eng
Выпуск #5/2025
И.В.Яминский
СКАНИРУЮЩАЯ ЗОНДОВАЯ МИКРОСКОПИЯ В ИССЛЕДОВАНИИ НЕЙРОННОЙ АКТИВНОСТИ НАСЕКОМЫХ: ПЕРСПЕКТИВЫ И МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ
СКАНИРУЮЩАЯ ЗОНДОВАЯ МИКРОСКОПИЯ В ИССЛЕДОВАНИИ НЕЙРОННОЙ АКТИВНОСТИ НАСЕКОМЫХ: ПЕРСПЕКТИВЫ И МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ
Просмотры: 1113
В статье рассматриваются возможности применения сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ) для исследования нейронной активности насекомых, включая регистрацию потенциалов действия и визуализацию морфологических особенностей нервной системы. Особое внимание уделено преимуществам использования насекомых, таких как комары, в качестве модельных объектов для нейрофизиологических исследований. Обсуждаются современные методики регистрации нейронных импульсов, включая внутриклеточную и внеклеточную запись, метод локальной фиксации потенциала (патч-кламп), а также сравнение параметров потенциала действия у насекомых и человека. Представлены перспективы интеграции СЗМ с оптогенетикой и кальциевой визуализацией для получения комплексного представления о функциональной активности нейронов in vivo.
Получено: 3.07.2025 г. | Принято: 10.07.2025 г. | https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.5.286.295
Научная статья
СКАНИРУЮЩАЯ ЗОНДОВАЯ МИКРОСКОПИЯ В ИССЛЕДОВАНИИ НЕЙРОННОЙ АКТИВНОСТИ НАСЕКОМЫХ: ПЕРСПЕКТИВЫ И МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ
И.В.Яминский1, 2, д.ф.-м.н., проф., ген. дир., ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Аннотация. В статье рассматриваются возможности применения сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ) для исследования нейронной активности насекомых, включая регистрацию потенциалов действия и визуализацию морфологических особенностей нервной системы. Особое внимание уделено преимуществам использования насекомых, таких как комары, в качестве модельных объектов для нейрофизиологических исследований. Обсуждаются современные методики регистрации нейронных импульсов, включая внутриклеточную и внеклеточную запись, метод локальной фиксации потенциала (патч-кламп), а также сравнение параметров потенциала действия у насекомых и человека. Представлены перспективы интеграции СЗМ с оптогенетикой и кальциевой визуализацией для получения комплексного представления о функциональной активности нейронов in vivo.
Ключевые слова: функционирование и активность мозга, экспериментальные исследования, потенциал действия, нейроны, атомно-силовая микроскопия, сканирующая капиллярная микроскопия
Для цитирования: И.В. Яминский. Сканирующая зондовая микроскопия в исследовании нейронной активности насекомых: перспективы и методические подходы. НАНОИНДУСТРИЯ. 2025. Т. 18. № 5. С. 286–295. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.5.286.295.
Received: 3.07.2025 | Accepted: 10.07.2025 | https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.5.286.295
Original paper
SCANNING PROBE MICROSCOPY IN THE STUDY OF INSECT NEURONAL ACTIVITY: PROSPECTS AND METHODOLOGICAL APPROACHES
I.V.Yaminsky1, 2, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Prof., Director General, ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Abstract. The paper discusses the possibilities of using scanning probe microscopy (SPM) to study the neural activity of insects, including recording action potentials and visualizing the morphological features of the nervous system. Particular attention is paid to the advantages of using insects such as mosquitoes as model objects for neurophysiological research. Modern methods of recording neural impulses are discussed, including intracellular and extracellular recording, the local potential fixation method (patch clamp), as well as a comparison of action potential parameters in insects and humans. The prospects for integrating SPM with optogenetics and calcium imaging to obtain a comprehensive understanding of the functional activity of neurons in vivo are presented.
Keywords: brain functioning and activity, experimental studies, action potential, neurons, atomic force microscopy, scanning capillary microscopy
For citation: I.V. Yaminsky. Scanning probe microscopy in the study of insect neuronal activity: prospects and methodological approaches. NANOINDUSTRY. 2025. Vol. 18. No. 5. PP. 286–295. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.5.286.295.
ВВЕДЕНИЕ
Изучение функциональной активности нервной системы является одной из важнейших задач современной нейробиологии. Развитие методов нейрофизиологии и сканирующей зондовой микроскопии открывает новые возможности для анализа электрической активности отдельных нейронов, нейронных сетей и мозга в целом. Однако исследования нейронной активности высших организмов сталкиваются с рядом ограничений, связанных как с техническими сложностями, так и с этическими аспектами. Это делает особенно привлекательным использование в экспериментальных работах класса беспозвоночных членистоногих животных – насекомых – в качестве модельных систем (рис.1).
Насекомые обладают компактной, но функционально эффективной нервной системой, что позволяет проводить эксперименты с высоким разрешением, обеспечиваемым зондовой микроскопией, и минимальными этическими ограничениями. Благодаря простоте фиксации нейронов насекомых, они являются удобным объектом для изучения механизмов генерации и передачи нервных импульсов. Особенно перспективным представляется сочетание традиционных электрофизиологических методов с возможностями сканирующей зондовой микроскопии, позволяющей получать высокоточные топографические данные без повреждения образца.
Сканирующая зондовая микроскопия позволяет получать трехмерные изображения с нанометровым разрешением, что особенно важно для исследования различных морфологических структур насекомых, например: кутикул (хитинового покрова) [1], сенсилл (чувствительных волосков), наноструктур, влияющих на гидрофобность и аэродинамику крыльев, приспособлений для адгезии лапок. Совокупность работ была проведена по изучению фасеточного глаза насекомых и его структурной единицы – омматидия методами атомно-силовой микроскопии [2].
В 2024 году были опубликованы результаты картирования мозга дрозофилы, полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии [3]. Исследователи полностью составили карту связей между нейронами всего мозга взрослой плодовой мушки. В работе была представлена полная картина структуры мозга взрослой самки Drosophila melanogaster, содержащая 5 ∙ 107 химических синапсов между 139 255 нейронами. При существенных достигнутых возможностях электронной микроскопии у нее не остается возможности работы с живыми объектами.
Единственным методом, который позволяет изучать живые объекты с нанометровым разрешением на воздухе или в жидкости, – это инструментарий сканирующей зондовой микроскопии. Однако, до настоящего времени нами не найдены экспериментальные результаты зондовой микроскопии по исследованию функциональной активности мозга живого существа.
Перед тем как мы рассмотрим подробнее возможности по проведению таких исследований насекомых на примере комара, сравним сходные черты и различия мозга человека и комара.
У человека максимальная частота нейронных импульсов – около 200–500 Гц (в некоторых сенсорных нейронах), но в среднем 10–100 Гц.
У насекомых нервные клетки часто крупнее и быстрее, чем у млекопитающих, что компенсирует их малое количество.
Общее количество сигналов в мозгу насекомого можно оценить следующим образом.
Если учесть, что у комара около 200 000–400 000 нейронов (для сравнения: у мухи – ~200 000, у пчелы – ~1 млн), и каждый может генерировать десятки импульсов в секунду, то общее количество нервных сигналов в его мозгу может достигать миллионов в секунду.
Нервная система насекомых оптимизирована для быстрой реакции, и, хотя их мозг мал, он обрабатывает информацию очень эффективно. В среднем: отдельный нейрон – 50–200 импульсов/с. Весь мозг – миллионы сигналов в секунду.
Чем нервные импульсы мозга комара отличаются от нервных импульсов человека? Нервные импульсы (потенциалы действия) у комаров и людей работают на схожих биофизических принципах, но есть ключевые различия в скорости, организации и функциональности.
Основные отличия:
Организация нервной системы
У комаров.
Децентрализованная система – мозг (надглоточный ганглий) + брюшная нервная цепочка с ганглиями. Мозг комара состоит из нескольких отделов:
У насекомых меньше нейронов (~200 000–400 000), но проявляется высокая эффективность в простых реакциях (поиск жертвы, избегание угроз).
У человека.
Централизованный мозг (86 млрд нейронов) с иерархической структурой (кора, подкорковые ядра и т. д.). Сложные когнитивные функции (память, обучение, абстрактное мышление).
Типы нейронов и синаптическая передача
Комары. Нейромедиаторы: ацетилхолин, глутамат, ГАМК (как у человека, но рецепторы могут отличаться). Меньше синаптической пластичности – обучение ограничено (например, комары могут запоминать опасные запахи, но не сложные ассоциации).
Человек. Более сложные нейромедиаторные системы (дофамин, серотонин, норадреналин – регулируют эмоции, мотивацию). Высокая синаптическая пластичность – формирование долговременной памяти, сложные нейросети.
Энергоэффективность
Комары. Нервная система потребляет минимальную энергию, так как оптимизирована для выживания. Быстрая реакция на ключевые стимулы (CO2, тепло, запах крови).
Человек. Мозг потребляет ~20% энергии тела, так как поддерживает сложные вычисления.
Чувствительность к нейротоксинам
Комары. Их нейроны более устойчивы к некоторым ядам (например, никотину), но чувствительны к инсектицидам (пиретроиды блокируют натриевые каналы).
Человек. Нейроны более уязвимы к нейротоксинам (ртуть, свинец, ботулотоксин).
ОБСУЖДЕНИЕ
Нервные импульсы комара и человека похожи на клеточном уровне, но различаются скоростью, организацией и сложностью обработки информации. Комары – быстрые, энергоэффективные, но примитивные реакции. Человек – медленнее в отдельных нейронах, но зато обладает сложным мышлением и адаптивным поведением.
Если говорить кратко: комар – это "микрокомпьютер" для поиска крови, а человек – "суперкомпьютер" с развитым интеллектом.
Чем нервные импульсы мозга комара отличаются от нервных импульсов человека? Нервные импульсы (потенциалы действия) у комаров и людей работают на схожих биофизических принципах, но есть ключевые различия в скорости, организации и функциональности.
Основные отличия – потенциал действия (ПД) у комаров и людей основан на одних и тех же фундаментальных принципах (изменение ионной проницаемости мембраны нейрона), но есть ключевые различия в параметрах (детальное сравнение показано в табл.).1
Ключевые различия:
Ионные каналы.
Комары. Натриевые (Na⁺) и калиевые (K⁺) каналы менее селективные, чем у млекопитающих. Некоторые каналы устойчивы к тетродотоксину (ТТХ), который блокирует ПД у позвоночных.
Человек. Каналы более специализированы (например, быстрые Naᵥ1.1–Naᵥ1.9). Чувствительны к ТТХ и другим нейротоксинам.
Скорость прохождения потенциала действия.
Комары. Нет миелинизации → скорость 1–5 м/с (у толстых аксонов, например, в гигантских нейронах тараканов – до 10 м/с).
Человек. Миелинизированные волокна → до 120 м/с (например, двигательные нейроны).
Энергозатраты.
Комары. ПД требует меньше энергии (АТФ), так как ионные градиенты восстанавливаются медленнее.
Человек. На поддержание Na⁺/K⁺-АТФазы тратится до 60% энергии нейрона.
Температурная зависимость.
Комары. ПД возможен при более низких температурах (некоторые насекомые активны при +5 °C).
Человек. При охлаждении ниже +20 °C проведение импульса нарушается.
Чем обусловлены эти различия? У насекомых в результате эволюционной адаптации ПД оптимизирован для минимизации энергии при небольшом размере тела. У человека – для скорости и точности в сложной нервной системе
Размер нейронов.
Аксоны комара короче, следовательно, не нужна миелинизация. Отметим, что у некоторых насекомых (например, кузнечиков) есть гигантские аксоны (до 50 мкм в диаметре), проводящие сигналы со скоростью до 25 м/с – рекорд среди беспозвоночных!
Можно сделать следующие выводы.
Потенциал действия у комара и человека похож по механизму, но отличается у комара:
Эти особенности отражают общий принцип: нервная система насекомых жертвует "точностью" ради энергоэффективности и компактности.
МЕТОДЫ РЕГИСТРАЦИИ
Как экспериментально регистрировать потенциал нервного импульса мозга комара? Экспериментальная регистрация потенциалов действия (ПД) в нервной системе комара – сложная задача из-за малых размеров нейронов (диаметр часто менее 5 мкм). Однако современные нейрофизиологические методы позволяют это сделать.
Основные подходы:
Внутриклеточная запись (Intracellular recording)
Как работает? Используется стеклянный микроэлектрод (диаметр кончика <1 мкм), заполненный электролитом (KCl), который вводится прямо в нейрон.
Измеряет изменения мембранного потенциала с высокой точностью (до 0,1 мВ).
Применение к комару: подходит для крупных нейронов (например, в брюшной нервной цепочке или зрительных ганглиях).
Сложности: нейроны комара легко повреждаются.
Требует фиксации насекомого (часто с помощью воска или специального клея).
Внеклеточная запись (Extracellular recording)
Как работает? Электрод размещается рядом с нейроном или аксоном, регистрируя внеклеточные токи.
Методы: сукцинилхолин-электроды – для записи активности антеннальных нервов.
Микроконтактные массивы – для одновременной записи с нескольких нейронов.
Примеры: регистрация реакции обонятельных нейронов на CO2 и запахи крови.
Изучение активности нейронов в ганглиях брюшной нервной цепочки.
Преимущества: менее инвазивный метод. Позволяет долгосрочные записи.
Патч-кламп (Patch-clamp)
Как работает? Микроэлектрод плотно присасывается к мембране нейрона, фиксируя ионные токи через отдельные каналы.
Варианты: Cell-attached – запись без повреждения клетки. Whole-cell – полный доступ к внутриклеточной среде.
Применение: исследование свойств натриевых и калиевых каналов в нейронах комара.
Пример: изучение устойчивости к инсектицидам (например, к пиретроидам).
Ограничения: требует выделения отдельных нейронов (например, из культивируемых клеток мозга личинки).
Оптогенетика и кальциевая визуализация
Как работает? Кальциевые красители (например, GCaMP) – флуоресцируют при связывании с Ca²⁺, который поступает в нейрон при ПД.
Оптогенетика – введение светочувствительных ионных каналов (Channelrhodopsin) для активации нейронов светом. Примеры: визуализация активности обонятельных нейронов в реальном времени. Контроль двигательных нейронов крыльев у генетически модифицированных комаров. Плюсы: не требует механического контакта с нейроном. Позволяет изучать нейросети.
Сканирующая зондовая микроскопия
Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) представляет собой уникальный инструмент для исследования структуры и функциональной активности биологических объектов на наноуровне. В отличие от электронной микроскопии, позволяющей получать изображения с высоким разрешением, но требующей жестких условий (вакуум, металлизация), СЗМ работает в условиях окружающей среды – на воздухе или в жидкости – что делает ее особенно полезной при работе с живыми образцами.
Одним из наиболее известных представителей СЗМ является атомно-силовая микроскопия (АСМ). Она позволяет не только получать трехмерные изображения поверхности клеток и тканей с нанометровым разрешением, но и регистрировать механические свойства поверхности, такие как жесткость, адгезия и вязкоупругость. Эти параметры могут быть связаны с изменением состояния мембраны нейрона во время потенциала действия.
Возможности СЗМ:
Подготовка образца для сканирующей зондовой микроскопии:
Иммобилизация насекомого: охлаждение или CO2-наркоз. Фиксация в специальном держателе (например, восковой подложке).
Доступ к нервной системе: для записи с мозга – вскрытие головной капсулы. Для периферических нейронов – обнажение нервов (например, антеннального).
Пример эксперимента (регистрация ПД в антеннальном нерве).
Фиксируют комара, вскрывают антеннальный сегмент. Подводят внеклеточный электрод к нерву. Подают стимул (запах крови или тепло). Записывают всплески активности.
Такие методы помогают изучать как комары находят жертву по запаху и почему инсектициды перестают действовать, а также как работает "мозг" насекомых.
С помощью сканирующей зондовой микроскопии можно начать с внеклеточной записи – это самый простой способ "услышать" нервные импульсы комара! При измерении потенциала действия одним электродом (зондом атомно-силового микроскопа) касаются нейрона, а где располагают второй электрод? При регистрации потенциала действия (ПД) второй электрод играет критическую роль – он служит референсным (земляным) электродом и замыкает электрическую цепь. Размещается вне клетки, но вблизи нейрона (например, в гемолимфе насекомого или физиологическом растворе). Часто используется хлорированный серебряный провод (Ag/AgCl) для минимизации помех. Важно: оба электрода должны находиться в одной ионной среде, чтобы избежать диффузионных потенциалов.
Контрольные эксперименты. Чтобы исключить артефакты проверяют, что сигнал исчезает при удалении активного электрода от нейрона, затем убеждаются, что референсный электрод не создает шумов (например, используя электроды с низким импедансом).
Почему это важно? Без референсного электрода невозможно измерить разность потенциалов – цепь останется разомкнутой. Неправильное размещение референса добавляет шум (например, из-за разницы ионных составов сред). Аналог – как в вольтметре – один щуп подключают к точке измерения, второй к потенциалу "земли".
Правильный выбор референсного электрода – ключ к четкой регистрации ПД у микроскопических нейронов комара!
Для поддержания жизнеспособности клеток и тканей насекомых вне организма используют модифицированный раствор Рингера, адаптированный к их гемолимфе. Примерный состав (в mM):
Использование раствора Рингера необходимо для сканирующей капиллярной микроскопии, когда визуализация поверхности проводится в электролите, проводящем электрический ток.
Наблюдение глаза Drosophila с помощью сканирующей капиллярной микроскопии провели в группе Ю.Корчева [4]. Показано, что капиллярная микроскопия позволяет получать топографические данные без повреждения образца, но с меньшим разрешением, чем электронная микроскопия. Электронная микроскопия дает более четкие изображения наноструктур (например, омматидиев глаза), но требует вакуума и металлизации.
Капиллярная микроскопия лучше подходит для динамических исследований живых клеток. Существенно, что сканирующая капиллярная микроскопия позволяет получать трехмерные изображения нейронов и карты распределения локальной жесткости их мембраны. Дополнительно с помощью капиллярного микроскопа можно проводить упомянутые выше патч-кламп, внеклеточную и внутреклеточную записи нервных сигналов.
ВЫВОДЫ
На основании представленных данных можно отметить существенные методологические преимущества нейрофизиологических исследований с использованием насекомых.
В частности, это высокая их доступность и компактность размеров, что важно для сканирующей зондовой микроскопии. Насекомых можно вводит в неподвижное состояние – анабиоз – за счет снижения температуры или увеличения концентрации углекислого газа. Это также существенно упрощает проведение эксперимента. Процентное соотношение количества нейронов и остальных клеток у насекомых значительно выше, чем у человека, что дает определенные преимущества при исследованиях с помощью атомно-силовой микроскопии. В отличие о других методов – патч-клампа, оптогенетики, электронной микроскопии – в зондовой микроскопии появляется возможность визуализации мозга насекомого в 3D с нанометровым разрешением в естественной среде. Таким образом, комбинирование электрофизиологических методов с возможностями сканирующей зондовой микроскопии позволяет:
Эти исследования имеют не только фундаментальное значение, но и практическое применение – от получения новых знаний до разработки нейроинтерфейсов на основе биологических систем.
БЛАГОДАРНОСТИ
Исследование проведено в основном инициативным образом. Частично исследование выполнено в рамках государственного задания МГУ имени М.В.Ломоносова. Оборудование зондовой микроскопии серии "ФемтоСкан" и программное обеспечение "ФемтоСкан Онлайн" предоставлено ООО НПП "Центр перспективных технологий", www.femtoscan.ru.
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Yang R., Zaheri A., Gao W., Hayashi C., Espinosa H.D. AFM Identification of Beetle Exocuticle: Bouligand Structure and Nanofiber Anisotropic Elastic Properties. Adv. Funct. Mater. 2017. Vol. 27. P. 1603993. https://doi.org/10.1002/adfm.201603993
Stavenga D.G., Foletti S., Palasantzas G., Arikawa K. Light on the moth-eye corneal nipple array of butterflies. Proc. R. Soc. B. 2006. PP. 273661–273667. https://doi.org/10.1098/rspb.2005.3369
Dorkenwald S., Matsliah A., Sterling A.R. et al. Neuronal wiring diagram of an adult brain. Nature. 2024. Vol. 634. PP. 124–138. https://doi.org/10.1038/s41586-024-07558-y
Novak P., Li C., Shevchuk A. et al. Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy. Nat Methods. 2009. Vol. 6. PP. 279–281. https://doi.org/10.1038/nmeth.1306
Научная статья
СКАНИРУЮЩАЯ ЗОНДОВАЯ МИКРОСКОПИЯ В ИССЛЕДОВАНИИ НЕЙРОННОЙ АКТИВНОСТИ НАСЕКОМЫХ: ПЕРСПЕКТИВЫ И МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ
И.В.Яминский1, 2, д.ф.-м.н., проф., ген. дир., ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Аннотация. В статье рассматриваются возможности применения сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ) для исследования нейронной активности насекомых, включая регистрацию потенциалов действия и визуализацию морфологических особенностей нервной системы. Особое внимание уделено преимуществам использования насекомых, таких как комары, в качестве модельных объектов для нейрофизиологических исследований. Обсуждаются современные методики регистрации нейронных импульсов, включая внутриклеточную и внеклеточную запись, метод локальной фиксации потенциала (патч-кламп), а также сравнение параметров потенциала действия у насекомых и человека. Представлены перспективы интеграции СЗМ с оптогенетикой и кальциевой визуализацией для получения комплексного представления о функциональной активности нейронов in vivo.
Ключевые слова: функционирование и активность мозга, экспериментальные исследования, потенциал действия, нейроны, атомно-силовая микроскопия, сканирующая капиллярная микроскопия
Для цитирования: И.В. Яминский. Сканирующая зондовая микроскопия в исследовании нейронной активности насекомых: перспективы и методические подходы. НАНОИНДУСТРИЯ. 2025. Т. 18. № 5. С. 286–295. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.5.286.295.
Received: 3.07.2025 | Accepted: 10.07.2025 | https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.5.286.295
Original paper
SCANNING PROBE MICROSCOPY IN THE STUDY OF INSECT NEURONAL ACTIVITY: PROSPECTS AND METHODOLOGICAL APPROACHES
I.V.Yaminsky1, 2, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Prof., Director General, ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Abstract. The paper discusses the possibilities of using scanning probe microscopy (SPM) to study the neural activity of insects, including recording action potentials and visualizing the morphological features of the nervous system. Particular attention is paid to the advantages of using insects such as mosquitoes as model objects for neurophysiological research. Modern methods of recording neural impulses are discussed, including intracellular and extracellular recording, the local potential fixation method (patch clamp), as well as a comparison of action potential parameters in insects and humans. The prospects for integrating SPM with optogenetics and calcium imaging to obtain a comprehensive understanding of the functional activity of neurons in vivo are presented.
Keywords: brain functioning and activity, experimental studies, action potential, neurons, atomic force microscopy, scanning capillary microscopy
For citation: I.V. Yaminsky. Scanning probe microscopy in the study of insect neuronal activity: prospects and methodological approaches. NANOINDUSTRY. 2025. Vol. 18. No. 5. PP. 286–295. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.5.286.295.
ВВЕДЕНИЕ
Изучение функциональной активности нервной системы является одной из важнейших задач современной нейробиологии. Развитие методов нейрофизиологии и сканирующей зондовой микроскопии открывает новые возможности для анализа электрической активности отдельных нейронов, нейронных сетей и мозга в целом. Однако исследования нейронной активности высших организмов сталкиваются с рядом ограничений, связанных как с техническими сложностями, так и с этическими аспектами. Это делает особенно привлекательным использование в экспериментальных работах класса беспозвоночных членистоногих животных – насекомых – в качестве модельных систем (рис.1).
Насекомые обладают компактной, но функционально эффективной нервной системой, что позволяет проводить эксперименты с высоким разрешением, обеспечиваемым зондовой микроскопией, и минимальными этическими ограничениями. Благодаря простоте фиксации нейронов насекомых, они являются удобным объектом для изучения механизмов генерации и передачи нервных импульсов. Особенно перспективным представляется сочетание традиционных электрофизиологических методов с возможностями сканирующей зондовой микроскопии, позволяющей получать высокоточные топографические данные без повреждения образца.
Сканирующая зондовая микроскопия позволяет получать трехмерные изображения с нанометровым разрешением, что особенно важно для исследования различных морфологических структур насекомых, например: кутикул (хитинового покрова) [1], сенсилл (чувствительных волосков), наноструктур, влияющих на гидрофобность и аэродинамику крыльев, приспособлений для адгезии лапок. Совокупность работ была проведена по изучению фасеточного глаза насекомых и его структурной единицы – омматидия методами атомно-силовой микроскопии [2].
В 2024 году были опубликованы результаты картирования мозга дрозофилы, полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии [3]. Исследователи полностью составили карту связей между нейронами всего мозга взрослой плодовой мушки. В работе была представлена полная картина структуры мозга взрослой самки Drosophila melanogaster, содержащая 5 ∙ 107 химических синапсов между 139 255 нейронами. При существенных достигнутых возможностях электронной микроскопии у нее не остается возможности работы с живыми объектами.
Единственным методом, который позволяет изучать живые объекты с нанометровым разрешением на воздухе или в жидкости, – это инструментарий сканирующей зондовой микроскопии. Однако, до настоящего времени нами не найдены экспериментальные результаты зондовой микроскопии по исследованию функциональной активности мозга живого существа.
Перед тем как мы рассмотрим подробнее возможности по проведению таких исследований насекомых на примере комара, сравним сходные черты и различия мозга человека и комара.
У человека максимальная частота нейронных импульсов – около 200–500 Гц (в некоторых сенсорных нейронах), но в среднем 10–100 Гц.
У насекомых нервные клетки часто крупнее и быстрее, чем у млекопитающих, что компенсирует их малое количество.
Общее количество сигналов в мозгу насекомого можно оценить следующим образом.
Если учесть, что у комара около 200 000–400 000 нейронов (для сравнения: у мухи – ~200 000, у пчелы – ~1 млн), и каждый может генерировать десятки импульсов в секунду, то общее количество нервных сигналов в его мозгу может достигать миллионов в секунду.
Нервная система насекомых оптимизирована для быстрой реакции, и, хотя их мозг мал, он обрабатывает информацию очень эффективно. В среднем: отдельный нейрон – 50–200 импульсов/с. Весь мозг – миллионы сигналов в секунду.
Чем нервные импульсы мозга комара отличаются от нервных импульсов человека? Нервные импульсы (потенциалы действия) у комаров и людей работают на схожих биофизических принципах, но есть ключевые различия в скорости, организации и функциональности.
Основные отличия:
- скорость передачи импульсов у комаров и насекомых медленнее;
- у беспозвоночных нет миелинизированных волокон (как у позвоночных), поэтому скорость передачи составляет ~1–5 м/с (у толстых аксонов). Частота импульсов в отдельных нейронах – до 200–500 Гц (в сенсорных при пиковой активности);
Организация нервной системы
У комаров.
Децентрализованная система – мозг (надглоточный ганглий) + брюшная нервная цепочка с ганглиями. Мозг комара состоит из нескольких отделов:
- протоцеребрум – отвечает за обработку зрительной информации (поступающей от фасеточных глаз) и сложные поведенческие реакции;
- дейтоцеребрум – обрабатывает сигналы от антенн (органы обоняния, осязания и терморецепции);
- тритоцеребрум – связан с подглоточным ганглием и управляет ротовыми аппаратами.
У насекомых меньше нейронов (~200 000–400 000), но проявляется высокая эффективность в простых реакциях (поиск жертвы, избегание угроз).
У человека.
Централизованный мозг (86 млрд нейронов) с иерархической структурой (кора, подкорковые ядра и т. д.). Сложные когнитивные функции (память, обучение, абстрактное мышление).
Типы нейронов и синаптическая передача
Комары. Нейромедиаторы: ацетилхолин, глутамат, ГАМК (как у человека, но рецепторы могут отличаться). Меньше синаптической пластичности – обучение ограничено (например, комары могут запоминать опасные запахи, но не сложные ассоциации).
Человек. Более сложные нейромедиаторные системы (дофамин, серотонин, норадреналин – регулируют эмоции, мотивацию). Высокая синаптическая пластичность – формирование долговременной памяти, сложные нейросети.
Энергоэффективность
Комары. Нервная система потребляет минимальную энергию, так как оптимизирована для выживания. Быстрая реакция на ключевые стимулы (CO2, тепло, запах крови).
Человек. Мозг потребляет ~20% энергии тела, так как поддерживает сложные вычисления.
Чувствительность к нейротоксинам
Комары. Их нейроны более устойчивы к некоторым ядам (например, никотину), но чувствительны к инсектицидам (пиретроиды блокируют натриевые каналы).
Человек. Нейроны более уязвимы к нейротоксинам (ртуть, свинец, ботулотоксин).
ОБСУЖДЕНИЕ
Нервные импульсы комара и человека похожи на клеточном уровне, но различаются скоростью, организацией и сложностью обработки информации. Комары – быстрые, энергоэффективные, но примитивные реакции. Человек – медленнее в отдельных нейронах, но зато обладает сложным мышлением и адаптивным поведением.
Если говорить кратко: комар – это "микрокомпьютер" для поиска крови, а человек – "суперкомпьютер" с развитым интеллектом.
Чем нервные импульсы мозга комара отличаются от нервных импульсов человека? Нервные импульсы (потенциалы действия) у комаров и людей работают на схожих биофизических принципах, но есть ключевые различия в скорости, организации и функциональности.
Основные отличия – потенциал действия (ПД) у комаров и людей основан на одних и тех же фундаментальных принципах (изменение ионной проницаемости мембраны нейрона), но есть ключевые различия в параметрах (детальное сравнение показано в табл.).1
Ключевые различия:
Ионные каналы.
Комары. Натриевые (Na⁺) и калиевые (K⁺) каналы менее селективные, чем у млекопитающих. Некоторые каналы устойчивы к тетродотоксину (ТТХ), который блокирует ПД у позвоночных.
Человек. Каналы более специализированы (например, быстрые Naᵥ1.1–Naᵥ1.9). Чувствительны к ТТХ и другим нейротоксинам.
Скорость прохождения потенциала действия.
Комары. Нет миелинизации → скорость 1–5 м/с (у толстых аксонов, например, в гигантских нейронах тараканов – до 10 м/с).
Человек. Миелинизированные волокна → до 120 м/с (например, двигательные нейроны).
Энергозатраты.
Комары. ПД требует меньше энергии (АТФ), так как ионные градиенты восстанавливаются медленнее.
Человек. На поддержание Na⁺/K⁺-АТФазы тратится до 60% энергии нейрона.
Температурная зависимость.
Комары. ПД возможен при более низких температурах (некоторые насекомые активны при +5 °C).
Человек. При охлаждении ниже +20 °C проведение импульса нарушается.
Чем обусловлены эти различия? У насекомых в результате эволюционной адаптации ПД оптимизирован для минимизации энергии при небольшом размере тела. У человека – для скорости и точности в сложной нервной системе
Размер нейронов.
Аксоны комара короче, следовательно, не нужна миелинизация. Отметим, что у некоторых насекомых (например, кузнечиков) есть гигантские аксоны (до 50 мкм в диаметре), проводящие сигналы со скоростью до 25 м/с – рекорд среди беспозвоночных!
Можно сделать следующие выводы.
Потенциал действия у комара и человека похож по механизму, но отличается у комара:
- меньшей амплитудой (на 10–20 мВ);
- более длительным ПД (в 1,5–2 раза);
- устойчивостью к токсинам (например, ТТХ);
- медленной проводимостью из-за отсутствия миелина.
Эти особенности отражают общий принцип: нервная система насекомых жертвует "точностью" ради энергоэффективности и компактности.
МЕТОДЫ РЕГИСТРАЦИИ
Как экспериментально регистрировать потенциал нервного импульса мозга комара? Экспериментальная регистрация потенциалов действия (ПД) в нервной системе комара – сложная задача из-за малых размеров нейронов (диаметр часто менее 5 мкм). Однако современные нейрофизиологические методы позволяют это сделать.
Основные подходы:
Внутриклеточная запись (Intracellular recording)
Как работает? Используется стеклянный микроэлектрод (диаметр кончика <1 мкм), заполненный электролитом (KCl), который вводится прямо в нейрон.
Измеряет изменения мембранного потенциала с высокой точностью (до 0,1 мВ).
Применение к комару: подходит для крупных нейронов (например, в брюшной нервной цепочке или зрительных ганглиях).
Сложности: нейроны комара легко повреждаются.
Требует фиксации насекомого (часто с помощью воска или специального клея).
Внеклеточная запись (Extracellular recording)
Как работает? Электрод размещается рядом с нейроном или аксоном, регистрируя внеклеточные токи.
Методы: сукцинилхолин-электроды – для записи активности антеннальных нервов.
Микроконтактные массивы – для одновременной записи с нескольких нейронов.
Примеры: регистрация реакции обонятельных нейронов на CO2 и запахи крови.
Изучение активности нейронов в ганглиях брюшной нервной цепочки.
Преимущества: менее инвазивный метод. Позволяет долгосрочные записи.
Патч-кламп (Patch-clamp)
Как работает? Микроэлектрод плотно присасывается к мембране нейрона, фиксируя ионные токи через отдельные каналы.
Варианты: Cell-attached – запись без повреждения клетки. Whole-cell – полный доступ к внутриклеточной среде.
Применение: исследование свойств натриевых и калиевых каналов в нейронах комара.
Пример: изучение устойчивости к инсектицидам (например, к пиретроидам).
Ограничения: требует выделения отдельных нейронов (например, из культивируемых клеток мозга личинки).
Оптогенетика и кальциевая визуализация
Как работает? Кальциевые красители (например, GCaMP) – флуоресцируют при связывании с Ca²⁺, который поступает в нейрон при ПД.
Оптогенетика – введение светочувствительных ионных каналов (Channelrhodopsin) для активации нейронов светом. Примеры: визуализация активности обонятельных нейронов в реальном времени. Контроль двигательных нейронов крыльев у генетически модифицированных комаров. Плюсы: не требует механического контакта с нейроном. Позволяет изучать нейросети.
Сканирующая зондовая микроскопия
Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) представляет собой уникальный инструмент для исследования структуры и функциональной активности биологических объектов на наноуровне. В отличие от электронной микроскопии, позволяющей получать изображения с высоким разрешением, но требующей жестких условий (вакуум, металлизация), СЗМ работает в условиях окружающей среды – на воздухе или в жидкости – что делает ее особенно полезной при работе с живыми образцами.
Одним из наиболее известных представителей СЗМ является атомно-силовая микроскопия (АСМ). Она позволяет не только получать трехмерные изображения поверхности клеток и тканей с нанометровым разрешением, но и регистрировать механические свойства поверхности, такие как жесткость, адгезия и вязкоупругость. Эти параметры могут быть связаны с изменением состояния мембраны нейрона во время потенциала действия.
Возможности СЗМ:
- получение топографических карт нейронов и аксонов;
- изучение морфологических изменений при возбуждении нейрона;
- регистрация локальных механических колебаний, связанных с генерацией импульсов;
- комбинирование с оптическими методами (например, флуоресцентной микроскопией);
- исследование динамических процессов в реальном времени.
Подготовка образца для сканирующей зондовой микроскопии:
Иммобилизация насекомого: охлаждение или CO2-наркоз. Фиксация в специальном держателе (например, восковой подложке).
Доступ к нервной системе: для записи с мозга – вскрытие головной капсулы. Для периферических нейронов – обнажение нервов (например, антеннального).
Пример эксперимента (регистрация ПД в антеннальном нерве).
Фиксируют комара, вскрывают антеннальный сегмент. Подводят внеклеточный электрод к нерву. Подают стимул (запах крови или тепло). Записывают всплески активности.
Такие методы помогают изучать как комары находят жертву по запаху и почему инсектициды перестают действовать, а также как работает "мозг" насекомых.
С помощью сканирующей зондовой микроскопии можно начать с внеклеточной записи – это самый простой способ "услышать" нервные импульсы комара! При измерении потенциала действия одним электродом (зондом атомно-силового микроскопа) касаются нейрона, а где располагают второй электрод? При регистрации потенциала действия (ПД) второй электрод играет критическую роль – он служит референсным (земляным) электродом и замыкает электрическую цепь. Размещается вне клетки, но вблизи нейрона (например, в гемолимфе насекомого или физиологическом растворе). Часто используется хлорированный серебряный провод (Ag/AgCl) для минимизации помех. Важно: оба электрода должны находиться в одной ионной среде, чтобы избежать диффузионных потенциалов.
Контрольные эксперименты. Чтобы исключить артефакты проверяют, что сигнал исчезает при удалении активного электрода от нейрона, затем убеждаются, что референсный электрод не создает шумов (например, используя электроды с низким импедансом).
Почему это важно? Без референсного электрода невозможно измерить разность потенциалов – цепь останется разомкнутой. Неправильное размещение референса добавляет шум (например, из-за разницы ионных составов сред). Аналог – как в вольтметре – один щуп подключают к точке измерения, второй к потенциалу "земли".
Правильный выбор референсного электрода – ключ к четкой регистрации ПД у микроскопических нейронов комара!
Для поддержания жизнеспособности клеток и тканей насекомых вне организма используют модифицированный раствор Рингера, адаптированный к их гемолимфе. Примерный состав (в mM):
- NaCl – 120–150 (основной осмотический компонент);
- KCl – 3–5 (поддержание мембранного потенциала);
- CaCl2 – 1–2 (для стабилизации мембран и синаптической передачи);
- MgCl2 – 1–4 (кофактор ферментов);
- Глюкоза – 5–10 (источник энергии);
Использование раствора Рингера необходимо для сканирующей капиллярной микроскопии, когда визуализация поверхности проводится в электролите, проводящем электрический ток.
Наблюдение глаза Drosophila с помощью сканирующей капиллярной микроскопии провели в группе Ю.Корчева [4]. Показано, что капиллярная микроскопия позволяет получать топографические данные без повреждения образца, но с меньшим разрешением, чем электронная микроскопия. Электронная микроскопия дает более четкие изображения наноструктур (например, омматидиев глаза), но требует вакуума и металлизации.
Капиллярная микроскопия лучше подходит для динамических исследований живых клеток. Существенно, что сканирующая капиллярная микроскопия позволяет получать трехмерные изображения нейронов и карты распределения локальной жесткости их мембраны. Дополнительно с помощью капиллярного микроскопа можно проводить упомянутые выше патч-кламп, внеклеточную и внутреклеточную записи нервных сигналов.
ВЫВОДЫ
На основании представленных данных можно отметить существенные методологические преимущества нейрофизиологических исследований с использованием насекомых.
В частности, это высокая их доступность и компактность размеров, что важно для сканирующей зондовой микроскопии. Насекомых можно вводит в неподвижное состояние – анабиоз – за счет снижения температуры или увеличения концентрации углекислого газа. Это также существенно упрощает проведение эксперимента. Процентное соотношение количества нейронов и остальных клеток у насекомых значительно выше, чем у человека, что дает определенные преимущества при исследованиях с помощью атомно-силовой микроскопии. В отличие о других методов – патч-клампа, оптогенетики, электронной микроскопии – в зондовой микроскопии появляется возможность визуализации мозга насекомого в 3D с нанометровым разрешением в естественной среде. Таким образом, комбинирование электрофизиологических методов с возможностями сканирующей зондовой микроскопии позволяет:
- получать информацию о структуре и функции нейронов;
- исследовать динамику потенциалов действия;
- изучать влияние внешних факторов на прохождение нервных импульсов (температура, химические вещества, инсектициды);
- разрабатывать новые подходы к управлению популяциями насекомых и созданию биосенсоров.
Эти исследования имеют не только фундаментальное значение, но и практическое применение – от получения новых знаний до разработки нейроинтерфейсов на основе биологических систем.
БЛАГОДАРНОСТИ
Исследование проведено в основном инициативным образом. Частично исследование выполнено в рамках государственного задания МГУ имени М.В.Ломоносова. Оборудование зондовой микроскопии серии "ФемтоСкан" и программное обеспечение "ФемтоСкан Онлайн" предоставлено ООО НПП "Центр перспективных технологий", www.femtoscan.ru.
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Yang R., Zaheri A., Gao W., Hayashi C., Espinosa H.D. AFM Identification of Beetle Exocuticle: Bouligand Structure and Nanofiber Anisotropic Elastic Properties. Adv. Funct. Mater. 2017. Vol. 27. P. 1603993. https://doi.org/10.1002/adfm.201603993
Stavenga D.G., Foletti S., Palasantzas G., Arikawa K. Light on the moth-eye corneal nipple array of butterflies. Proc. R. Soc. B. 2006. PP. 273661–273667. https://doi.org/10.1098/rspb.2005.3369
Dorkenwald S., Matsliah A., Sterling A.R. et al. Neuronal wiring diagram of an adult brain. Nature. 2024. Vol. 634. PP. 124–138. https://doi.org/10.1038/s41586-024-07558-y
Novak P., Li C., Shevchuk A. et al. Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy. Nat Methods. 2009. Vol. 6. PP. 279–281. https://doi.org/10.1038/nmeth.1306
Отзывы читателей
