eng
Выпуск #2/2015
Е.Макарова, Д.Багров, П.Горелкин, А.Ерофеев, И.Яминский
Наблюдения эритроцитов с помощью атомно-силовой и сканирующей ион-проводящей микроскопии
Наблюдения эритроцитов с помощью атомно-силовой и сканирующей ион-проводящей микроскопии
Просмотры: 5168
В обзоре обсуждаются современные методики изучения поверхности эритроцитов методом АСМ. Приводятся результаты визуализации клеток с использованием сканирующего зондового микроскопа. Рассказывается об инновационном методе сканирующей ион-проводящей микроскопии с использованием стеклянных нанопипеток и приводятся результаты визуализации клеток.
DOI:10.22184/1993-8578.2015.56.2.42.48
DOI:10.22184/1993-8578.2015.56.2.42.48
Теги: atomic force microscopy scanning ion-conductive microscopy атомно-силовая микроскопия сканирующая ион-проводящая микроскопия
Около половины всего объема крови взрослого человека приходится на эритроциты. Сложно переоценить роль этих красных клеток, ведь в их составе содержится гемоглобин – белок, ответственный за транспорт кислорода и углекислого газа во всем организме. Отличие формы эритроцитов от нормальной является индикатором патогенного процесса. Определение формы клетки, ее шероховатости в нативном состоянии в жидкой среде на ранних стадиях заболеваний может позволить быстро и верно установить диагноз больного и назначить правильное лечение.
Атомно-силовая микроскопия (АСМ) отлично зарекомендовала себя в качестве средства анализа "живых" поверхностей [1]. Однако, при высоком пространственном разрешении метод имеет свои ограничения. Инновационный подход в визуализации поверхности эритроцитов заключается в применении другой разновидности сканирующей зондовой микроскопии – сканирующей ион-проводящей микроскопии (СИПМ).
Нормальные эритроциты представляют собой гладкие двояковогнутые диски диаметром 6–9 мкм и высотой 2–3 мкм. Для атомно-силовой микроскопии интерес представляет внешняя поверхность клетки. Эритроциты окружены пышной оболочкой, толщина которой составляет около 140 нм [2]. Мембраны эритроцитов, как и мембраны других клеток, играют неотъемлемую роль в их жизнедеятельности, и любое вмешательство может изменить не только рельеф поверхности, но и внутреннюю структуру, механизмы здорового функционирования [3, 4, 5].
Большинство научных исследований эритроцитов проводятся на воздухе [6, 7], но особый интерес представляет изучение клеток в их нативном состоянии, естественной среде. Чаще всего АСМ-исследования проводят на фиксированных клетках, что позволяет стабилизировать структуру мембраны и получать воспроизводимые результаты [8]. В основном, в качестве фиксатора используется глутаровый альдегид [9, 10], обеспечивающий кластеризацию белков мембраны эритроцита. Такая методика решает основную проблему АСМ-измерений клеток в жидкости – закрепление их на подложке. Дело в том, что поверхность эритроцитов относительно гладкая, и их нормальное состояние – нахождение в кровотоке, не будучи прикрепленными к каким-либо поверхностям.
Необходимо учитывать, что использование глутарового альдегида приводит к искажению формы и размеров клетки [11]. Сравнение эритроцита до и после фиксации приведено на рис.1. Видно, что после взаимодействия с фиксатором происходит углубление центра клетки, возникают характерные террасы (показаны стрелкой), края клетки становятся рыхлыми.
Используя контактный метод АСМ, с помощью микроскопа SolverBio были получены изображения топографии поверхности фиксированных эритроцитов в жидкости (рис.2). Клетку фиксировали глутаровым альдегидом и на подложке, и сверху. Измерения проводились в PBS-буфере при комнатной температуре.
Полуконтактный режим АСМ
Контактная методика не исключает силового воздействия на образец, поэтому при измерениях в жидкости даже с минимальным значением силы клетки подчас сдвигаются зондом, что осложняет получение воспроизводимых результатов. Кроме того, кантилевер может нанести механические повреждения изучаемому слою. Наиболее применимый к биологическим образцам режим АСМ – полуконтактный. При его использовании основная проблема заключается в постоянном поддержании острия кантилевера на краю отрыва от мембраны. Однако и этот режим не исключает силового воздействия на образец, поэтому для получения воспроизводимых результатов клетки фиксируются глутаровым альдегидом. Изображения эритроцитов, полученные в полуконтактном режиме, приведены на рис.3. Измерения проводились в PBS-буфере при комнатной температуре.
Применение полуконтактного метода дает более детальную информацию о топографии поверхности. Атомно-силовая микроскопия эритроцитов, фиксированных глутаровым альдегидом, показала, что среднеквадратичная шероховатость их поверхности составляет 20 нм.
Сканирующая ион-проводящая микроскопия
Как уже говорилось, использование фиксаторов неприемлемо при изучении именно живых клеток, следовательно, необходим неразрушающий способ прикрепления эритроцитов к подложке, при котором не происходит их смещения в жидкости. Хорошо известная методика в биологии – нанесение на покровные стекла положительно заряженного материала, например полилизина, который помогает клеткам присоединиться к плоской поверхности [12] и оставаться на ней даже в жидкости. Полилизин повышает электростатическое взаимодействие между отрицательно заряженными ионами клеточной мембраны и положительно заряженными ионами поверхности прикрепления. Данное решение было применено для исследования эритроцитов инновационным методом СИПМ с использованием стеклянных нанопипеток [13]. Метод позволяет проводить бесконтактное сканирование и визуализировать поверхности с высоким разрешением.
Принцип работы сканирующего ион-проводящего микроскопа показан на рис.4. Нанопипетка устанавливается над поверхностью непроводящего образца в растворе электролита. Между двумя хлор-серебряными электродами под действием внешнего напряжения течет ионный ток (один электрод находится внутри нанопипетки, другой – снаружи в электролите). Вдали от поверхности ток максимален, при приближении – начинает уменьшаться. Таким образом, не касаясь поверхности, нанопипетка "считывает" исследуемый рельеф. Изображение "зонда" приведено на рис.5.
СИПМ с использованием стеклянных нанопипеток – сравнительно молодой модифицированный метод СЗМ. Количество научных публикаций в этой области растет с каждым годом, и уже есть работы по исследованию живых клеток [13, 14]. Показано, что СИПМ сканирует топографию поверхности живых клеток с высоким разрешением, которое зависит от диаметра конца нанопипетки и сравнимо со сканирующей электронной микроскопией (СЭМ). Но, в отличие от СЭМ, СИПМ позволяет проводить эксперименты в жидкой среде. Метод позволяет получать трехмерные изображения живых объектов в реальном времени и фиксировать поведение клеточной поверхности в динамике. Еще одно преимущество СИПМ живых клеток – возможность объединения его с методом локальной фиксации потенциала ("пэтч-кламп" – patch-clamp), который дает возможность совершать микроманипуляции с живыми клетками, микрохирургию, микроинъектирование, доставку лекарств, что является особо актуальным в современной медицине. Главное достоинство СИПМ заключается в полном отсутствии механического воздействия на образец, так как нанопипетка не подходит к поверхности более чем на один внутренний радиус своего острия.
На рис.6 приведена визуализация клеток с использованием ионного микроскопа производства компании "МедНаноТех". В эксперименте использовались эритроциты с большим периодом хранения, поэтому их форма практически не отличается от плоской. Подложка из стекла модифицировалась полилизином, фиксация не осуществлялась, исследования проводились в PBS-буфере при комнатной температуре.
Анализ полученных результатов показал, что среднеквадратичная шероховатость поверхности эритроцита равна 20 нм, что соответствует результатам АСМ. При этом метод СИПМ не производит механического воздействия на образец.
Выводы
Можно отметить перспективность использования инновационного метода сканирующей зондовой микроскопии – сканирующей ион-проводящей микроскопии в применении к живым клеткам – эритроцитам. Величина разрешающей способности этого метода не уступает аналогичным показателям для атомно-силовой микроскопии, но, в отличие от последней, он является бесконтактным и позволяет выполнять "живое" сканирование.
Также следует сделать вывод, что для данной задачи успешно применима хорошо зарекомендовавшая себя в биологии методика нанесения на покровные стекла полилизина. Однако для АСМ-измерений этого все же недостаточно, и требуется дополнительная фиксация глутаровым альдегидом, что неприемлемо при сканировании в условиях, приближенных к нативному состоянию клеток.
Авторы благодарны Российскому фонду фундаментальных исследований за поддержку (проект 15-04-07678).
Литература
1.Яминский И.В., Горелкин П.В., Ерофеев А.С., Синицына О.В., Мешков Г.Б. Сканирующая зондовая микроскопия как главный инструмент бионаноскопии. – Медицина и высокие технологии, 2014, № 2, с. 11–26.
2.Ленинджер А. Основы биохимии. – М.: Мир, 1985, т. 1 (с. 205–206, 344–348), т. 2 (с. 415–419), т. 3 (с. 766).
3.Jacobson K., Sheets E.D., Simson R. Revisiting the fluid mosaic model of membranes. – Science, 1995, vol. 268, p. 441–1442.
4.Simons K., Ikonen E. Functional rafts in cell membranes. – Nature, 1997, vol. 387, p. 569–572.
5.Мороз В.В., Черныш А.М., Яминский И.В., Козлова Е.К., Киселев Г.А., Филонов А.С., Богушевич М.С., Гудкова О.Е. Перспективы применения методов атомной силовой микроскопии в реаниматологии. – Общая реаниматология, 2008, т. 4, № 4, с. 51–54.
6.Козлова Е.К., Черныш А.М., Гудкова О.Е., Бушуева А.В. Изменения структуры мембран эритроцитов при действии гемина. – Общая реаниматология, 2012, т. 8, № 6, с. 5–10.
7.Hekele O., Goesselsberger C.G. and Gebeshuber I.C. Nanodiagnostics performed on human red blood cells with atomic force microscopy. – Materials Science and Technology, 2008, vol. 24, № 9, p. 1162–1165.
8.Лобов И.А., Давлеткильдеев Н.А. Влияние способа подготовки образца на морфофункциональные характеристики эритроцитов при исследовании методом атомно-силовой микроскопии. – Вестник Омского Университета, 2013, № 2, с. 129–132.
9.Zaitsev B.N., Durymanov A.G., Generalov V.M. Atomic force microscopy of the interaction of erythrocyte membrane and virus particles. – Proceedings, SPM, 2002, p. 211.
10.Cross S.E., Jin Y.S., Rao J., Gimzewski J.K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. – Nature, Nanotechnology, 2007, vol. 2, p. 780–783.
11.Мороз В.В., Черныш А.М., Козлова Е.К., Гудкова О.Е., Сергунова В.А., Мягкова Е.А., Кузовлев А.Н. Методика микроскопического анализа мембран эритроцитов. – Общая реаниматология, 2013, № 9, с. 62–67.
12.Liu F., Burgess J., Mizukami H., Ostafin A. The human erythrocyte plasma membrane. – Elsevier, 2003, vol. 72, p. 39–88.
13.Hansma P.K., Drake B., Marti O. The scanning ion-conductive microscopy. – Science, 1989, vol. 243, № 4891, p. 641–643.
14.Стовпяга А.В., Сапожников И.Д., Голубок А.О.
Сканирующий микроскоп ионной проводимости, с одновременной визуализацией поверхности образца в полуконтактной силовой моде. – Научное приборостроение, 2002, т. 22, № 3, с. 36–45.
15.Korchev Y., Bashford C.L., Milovanovic M., Vodyanoy I., Lab M.J. Scanning ion-conductive microscopy of living cells. – Biophysical Journal, 1997, vol. 73, p. 653–658.
Атомно-силовая микроскопия (АСМ) отлично зарекомендовала себя в качестве средства анализа "живых" поверхностей [1]. Однако, при высоком пространственном разрешении метод имеет свои ограничения. Инновационный подход в визуализации поверхности эритроцитов заключается в применении другой разновидности сканирующей зондовой микроскопии – сканирующей ион-проводящей микроскопии (СИПМ).
Нормальные эритроциты представляют собой гладкие двояковогнутые диски диаметром 6–9 мкм и высотой 2–3 мкм. Для атомно-силовой микроскопии интерес представляет внешняя поверхность клетки. Эритроциты окружены пышной оболочкой, толщина которой составляет около 140 нм [2]. Мембраны эритроцитов, как и мембраны других клеток, играют неотъемлемую роль в их жизнедеятельности, и любое вмешательство может изменить не только рельеф поверхности, но и внутреннюю структуру, механизмы здорового функционирования [3, 4, 5].
Большинство научных исследований эритроцитов проводятся на воздухе [6, 7], но особый интерес представляет изучение клеток в их нативном состоянии, естественной среде. Чаще всего АСМ-исследования проводят на фиксированных клетках, что позволяет стабилизировать структуру мембраны и получать воспроизводимые результаты [8]. В основном, в качестве фиксатора используется глутаровый альдегид [9, 10], обеспечивающий кластеризацию белков мембраны эритроцита. Такая методика решает основную проблему АСМ-измерений клеток в жидкости – закрепление их на подложке. Дело в том, что поверхность эритроцитов относительно гладкая, и их нормальное состояние – нахождение в кровотоке, не будучи прикрепленными к каким-либо поверхностям.
Необходимо учитывать, что использование глутарового альдегида приводит к искажению формы и размеров клетки [11]. Сравнение эритроцита до и после фиксации приведено на рис.1. Видно, что после взаимодействия с фиксатором происходит углубление центра клетки, возникают характерные террасы (показаны стрелкой), края клетки становятся рыхлыми.
Используя контактный метод АСМ, с помощью микроскопа SolverBio были получены изображения топографии поверхности фиксированных эритроцитов в жидкости (рис.2). Клетку фиксировали глутаровым альдегидом и на подложке, и сверху. Измерения проводились в PBS-буфере при комнатной температуре.
Полуконтактный режим АСМ
Контактная методика не исключает силового воздействия на образец, поэтому при измерениях в жидкости даже с минимальным значением силы клетки подчас сдвигаются зондом, что осложняет получение воспроизводимых результатов. Кроме того, кантилевер может нанести механические повреждения изучаемому слою. Наиболее применимый к биологическим образцам режим АСМ – полуконтактный. При его использовании основная проблема заключается в постоянном поддержании острия кантилевера на краю отрыва от мембраны. Однако и этот режим не исключает силового воздействия на образец, поэтому для получения воспроизводимых результатов клетки фиксируются глутаровым альдегидом. Изображения эритроцитов, полученные в полуконтактном режиме, приведены на рис.3. Измерения проводились в PBS-буфере при комнатной температуре.
Применение полуконтактного метода дает более детальную информацию о топографии поверхности. Атомно-силовая микроскопия эритроцитов, фиксированных глутаровым альдегидом, показала, что среднеквадратичная шероховатость их поверхности составляет 20 нм.
Сканирующая ион-проводящая микроскопия
Как уже говорилось, использование фиксаторов неприемлемо при изучении именно живых клеток, следовательно, необходим неразрушающий способ прикрепления эритроцитов к подложке, при котором не происходит их смещения в жидкости. Хорошо известная методика в биологии – нанесение на покровные стекла положительно заряженного материала, например полилизина, который помогает клеткам присоединиться к плоской поверхности [12] и оставаться на ней даже в жидкости. Полилизин повышает электростатическое взаимодействие между отрицательно заряженными ионами клеточной мембраны и положительно заряженными ионами поверхности прикрепления. Данное решение было применено для исследования эритроцитов инновационным методом СИПМ с использованием стеклянных нанопипеток [13]. Метод позволяет проводить бесконтактное сканирование и визуализировать поверхности с высоким разрешением.
Принцип работы сканирующего ион-проводящего микроскопа показан на рис.4. Нанопипетка устанавливается над поверхностью непроводящего образца в растворе электролита. Между двумя хлор-серебряными электродами под действием внешнего напряжения течет ионный ток (один электрод находится внутри нанопипетки, другой – снаружи в электролите). Вдали от поверхности ток максимален, при приближении – начинает уменьшаться. Таким образом, не касаясь поверхности, нанопипетка "считывает" исследуемый рельеф. Изображение "зонда" приведено на рис.5.
СИПМ с использованием стеклянных нанопипеток – сравнительно молодой модифицированный метод СЗМ. Количество научных публикаций в этой области растет с каждым годом, и уже есть работы по исследованию живых клеток [13, 14]. Показано, что СИПМ сканирует топографию поверхности живых клеток с высоким разрешением, которое зависит от диаметра конца нанопипетки и сравнимо со сканирующей электронной микроскопией (СЭМ). Но, в отличие от СЭМ, СИПМ позволяет проводить эксперименты в жидкой среде. Метод позволяет получать трехмерные изображения живых объектов в реальном времени и фиксировать поведение клеточной поверхности в динамике. Еще одно преимущество СИПМ живых клеток – возможность объединения его с методом локальной фиксации потенциала ("пэтч-кламп" – patch-clamp), который дает возможность совершать микроманипуляции с живыми клетками, микрохирургию, микроинъектирование, доставку лекарств, что является особо актуальным в современной медицине. Главное достоинство СИПМ заключается в полном отсутствии механического воздействия на образец, так как нанопипетка не подходит к поверхности более чем на один внутренний радиус своего острия.
На рис.6 приведена визуализация клеток с использованием ионного микроскопа производства компании "МедНаноТех". В эксперименте использовались эритроциты с большим периодом хранения, поэтому их форма практически не отличается от плоской. Подложка из стекла модифицировалась полилизином, фиксация не осуществлялась, исследования проводились в PBS-буфере при комнатной температуре.
Анализ полученных результатов показал, что среднеквадратичная шероховатость поверхности эритроцита равна 20 нм, что соответствует результатам АСМ. При этом метод СИПМ не производит механического воздействия на образец.
Выводы
Можно отметить перспективность использования инновационного метода сканирующей зондовой микроскопии – сканирующей ион-проводящей микроскопии в применении к живым клеткам – эритроцитам. Величина разрешающей способности этого метода не уступает аналогичным показателям для атомно-силовой микроскопии, но, в отличие от последней, он является бесконтактным и позволяет выполнять "живое" сканирование.
Также следует сделать вывод, что для данной задачи успешно применима хорошо зарекомендовавшая себя в биологии методика нанесения на покровные стекла полилизина. Однако для АСМ-измерений этого все же недостаточно, и требуется дополнительная фиксация глутаровым альдегидом, что неприемлемо при сканировании в условиях, приближенных к нативному состоянию клеток.
Авторы благодарны Российскому фонду фундаментальных исследований за поддержку (проект 15-04-07678).
Литература
1.Яминский И.В., Горелкин П.В., Ерофеев А.С., Синицына О.В., Мешков Г.Б. Сканирующая зондовая микроскопия как главный инструмент бионаноскопии. – Медицина и высокие технологии, 2014, № 2, с. 11–26.
2.Ленинджер А. Основы биохимии. – М.: Мир, 1985, т. 1 (с. 205–206, 344–348), т. 2 (с. 415–419), т. 3 (с. 766).
3.Jacobson K., Sheets E.D., Simson R. Revisiting the fluid mosaic model of membranes. – Science, 1995, vol. 268, p. 441–1442.
4.Simons K., Ikonen E. Functional rafts in cell membranes. – Nature, 1997, vol. 387, p. 569–572.
5.Мороз В.В., Черныш А.М., Яминский И.В., Козлова Е.К., Киселев Г.А., Филонов А.С., Богушевич М.С., Гудкова О.Е. Перспективы применения методов атомной силовой микроскопии в реаниматологии. – Общая реаниматология, 2008, т. 4, № 4, с. 51–54.
6.Козлова Е.К., Черныш А.М., Гудкова О.Е., Бушуева А.В. Изменения структуры мембран эритроцитов при действии гемина. – Общая реаниматология, 2012, т. 8, № 6, с. 5–10.
7.Hekele O., Goesselsberger C.G. and Gebeshuber I.C. Nanodiagnostics performed on human red blood cells with atomic force microscopy. – Materials Science and Technology, 2008, vol. 24, № 9, p. 1162–1165.
8.Лобов И.А., Давлеткильдеев Н.А. Влияние способа подготовки образца на морфофункциональные характеристики эритроцитов при исследовании методом атомно-силовой микроскопии. – Вестник Омского Университета, 2013, № 2, с. 129–132.
9.Zaitsev B.N., Durymanov A.G., Generalov V.M. Atomic force microscopy of the interaction of erythrocyte membrane and virus particles. – Proceedings, SPM, 2002, p. 211.
10.Cross S.E., Jin Y.S., Rao J., Gimzewski J.K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. – Nature, Nanotechnology, 2007, vol. 2, p. 780–783.
11.Мороз В.В., Черныш А.М., Козлова Е.К., Гудкова О.Е., Сергунова В.А., Мягкова Е.А., Кузовлев А.Н. Методика микроскопического анализа мембран эритроцитов. – Общая реаниматология, 2013, № 9, с. 62–67.
12.Liu F., Burgess J., Mizukami H., Ostafin A. The human erythrocyte plasma membrane. – Elsevier, 2003, vol. 72, p. 39–88.
13.Hansma P.K., Drake B., Marti O. The scanning ion-conductive microscopy. – Science, 1989, vol. 243, № 4891, p. 641–643.
14.Стовпяга А.В., Сапожников И.Д., Голубок А.О.
Сканирующий микроскоп ионной проводимости, с одновременной визуализацией поверхности образца в полуконтактной силовой моде. – Научное приборостроение, 2002, т. 22, № 3, с. 36–45.
15.Korchev Y., Bashford C.L., Milovanovic M., Vodyanoy I., Lab M.J. Scanning ion-conductive microscopy of living cells. – Biophysical Journal, 1997, vol. 73, p. 653–658.
Отзывы читателей
