оценки качества хранящейся крови в банках переливания до выяснения молекулярных механизмов окислительного повреждения и изменений, связанных с различными заболеваниями. Использование АСМ в изучении эритроцитов помогает в понимании причин нейродегенеративных заболеваний, диабета и выкидышей.
Получено: 3.07.2025 г. | Принято: 10.07.2025 г. | https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.5.266.274
Научная статья
МОРФОЛОГИЯ КЛЕТОК КРОВИ ПО ДАННЫМ
АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ
А.И.Ахметова1, 2, к.ф.-м.н., ст. науч. сотр., вед. спец., ORCID: 0000-0002-5115-8030
И.В.Яминский1, 2, д.ф.-м.н., проф., ген. дир., ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Аннотация. Зондовая микроскопия позволяет исследовать морфологию, наноструктуру мембраны, механические свойства и биохимические взаимодействия клеток крови в течение времени в жидкости и на воздухе. Механические свойства, жесткость и эластичность мембраны можно количественно оценить с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ). АСМ можно применять в различных областях, начиная от оценки качества хранящейся крови в банках переливания до выяснения молекулярных механизмов окислительного повреждения и изменений, связанных с различными заболеваниями. Использование АСМ в изучении эритроцитов помогает в понимании причин нейродегенеративных заболеваний, диабета и выкидышей.
Ключевые слова: эритроциты, эхиноциты, клетки крови, дискоциты, лейкоциты, атомно-силовая микроскопия, механические свойства
Для цитирования: А.И. Ахметова, И.В. Яминский. Морфология клеток крови по данным атомно-силовой микроскопии. НАНОИНДУСТРИЯ. 2025. Т. 18. № 5. С. 266–274. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.5.266.274.
Received: 3.07.2025 | Accepted: 10.07.2025 | https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.5.266.274
Original paper
MORPHOLOGY OF BLOOD CELLS BASED ON ATOMIC FORCE MICROSCOPY DATA
A.I.Akhmetova1, 2, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Senior Researcher, Leading Specialist, ORCID: 0000-0002-5115-8030
I.V.Yaminsky1, 2, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Prof., Director General, ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Abstract. Probe microscopy allows us to study the morphology, nanostructure of the membrane, mechanical properties and biochemical interactions of blood cells over time in liquid and in air. The mechanical properties, rigidity and elasticity of the membrane can be quantified using atomic force microscopy (AFM). AFM can be used in a variety of areas: from assessing the quality of stored blood in transfusion banks to elucidating the molecular mechanisms of oxidative damage and disease-related changes. The use of AFM in the study of red blood cells helps in understanding the causes of neurodegenerative diseases, diabetes, and miscarriages.
Keywords: erythrocytes, echinocytes, blood cells, discocytes, leukocytes, atomic force microscopy, mechanical properties
For citation: A.I. Akhmetova, I.V. Yaminsky. Morphology of blood cells based on atomic force microscopy data. NANOINDUSTRY. 2025. Vol. 18. No. 5. PP. 266.274. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.5.266.274.
ВВЕДЕНИЕ
Эритроцит — клетка, состоящая из цитоплазмы и клеточной мембраны, которую можно разделить на две части: липидный бислой и цитоскелет. Цитоскелет взаимодействует с интегральными белками и липидами для сохранения целостности мембраны. Он играет важную роль в поддержании формы, обеспечении гибкости клетки и организации липидов в эритроците. Дефицит любого из белков может привести к изменению структуры цитоскелета эритроцита, что снижает общую степень эластичности мембраны. Это, в свою очередь, может привести к неспособности эритроцита изменять форму при прохождении через капилляры, вызывая микрососудистые осложнения и дисфункции в транспорте кислорода.
Изменения морфологии эритроцитов связывают со старением эритроцитов и патологическими состояниями. АСМ позволяет получать изображения поверхностей эритроцитов с высоким разрешением без необходимости сложной пробоподготовки образцов, без фиксации, в условиях, близких к естественным, например, в буферных растворах (рис.1). Это позволяет визуализировать мельчайшие структуры поверхности, включая расположение частиц нанометрового масштаба на мембране эритроцитов, с латеральным разрешением до 0,5–1 нм и вертикальным разрешением 0,1–0,2 нм (рис.2) [1].
Исследования показали, что при длительном хранении (до 35 дней при +4 °C) диаметр клеток крови снижается, а модуль Юнга мембран эритроцитов значительно увеличивается, что коррелирует с морфологическими изменениями: превращением дискоцитов в эхиноциты (рис.3) и сфероэхиноциты, которые менее пригодны для целей переливания крови [2]. Средние значения и ширина распределения модуля Юнга значительно увеличивались в образцах, взятых у пациентов с сахарным диабетом и курильщиков по сравнению с образцами, взятыми у здоровых доноров; в то же время средние значения модуля Юнга увеличиваются в зависимости от возраста пациента [3].
В работе [4] нормальное старение эритроцитов визуализировалось как трансформации формы клеток (от нормального двояковогнутого диска через различные морфологические классы до полной потери нормальной формы, то есть плотных сфероцитов). Все эти изменения сопровождались постепенным уменьшением размера и шероховатости мембраны клеток. Уменьшение диаметра было связано с изменением формы. С помощью АСМ было установлено, что диаметр двояковогнутых и зазубренных клеток был больше, чем у спикулированных и сферических эритроцитов. Увеличение популяций спикулоцитов и сфероцитов произошло значительно раньше у женщин, страдающих от выкидышей на ранней стадии (ВРС) по сравнению с контрольными группами (здоровыми женщинами и беременными). Были показаны различные пути старения эритроцитов, более быстрое возникновение морфологических изменений эритроцитов при ВРС по сравнению с обеими контрольными группами, показана разница между шероховатостью мембраны свежих эритроцитов при ВРС и эритроцитов двух контрольных групп. Значительно более высокое значение среднеквадратичной шероховатости клеток в группе ВРС обусловлено более неравномерной складчатостью мембраны и появлением некоторых выступов, вероятно, вследствие нарушения целостности плазматической мембраны и/или начала микровезикуляции. Везикуляция зрелых эритроцитов способствует удалению дефектных участков мембраны эритроцитов. Известно, что при некоторых патологических ситуациях и в процессе старения эритроцитов везикуляция плазматической мембраны усиливается [5, 6]. Высвобождение микровезикул (микрочастиц) происходит в результате перераспределения фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина с внутреннего листка на внешний листок плазматической мембраны и происходит избирательно в богатых липидами микродоменах внутри плазматической мембраны [7].
Изменение формы клеток из-за частичной или полной потери деформируемости может происходить в результате различных патологических состояний [8], накопления активных форм кислорода (АФК) или как часть процесса старения эритроцитов [9]. Снижение эластичности является признаком сокращения продолжительности жизни клеток и может быть вызвано различными факторами, связанными с окислительным стрессом, измененным составом мембраны и патологическими состояниями.
Известно, что форма эритроцитов в значительной степени определяется механическими свойствами цитоскелета и обилием аденозинтрифосфата (АТФ) [10]. АТФ важен для поддержания дисковидной формы эритроцитов, поскольку истощение АТФ вызывает изменение от дискоцита к форме эхиноцита [11]. Например, серповидные эритроциты характеризуются повышенными показателями окислительного стресса и сниженным уровнем АТФ [12]. Было показано, что у беременных женщин уровень АТФ в эритроцитах значительно ниже, чем у небеременных [13].
Повышенная жесткость мембраны характерна для эритроцитов, полученных от пациентов с нейродегенеративными заболеваниями по сравнению со здоровыми. В работе [14], используя атомно-силовую и традиционную оптическую микроскопию, провели ультраструктурный анализ эритроцитов как модели периферических клеток с характерными признаками для нейродегенеративных патологий – болезни Паркинсона (БП), бокового амиотрофического склероза (БАС) и болезни Альцгеймера (БА). Клетки крови при нейродегенеративных патологиях характеризуются уменьшенным количеством двояковогнутой дискообразной формы, меньшей шероховатостью поверхности и более высоким модулем Юнга по сравнению со здоровыми клетками. Двояковогнутая форма по-прежнему является преобладающей формой в клетках при БАС и БА, в то время как в морфологии БП доминируют зазубренные клетки.
Экспериментально установлено, что гемин и окислительные процессы в крови оказывают специфическое воздействие на наноструктуру мембран эритроцитов, образуя домены на поверхности. Характерный размер зернистых структур в доменах составляет 100–200 нм, что совпадает с характерным размером спектринового матрикса [15].
Исследование окислительных и окислительно-восстановительных процессов
АСМ эффективно применяется для изучения изменений на молекулярном уровне в эритроцитах, вызванных окислением. Окислительный стресс, вызванный ультрафиолетовым (УФ) облучением, нарушает формируемую спектрином сеть цитоскелета, лежащую в основе мембраны эритроцитов, что приводит к морфологическим изменениям и потере типичной формы дискоцитов. Размер ячеек спектриновой сети увеличивается с примерно 80–200 нм в контрольных образцах до 600–1000 нм после воздействия УФ-излучения, что указывает на структурный распад [4, 5, 16, 17]. Лечение антиоксидантами может сохранить целостность спектриновой сетки и морфологию эритроцитов, что подтверждается исследованиями АСМ.
С помощью АСМ выявили изменения морфологии лейкоцитов при лейкемии – на поверхности появились игольчатые выступы [18]. При детальном рассмотрении изображения лейкоцитов можно оценить характер расположения на подложке, напоминающий сладжи. Белые кровяные клетки у пациентов с диабетом были более жесткими, чем лейкоциты у здоровых доноров. По сравнению со здоровыми донорами диаметр лейкоцитов и модуль Юнга были значительно увеличены, хотя высота клеток уменьшилась [19].
Эритроциты и лейкоциты у пациентов с диабетом демонстрируют изменения формы, повышенную жесткость и склонность к агрегации. В этом исследовании влияния диабета на эритроциты показано, что избыток глюкозы в крови приводит к значительной деформации формы эритроцитов и легкой коррозии на их поверхности, поскольку глюкоза может проходить через мембрану и окружать ее как оболочка. Эритроциты увеличиваются в размере и склеиваются, что в конечном итоге приводят к повышению вязкости и замедлению подвижности эритроцитов [20]. В данном исследовании также сравнили влияние диабета и курения на такие параметры, как диаметр, глубина впадины и шероховатость эритроцитов. Оказалось, что курение существенно сильнее влияет на изменение всех трех параметров, чем диабет: для заядлых курильщиков шероховатость увеличивается в 5 раз, глубина впадины уменьшается в 3,3 раза, эритроциты принимают неправильную форму.
АСМ-исследование клеток крови при диабете выявило различие в морфологии: эритроциты из здоровой группы представляют собой нормоцит: круглый, с видимой впадиной; эритроциты группы с преддиабетом имеют нерегулярную форму, эритроциты удлиненные, а вогнутость находится не в центре. Изображения эритроцитов с метаболическим синдромом напоминают стоматоцит. Группа больных сахарным диабетом 2 типа имеет неправильную морфологию эритроцитов («гребневидный» эритроцит) [21].
Исследование клеток крови при талассемии показало, что эритроциты становятся зазубренными, имеют разную морфологию, анизоцитозную и гипохромную форму. Лишь немногие клетки представлены в форме двояковогнутого диска. Клетки меньше по размеру и деформированы с образованием множества больших отверстий. Эритроциты при железодефицитной анемии имеют еще более деформированную морфологию, чем при талассемии: клетки представлены в форме эллиптоцита, круглыми, овальными, и в центре эритроцитов наблюдается большее набухание [22].
С помощью АСМ было обнаружено, что эритроциты пациентов с мегалобластной анемией имели больший размер, однако их высота, средняя шероховатость, значение пик-впадина Rp-v (представляющее собой разницу между максимальной и минимальной высотой по оси Z на поверхности клетки в области анализа) и площадь поверхности были ниже по сравнению с контрольной группой [23].
У пациентов отделения анестезиологии и реанимации с черепно-мозговой травмой, ишемическим и геморрагическим инсультом, отеком головного мозга, постгипоксической энцефалопатией наблюдались различные формы клеток крови, на поверхности мембраны эритроцитов возникали локальные дефекты: дефекты пэллора, тора, наноструктуры. Ряд дефектов является стартовым механизмов развития тотальных повреждений мембран. У всех пациентов, включенных в исследование, наблюдали 16±7% активных тромбоцитов на мазке. Тромбоциты входят в число показателей острой фазы воспаления при сепсисе, опухолях и кровотечениях. Увеличение количества тромбоцитов является сигналом развития воспалительных патологий [24].
Инфекционные заболевания (малярия, COVID-19, ВИЧ)
В работе [25] обнаружили изменение в геометрии эритроцитов: увеличение на 14% в диаметре и уменьшение на 30% в высоте по сравнению с контрольной группой. С помощью АСМ выявили изменения структуры эритроцитов при COVID-19: увеличение диаметра клеток с 9 до 10,5 мкм, заметно снижение высоты впадины в центре диска, увеличение модуля Юнга с 4,5 до 8 кПа.
С помощью АСМ были зафиксированы аномальные формы эритроцитов, например, акантоциты [26]. Также были обнаружены клетки в мазке крови в форме эхиноцитов после COVID-19 [27]. При малярии паразиты изменяют мембрану эритроцитов, формируя выступы, которые способствуют адгезии к стенкам сосудов [28]. Также на поверхности были обнаружены резкие изменения сети спектрина после заражения, то есть сеть спектрина частично разрушается на определенной стадии заражения.
ВЫВОДЫ
В этом обзоре обобщены результаты недавних исследований, демонстрирующие возможности АСМ в исследовании эритроцитов и их применение в клинической практике. Эластичность мембраны эритроцита является очень важным фактором в определении состояния здоровья. Ее количественное определение имеет решающее значение для понимания механизмов, приводящих к нарушению эластичности эритроцитов. Методы АСМ можно успешно применять также для контроля терапевтических процедур.
АСМ позволяет детально исследовать форму, рельеф и наноструктуру мембран эритроцитов, выявляя изменения, связанные с различными физиологическими и патологическими состояниями, такими как интоксикация, диабет, мегалобластная анемия и другие заболевания.
АСМ дает возможность измерять ключевые морфометрические параметры эритроцитов –размеры, соотношение осей, глубину вогнутости диска, толщину и шероховатость поверхности. Эти характеристики отражают деформируемость и упругие свойства мембраны, которые важны для прохождения эритроцитов через узкие капилляры и поддержания их функциональной активности в кровотоке. Инструментарий программного обеспечения "ФемтоСкан Онлайн" позволяет получить морфологические параметры клетки в количественном виде: среднюю и среднеквадратичную шероховатость, оценить глубину впадины эритроцита, а также другие параметры [29].
Кроме того, АСМ позволяет выявлять микроскопические повреждения и дефекты мембран, которые могут возникать под воздействием токсинов, стрессовых факторов или при хранении крови. Это делает АСМ ценным инструментом для диагностики и мониторинга заболеваний, связанных с изменениями морфологии и механики эритроцитов.
АСМ облегчает обнаружение морфологических и биомеханических изменений в
эритроцитах, связанных с различными заболеваниями крови и системными заболеваниями. Изменения жесткости и эластичности мембраны служат биомаркерами патологических состояний, что дает преимущества по сравнению с традиционными биохимическими анализами, которые могут быть недостаточно чувствительными и требовать больших объемов образцов. АСМ также позволяет проводить визуализацию клеток крови in situ и in vivo, что способствует ранней диагностике и мониторингу прогрессирования заболеваний.
Таким образом, атомно-силовая микроскопия обеспечивает комплексное морфологическое и структурное исследование эритроцитов, что способствует лучшему пониманию их физиологии и патологии на нанометровом уровне.
БЛАГОДАРНОСТИ
Исследование выполнено в рамках государственного задания МГУ имени М.В.Ломоносова. ПО "ФемтоСкан Онлайн" предоставлено ООО НПП "Центр перспективных технологий", www.femtoscan.ru
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Rakshak R., Bhatt S. et al. Characterizing morphological alterations in blood related disorders through Atomic Force Microscopy. Nanotheranostics. 2024. Vol. 8. No. 3. PP. 330–343. https://doi.org/10.7150/ntno.93206
Lamzin I.M., Khayrullin R.M. The quality assessment of stored red blood cells probed using atomic-force microscopy. Anat Res Int. 2014. P. 869683. https://doi.org/10.1155/2014/869683
Lekka M., Fornal M. et al. Erythrocyte stiffness probed using atomic force microscope. Biorheology. 2005. Vol. 42. No. 4. PP. 307–317. https://doi.org/10.1177/0006355X2005042004004
Langari A., Strijkova V. et al. Morphometric and Nanomechanical Features of Erythrocytes Characteristic of Early Pregnancy Loss. International Journal of Molecular Sciences. 2022. Vol. 23. No. 9. P. 4512. https://doi.org/10.3390/ijms23094512
Kaczmarska M.; Grosicki M. et al. Temporal sequence of the human RBCs’ vesiculation observed in nano-scale with application of AFM and complementary techniques. Nanomed. Nanotechnol. Biol. Med. 2020. Vol. 28. P. 102221. https://doi.org/10.1016/j.nano.2020.102221
Li H., Lykotrafitis G. Vesiculation of healthy and defective red blood cells. Phys. Rev. E Stat. Nonlinear Soft Matter Phys. 2015. Vol. 92. P. 012715. https://doi.org/10.1103/PhysRevE.92.012715
Said A.S., Rogers S.C., Doctor A. Physiologic impact of circulating RBC microparticles upon blood-vascular interactions. Front. Physiol. 2017. Vol. 8. P. 1120. https://doi.org/10.3389/fphys.2017.01120
McMahon Timothy J. Red Blood Cell Deformability, Vasoactive Mediators, and Adhesion. Front. Physiol. 2019. Vol. 10. P. 1417. https://doi.org/10.3389/fphys.2019.01417
Barshtein G., Pajic-Lijakovic I., Gural A. Deformability of Stored Red Blood Cells. Front. Physiol. 2021. Vol. 12. P. 12. https://doi.org/10.3389/fphys.2021.722896
Gov N., Safran S.A. Red blood cell shape and fluctuations: Cytoskeleton confinement and ATP activity. J. Biol. Phys. 2005. Vol. 31. PP. 453–464. https://doi.org/10.1007/s10867-005-6472-7
Lim H.W.G., Wortis M., Mukhopadhyay R. Stomatocyte-discocyte-echinocyte sequence of the human red blood cell: Evidence for the bilayer- couple hypothesis from membrane mechanics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. Vol. 99. PP. 16766–16769. https://doi.org/10.1073/pnas.202617299
Sabina R.L., Wandersee N.J., Hillery C.A. Ca2+-CaM activation of AMP deaminase contributes to adenine nucleotide dysregulation and phosphatidylserine externalization in human sickle erythrocytes. Br. J. Haematol. 2009. Vol. 144. PP. 434–445. https://doi.org/10.1111/j.1365-2141.2008.07473.x
Marumoto Y., Kaibara M., Taniguchi I. Erythrocyte deformability and adenosine triphosphate (ATP) levels in normal pregnancy and puerperium. Nihon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi. 1984. Vol. 36. PP. 2079–2084.
Strijkova-Kenderova V., Todinova S. et al. Morphometry and Stiffness of Red Blood Cells—Signatures of Neurodegenerative Diseases and Aging. Int. J. Mol. Sci. 2022. Vol. 23. P. 227. https://doi.org/10.3390/ijms23010227
Sergunova V.A., Chernyaev A.P. et al. Nanostructure of erythrocyte membranes in blood intoxication. A study using atomic force microscopy. Almanac of Clinical Medicine. 2016. Vol. 44. PP. 234–241. https://doi.org/10.18786/2072-0505-2016-44-2-234-241
Kozlova E., Chernysh A. et al. Atomic force microscopy study of red blood cell membrane nanostructure during oxidation-reduction processes. J Mol Recognit. 2018. Vol. 31. No. 10. P. e2724. https://doi.org/10.1002/jmr.2724
P.H.J. Wilding. Causes of obesity. Pract Diabetes Int. 2001. https://doi.org/10.1002/pdi.277
Gaman A., Osiac E. et al. Surface morphology of leukemic cells from chronic myeloid leukemia under atomic force microscopy. Current health sciences journal. 2013. Vol. 39. No. 1. PP. 45–47.
Alexandrova A., Antonova N., Skorkina M.Y. et al. Evaluation of the elastic properties and topography of leukocytes’ surface in patients with type 2 diabetes mellitus using atomic force microscope. Ser. Biomech. 2017. Vol. 31. PP. 16–24.
AlSalhi S., Devanesan M. S. et al. Impact of Diabetes Mellitus on Human Erythrocytes: Atomic Force Microscopy and Spectral Investigations. Int. J. Environ. Res. Public Health. 2018. Vol. 15. P. 2368. https://doi.org/10.3390/ijerph15112368
Loyola-Leyva A., Loyola-Rodríguez J.P. et al. Application of atomic force microscopy to assess erythrocytes morphology in early stages of diabetes. A pilot study. Micron. 2021. Vol. 141. P. 102982. https://doi.org/10.1016/j.micron.2020.102982
Saira T. et al. Diagnosis of thalassemia and iron deficiency anemia using confocal and atomic force microscopy. Laser Phys. Lett. 2017. Vol. 14. P. 115703. https://doi.org/10.1088/1612-202X/aa8bca
Wu Q., Liu J. et al. Mechanism of megaloblastic anemia combined with hemolysis. Bioengineered. 2021. Vol. 12. No. 1. PP. 6703–6712. https://doi.org/10.1080/21655979.2021.1952366
Grechko A.V., Molchanov I.V., Sergunova V.A., Kozlova E.K., Chernysh A.M. Erythrocyte membrane defects in patients with impaired brain function (pilot study). General Reanimatology. 2019. Vol. 15. No. 6. PP. 11–20. https://doi.org/10.15360/1813-9779-2019-6-11-20
Sales M.V., Tanabe E.L. et al. COVID-19 Infection Changes the Functions and Morphology of Erythrocytes: A Multidisciplinary Study. Journal of the Brazilian Chemical Society. 2023. Vol. 34. PP. 1185–1196. https://doi.org/10.21577/0103-5053.20230031
Sovetnikov T.O., Akhmetova A.I. et al. Scanning probe microscopy in assessing blood cells roughness. Bio-Medical Engineering. 2023. https://doi.org/10.1007/s10527-023-10253-3
Trukhova A.A., Akhmetova A.I., Yaminsky I.V. 3D visualization of erythrocytes by atomic force microscopy. NANOINDUSTRY. 2023. Vol. 16. No. 3–4. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2023.16.3-4.180.184
Shi H., Li A., Yin J. et al. AFM study of the cytoskeletal structures of malaria infected erythrocytes. IFMBE. 2009. Vol. 23. PP. 1965–68.
Sinitsyna O.V., Akhmetova A.I., Yaminsky I.V. Atomic force microscopy of erythrocytes: new diagnostic possibilities. Medicine and High Technologies. 2022. Vol. 1. PP. 9–12. https://doi.org/10.34219/2306-3645-2022-12-1-9-12
Научная статья
МОРФОЛОГИЯ КЛЕТОК КРОВИ ПО ДАННЫМ
АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ
А.И.Ахметова1, 2, к.ф.-м.н., ст. науч. сотр., вед. спец., ORCID: 0000-0002-5115-8030
И.В.Яминский1, 2, д.ф.-м.н., проф., ген. дир., ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Аннотация. Зондовая микроскопия позволяет исследовать морфологию, наноструктуру мембраны, механические свойства и биохимические взаимодействия клеток крови в течение времени в жидкости и на воздухе. Механические свойства, жесткость и эластичность мембраны можно количественно оценить с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ). АСМ можно применять в различных областях, начиная от оценки качества хранящейся крови в банках переливания до выяснения молекулярных механизмов окислительного повреждения и изменений, связанных с различными заболеваниями. Использование АСМ в изучении эритроцитов помогает в понимании причин нейродегенеративных заболеваний, диабета и выкидышей.
Ключевые слова: эритроциты, эхиноциты, клетки крови, дискоциты, лейкоциты, атомно-силовая микроскопия, механические свойства
Для цитирования: А.И. Ахметова, И.В. Яминский. Морфология клеток крови по данным атомно-силовой микроскопии. НАНОИНДУСТРИЯ. 2025. Т. 18. № 5. С. 266–274. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.5.266.274.
Received: 3.07.2025 | Accepted: 10.07.2025 | https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.5.266.274
Original paper
MORPHOLOGY OF BLOOD CELLS BASED ON ATOMIC FORCE MICROSCOPY DATA
A.I.Akhmetova1, 2, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Senior Researcher, Leading Specialist, ORCID: 0000-0002-5115-8030
I.V.Yaminsky1, 2, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Prof., Director General, ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Abstract. Probe microscopy allows us to study the morphology, nanostructure of the membrane, mechanical properties and biochemical interactions of blood cells over time in liquid and in air. The mechanical properties, rigidity and elasticity of the membrane can be quantified using atomic force microscopy (AFM). AFM can be used in a variety of areas: from assessing the quality of stored blood in transfusion banks to elucidating the molecular mechanisms of oxidative damage and disease-related changes. The use of AFM in the study of red blood cells helps in understanding the causes of neurodegenerative diseases, diabetes, and miscarriages.
Keywords: erythrocytes, echinocytes, blood cells, discocytes, leukocytes, atomic force microscopy, mechanical properties
For citation: A.I. Akhmetova, I.V. Yaminsky. Morphology of blood cells based on atomic force microscopy data. NANOINDUSTRY. 2025. Vol. 18. No. 5. PP. 266.274. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.5.266.274.
ВВЕДЕНИЕ
Эритроцит — клетка, состоящая из цитоплазмы и клеточной мембраны, которую можно разделить на две части: липидный бислой и цитоскелет. Цитоскелет взаимодействует с интегральными белками и липидами для сохранения целостности мембраны. Он играет важную роль в поддержании формы, обеспечении гибкости клетки и организации липидов в эритроците. Дефицит любого из белков может привести к изменению структуры цитоскелета эритроцита, что снижает общую степень эластичности мембраны. Это, в свою очередь, может привести к неспособности эритроцита изменять форму при прохождении через капилляры, вызывая микрососудистые осложнения и дисфункции в транспорте кислорода.
Изменения морфологии эритроцитов связывают со старением эритроцитов и патологическими состояниями. АСМ позволяет получать изображения поверхностей эритроцитов с высоким разрешением без необходимости сложной пробоподготовки образцов, без фиксации, в условиях, близких к естественным, например, в буферных растворах (рис.1). Это позволяет визуализировать мельчайшие структуры поверхности, включая расположение частиц нанометрового масштаба на мембране эритроцитов, с латеральным разрешением до 0,5–1 нм и вертикальным разрешением 0,1–0,2 нм (рис.2) [1].
Исследования показали, что при длительном хранении (до 35 дней при +4 °C) диаметр клеток крови снижается, а модуль Юнга мембран эритроцитов значительно увеличивается, что коррелирует с морфологическими изменениями: превращением дискоцитов в эхиноциты (рис.3) и сфероэхиноциты, которые менее пригодны для целей переливания крови [2]. Средние значения и ширина распределения модуля Юнга значительно увеличивались в образцах, взятых у пациентов с сахарным диабетом и курильщиков по сравнению с образцами, взятыми у здоровых доноров; в то же время средние значения модуля Юнга увеличиваются в зависимости от возраста пациента [3].
В работе [4] нормальное старение эритроцитов визуализировалось как трансформации формы клеток (от нормального двояковогнутого диска через различные морфологические классы до полной потери нормальной формы, то есть плотных сфероцитов). Все эти изменения сопровождались постепенным уменьшением размера и шероховатости мембраны клеток. Уменьшение диаметра было связано с изменением формы. С помощью АСМ было установлено, что диаметр двояковогнутых и зазубренных клеток был больше, чем у спикулированных и сферических эритроцитов. Увеличение популяций спикулоцитов и сфероцитов произошло значительно раньше у женщин, страдающих от выкидышей на ранней стадии (ВРС) по сравнению с контрольными группами (здоровыми женщинами и беременными). Были показаны различные пути старения эритроцитов, более быстрое возникновение морфологических изменений эритроцитов при ВРС по сравнению с обеими контрольными группами, показана разница между шероховатостью мембраны свежих эритроцитов при ВРС и эритроцитов двух контрольных групп. Значительно более высокое значение среднеквадратичной шероховатости клеток в группе ВРС обусловлено более неравномерной складчатостью мембраны и появлением некоторых выступов, вероятно, вследствие нарушения целостности плазматической мембраны и/или начала микровезикуляции. Везикуляция зрелых эритроцитов способствует удалению дефектных участков мембраны эритроцитов. Известно, что при некоторых патологических ситуациях и в процессе старения эритроцитов везикуляция плазматической мембраны усиливается [5, 6]. Высвобождение микровезикул (микрочастиц) происходит в результате перераспределения фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина с внутреннего листка на внешний листок плазматической мембраны и происходит избирательно в богатых липидами микродоменах внутри плазматической мембраны [7].
Изменение формы клеток из-за частичной или полной потери деформируемости может происходить в результате различных патологических состояний [8], накопления активных форм кислорода (АФК) или как часть процесса старения эритроцитов [9]. Снижение эластичности является признаком сокращения продолжительности жизни клеток и может быть вызвано различными факторами, связанными с окислительным стрессом, измененным составом мембраны и патологическими состояниями.
Известно, что форма эритроцитов в значительной степени определяется механическими свойствами цитоскелета и обилием аденозинтрифосфата (АТФ) [10]. АТФ важен для поддержания дисковидной формы эритроцитов, поскольку истощение АТФ вызывает изменение от дискоцита к форме эхиноцита [11]. Например, серповидные эритроциты характеризуются повышенными показателями окислительного стресса и сниженным уровнем АТФ [12]. Было показано, что у беременных женщин уровень АТФ в эритроцитах значительно ниже, чем у небеременных [13].
Повышенная жесткость мембраны характерна для эритроцитов, полученных от пациентов с нейродегенеративными заболеваниями по сравнению со здоровыми. В работе [14], используя атомно-силовую и традиционную оптическую микроскопию, провели ультраструктурный анализ эритроцитов как модели периферических клеток с характерными признаками для нейродегенеративных патологий – болезни Паркинсона (БП), бокового амиотрофического склероза (БАС) и болезни Альцгеймера (БА). Клетки крови при нейродегенеративных патологиях характеризуются уменьшенным количеством двояковогнутой дискообразной формы, меньшей шероховатостью поверхности и более высоким модулем Юнга по сравнению со здоровыми клетками. Двояковогнутая форма по-прежнему является преобладающей формой в клетках при БАС и БА, в то время как в морфологии БП доминируют зазубренные клетки.
Экспериментально установлено, что гемин и окислительные процессы в крови оказывают специфическое воздействие на наноструктуру мембран эритроцитов, образуя домены на поверхности. Характерный размер зернистых структур в доменах составляет 100–200 нм, что совпадает с характерным размером спектринового матрикса [15].
Исследование окислительных и окислительно-восстановительных процессов
АСМ эффективно применяется для изучения изменений на молекулярном уровне в эритроцитах, вызванных окислением. Окислительный стресс, вызванный ультрафиолетовым (УФ) облучением, нарушает формируемую спектрином сеть цитоскелета, лежащую в основе мембраны эритроцитов, что приводит к морфологическим изменениям и потере типичной формы дискоцитов. Размер ячеек спектриновой сети увеличивается с примерно 80–200 нм в контрольных образцах до 600–1000 нм после воздействия УФ-излучения, что указывает на структурный распад [4, 5, 16, 17]. Лечение антиоксидантами может сохранить целостность спектриновой сетки и морфологию эритроцитов, что подтверждается исследованиями АСМ.
С помощью АСМ выявили изменения морфологии лейкоцитов при лейкемии – на поверхности появились игольчатые выступы [18]. При детальном рассмотрении изображения лейкоцитов можно оценить характер расположения на подложке, напоминающий сладжи. Белые кровяные клетки у пациентов с диабетом были более жесткими, чем лейкоциты у здоровых доноров. По сравнению со здоровыми донорами диаметр лейкоцитов и модуль Юнга были значительно увеличены, хотя высота клеток уменьшилась [19].
Эритроциты и лейкоциты у пациентов с диабетом демонстрируют изменения формы, повышенную жесткость и склонность к агрегации. В этом исследовании влияния диабета на эритроциты показано, что избыток глюкозы в крови приводит к значительной деформации формы эритроцитов и легкой коррозии на их поверхности, поскольку глюкоза может проходить через мембрану и окружать ее как оболочка. Эритроциты увеличиваются в размере и склеиваются, что в конечном итоге приводят к повышению вязкости и замедлению подвижности эритроцитов [20]. В данном исследовании также сравнили влияние диабета и курения на такие параметры, как диаметр, глубина впадины и шероховатость эритроцитов. Оказалось, что курение существенно сильнее влияет на изменение всех трех параметров, чем диабет: для заядлых курильщиков шероховатость увеличивается в 5 раз, глубина впадины уменьшается в 3,3 раза, эритроциты принимают неправильную форму.
АСМ-исследование клеток крови при диабете выявило различие в морфологии: эритроциты из здоровой группы представляют собой нормоцит: круглый, с видимой впадиной; эритроциты группы с преддиабетом имеют нерегулярную форму, эритроциты удлиненные, а вогнутость находится не в центре. Изображения эритроцитов с метаболическим синдромом напоминают стоматоцит. Группа больных сахарным диабетом 2 типа имеет неправильную морфологию эритроцитов («гребневидный» эритроцит) [21].
Исследование клеток крови при талассемии показало, что эритроциты становятся зазубренными, имеют разную морфологию, анизоцитозную и гипохромную форму. Лишь немногие клетки представлены в форме двояковогнутого диска. Клетки меньше по размеру и деформированы с образованием множества больших отверстий. Эритроциты при железодефицитной анемии имеют еще более деформированную морфологию, чем при талассемии: клетки представлены в форме эллиптоцита, круглыми, овальными, и в центре эритроцитов наблюдается большее набухание [22].
С помощью АСМ было обнаружено, что эритроциты пациентов с мегалобластной анемией имели больший размер, однако их высота, средняя шероховатость, значение пик-впадина Rp-v (представляющее собой разницу между максимальной и минимальной высотой по оси Z на поверхности клетки в области анализа) и площадь поверхности были ниже по сравнению с контрольной группой [23].
У пациентов отделения анестезиологии и реанимации с черепно-мозговой травмой, ишемическим и геморрагическим инсультом, отеком головного мозга, постгипоксической энцефалопатией наблюдались различные формы клеток крови, на поверхности мембраны эритроцитов возникали локальные дефекты: дефекты пэллора, тора, наноструктуры. Ряд дефектов является стартовым механизмов развития тотальных повреждений мембран. У всех пациентов, включенных в исследование, наблюдали 16±7% активных тромбоцитов на мазке. Тромбоциты входят в число показателей острой фазы воспаления при сепсисе, опухолях и кровотечениях. Увеличение количества тромбоцитов является сигналом развития воспалительных патологий [24].
Инфекционные заболевания (малярия, COVID-19, ВИЧ)
В работе [25] обнаружили изменение в геометрии эритроцитов: увеличение на 14% в диаметре и уменьшение на 30% в высоте по сравнению с контрольной группой. С помощью АСМ выявили изменения структуры эритроцитов при COVID-19: увеличение диаметра клеток с 9 до 10,5 мкм, заметно снижение высоты впадины в центре диска, увеличение модуля Юнга с 4,5 до 8 кПа.
С помощью АСМ были зафиксированы аномальные формы эритроцитов, например, акантоциты [26]. Также были обнаружены клетки в мазке крови в форме эхиноцитов после COVID-19 [27]. При малярии паразиты изменяют мембрану эритроцитов, формируя выступы, которые способствуют адгезии к стенкам сосудов [28]. Также на поверхности были обнаружены резкие изменения сети спектрина после заражения, то есть сеть спектрина частично разрушается на определенной стадии заражения.
ВЫВОДЫ
В этом обзоре обобщены результаты недавних исследований, демонстрирующие возможности АСМ в исследовании эритроцитов и их применение в клинической практике. Эластичность мембраны эритроцита является очень важным фактором в определении состояния здоровья. Ее количественное определение имеет решающее значение для понимания механизмов, приводящих к нарушению эластичности эритроцитов. Методы АСМ можно успешно применять также для контроля терапевтических процедур.
АСМ позволяет детально исследовать форму, рельеф и наноструктуру мембран эритроцитов, выявляя изменения, связанные с различными физиологическими и патологическими состояниями, такими как интоксикация, диабет, мегалобластная анемия и другие заболевания.
АСМ дает возможность измерять ключевые морфометрические параметры эритроцитов –размеры, соотношение осей, глубину вогнутости диска, толщину и шероховатость поверхности. Эти характеристики отражают деформируемость и упругие свойства мембраны, которые важны для прохождения эритроцитов через узкие капилляры и поддержания их функциональной активности в кровотоке. Инструментарий программного обеспечения "ФемтоСкан Онлайн" позволяет получить морфологические параметры клетки в количественном виде: среднюю и среднеквадратичную шероховатость, оценить глубину впадины эритроцита, а также другие параметры [29].
Кроме того, АСМ позволяет выявлять микроскопические повреждения и дефекты мембран, которые могут возникать под воздействием токсинов, стрессовых факторов или при хранении крови. Это делает АСМ ценным инструментом для диагностики и мониторинга заболеваний, связанных с изменениями морфологии и механики эритроцитов.
АСМ облегчает обнаружение морфологических и биомеханических изменений в
эритроцитах, связанных с различными заболеваниями крови и системными заболеваниями. Изменения жесткости и эластичности мембраны служат биомаркерами патологических состояний, что дает преимущества по сравнению с традиционными биохимическими анализами, которые могут быть недостаточно чувствительными и требовать больших объемов образцов. АСМ также позволяет проводить визуализацию клеток крови in situ и in vivo, что способствует ранней диагностике и мониторингу прогрессирования заболеваний.
Таким образом, атомно-силовая микроскопия обеспечивает комплексное морфологическое и структурное исследование эритроцитов, что способствует лучшему пониманию их физиологии и патологии на нанометровом уровне.
БЛАГОДАРНОСТИ
Исследование выполнено в рамках государственного задания МГУ имени М.В.Ломоносова. ПО "ФемтоСкан Онлайн" предоставлено ООО НПП "Центр перспективных технологий", www.femtoscan.ru
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Rakshak R., Bhatt S. et al. Characterizing morphological alterations in blood related disorders through Atomic Force Microscopy. Nanotheranostics. 2024. Vol. 8. No. 3. PP. 330–343. https://doi.org/10.7150/ntno.93206
Lamzin I.M., Khayrullin R.M. The quality assessment of stored red blood cells probed using atomic-force microscopy. Anat Res Int. 2014. P. 869683. https://doi.org/10.1155/2014/869683
Lekka M., Fornal M. et al. Erythrocyte stiffness probed using atomic force microscope. Biorheology. 2005. Vol. 42. No. 4. PP. 307–317. https://doi.org/10.1177/0006355X2005042004004
Langari A., Strijkova V. et al. Morphometric and Nanomechanical Features of Erythrocytes Characteristic of Early Pregnancy Loss. International Journal of Molecular Sciences. 2022. Vol. 23. No. 9. P. 4512. https://doi.org/10.3390/ijms23094512
Kaczmarska M.; Grosicki M. et al. Temporal sequence of the human RBCs’ vesiculation observed in nano-scale with application of AFM and complementary techniques. Nanomed. Nanotechnol. Biol. Med. 2020. Vol. 28. P. 102221. https://doi.org/10.1016/j.nano.2020.102221
Li H., Lykotrafitis G. Vesiculation of healthy and defective red blood cells. Phys. Rev. E Stat. Nonlinear Soft Matter Phys. 2015. Vol. 92. P. 012715. https://doi.org/10.1103/PhysRevE.92.012715
Said A.S., Rogers S.C., Doctor A. Physiologic impact of circulating RBC microparticles upon blood-vascular interactions. Front. Physiol. 2017. Vol. 8. P. 1120. https://doi.org/10.3389/fphys.2017.01120
McMahon Timothy J. Red Blood Cell Deformability, Vasoactive Mediators, and Adhesion. Front. Physiol. 2019. Vol. 10. P. 1417. https://doi.org/10.3389/fphys.2019.01417
Barshtein G., Pajic-Lijakovic I., Gural A. Deformability of Stored Red Blood Cells. Front. Physiol. 2021. Vol. 12. P. 12. https://doi.org/10.3389/fphys.2021.722896
Gov N., Safran S.A. Red blood cell shape and fluctuations: Cytoskeleton confinement and ATP activity. J. Biol. Phys. 2005. Vol. 31. PP. 453–464. https://doi.org/10.1007/s10867-005-6472-7
Lim H.W.G., Wortis M., Mukhopadhyay R. Stomatocyte-discocyte-echinocyte sequence of the human red blood cell: Evidence for the bilayer- couple hypothesis from membrane mechanics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. Vol. 99. PP. 16766–16769. https://doi.org/10.1073/pnas.202617299
Sabina R.L., Wandersee N.J., Hillery C.A. Ca2+-CaM activation of AMP deaminase contributes to adenine nucleotide dysregulation and phosphatidylserine externalization in human sickle erythrocytes. Br. J. Haematol. 2009. Vol. 144. PP. 434–445. https://doi.org/10.1111/j.1365-2141.2008.07473.x
Marumoto Y., Kaibara M., Taniguchi I. Erythrocyte deformability and adenosine triphosphate (ATP) levels in normal pregnancy and puerperium. Nihon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi. 1984. Vol. 36. PP. 2079–2084.
Strijkova-Kenderova V., Todinova S. et al. Morphometry and Stiffness of Red Blood Cells—Signatures of Neurodegenerative Diseases and Aging. Int. J. Mol. Sci. 2022. Vol. 23. P. 227. https://doi.org/10.3390/ijms23010227
Sergunova V.A., Chernyaev A.P. et al. Nanostructure of erythrocyte membranes in blood intoxication. A study using atomic force microscopy. Almanac of Clinical Medicine. 2016. Vol. 44. PP. 234–241. https://doi.org/10.18786/2072-0505-2016-44-2-234-241
Kozlova E., Chernysh A. et al. Atomic force microscopy study of red blood cell membrane nanostructure during oxidation-reduction processes. J Mol Recognit. 2018. Vol. 31. No. 10. P. e2724. https://doi.org/10.1002/jmr.2724
P.H.J. Wilding. Causes of obesity. Pract Diabetes Int. 2001. https://doi.org/10.1002/pdi.277
Gaman A., Osiac E. et al. Surface morphology of leukemic cells from chronic myeloid leukemia under atomic force microscopy. Current health sciences journal. 2013. Vol. 39. No. 1. PP. 45–47.
Alexandrova A., Antonova N., Skorkina M.Y. et al. Evaluation of the elastic properties and topography of leukocytes’ surface in patients with type 2 diabetes mellitus using atomic force microscope. Ser. Biomech. 2017. Vol. 31. PP. 16–24.
AlSalhi S., Devanesan M. S. et al. Impact of Diabetes Mellitus on Human Erythrocytes: Atomic Force Microscopy and Spectral Investigations. Int. J. Environ. Res. Public Health. 2018. Vol. 15. P. 2368. https://doi.org/10.3390/ijerph15112368
Loyola-Leyva A., Loyola-Rodríguez J.P. et al. Application of atomic force microscopy to assess erythrocytes morphology in early stages of diabetes. A pilot study. Micron. 2021. Vol. 141. P. 102982. https://doi.org/10.1016/j.micron.2020.102982
Saira T. et al. Diagnosis of thalassemia and iron deficiency anemia using confocal and atomic force microscopy. Laser Phys. Lett. 2017. Vol. 14. P. 115703. https://doi.org/10.1088/1612-202X/aa8bca
Wu Q., Liu J. et al. Mechanism of megaloblastic anemia combined with hemolysis. Bioengineered. 2021. Vol. 12. No. 1. PP. 6703–6712. https://doi.org/10.1080/21655979.2021.1952366
Grechko A.V., Molchanov I.V., Sergunova V.A., Kozlova E.K., Chernysh A.M. Erythrocyte membrane defects in patients with impaired brain function (pilot study). General Reanimatology. 2019. Vol. 15. No. 6. PP. 11–20. https://doi.org/10.15360/1813-9779-2019-6-11-20
Sales M.V., Tanabe E.L. et al. COVID-19 Infection Changes the Functions and Morphology of Erythrocytes: A Multidisciplinary Study. Journal of the Brazilian Chemical Society. 2023. Vol. 34. PP. 1185–1196. https://doi.org/10.21577/0103-5053.20230031
Sovetnikov T.O., Akhmetova A.I. et al. Scanning probe microscopy in assessing blood cells roughness. Bio-Medical Engineering. 2023. https://doi.org/10.1007/s10527-023-10253-3
Trukhova A.A., Akhmetova A.I., Yaminsky I.V. 3D visualization of erythrocytes by atomic force microscopy. NANOINDUSTRY. 2023. Vol. 16. No. 3–4. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2023.16.3-4.180.184
Shi H., Li A., Yin J. et al. AFM study of the cytoskeletal structures of malaria infected erythrocytes. IFMBE. 2009. Vol. 23. PP. 1965–68.
Sinitsyna O.V., Akhmetova A.I., Yaminsky I.V. Atomic force microscopy of erythrocytes: new diagnostic possibilities. Medicine and High Technologies. 2022. Vol. 1. PP. 9–12. https://doi.org/10.34219/2306-3645-2022-12-1-9-12
Отзывы читателей
