eng
Приведен обзор публикаций о сканирующей ион-проводящей микроскопии с целью изучения истории развития этого метода, его особенностей и областей применения.
УДК 621.385.833, ВАК 05.11.13, DOI: 10.22184/1993-8578.2017.78.7.42.46
УДК 621.385.833, ВАК 05.11.13, DOI: 10.22184/1993-8578.2017.78.7.42.46
Теги: scanning capillary microscopy scanning ion conductance microscope сканирующая капиллярная микроскопия сканирующий ион-проводящий микроскоп
Первая публикация о сканирующей капиллярной микроскопии вышла в 1989 году [1]. Статья П.Хансма, Б.Дрейка и О.Марти в журнале Science "Сканирующий ион-проводящий микроскоп" заложила основу для развития нового направления в микроскопии. Сканирующий ион-проводящий микроскоп (СИПМ) был разработан для отображения топографии поверхностей в электролите. Зондом микроскопа является заполненная электролитом микропипетка. Поток ионов через отверстие микропипетки уменьшается на небольшом расстоянии от поверхности. Механизм обратной связи может использоваться для поддержания заданной проводимости с одновременным определением расстояния до поверхности. В статье также была высказана мысль, что СИПМ может отображать не только топографию, но и локальные ионные токи через поры на поверхности.
В своей следующей публикации Хансма с коллегами предложил совмещенный атомно-силовой и ион-проводящий микроскоп. Конструкция основана на использовании изогнутой стеклянной пипетки, которая действует как датчики силы и проводимости. Измерение отклонения пипетки позволило получить более стабильную обратную связь, чем возможно было в предыдущих версиях СИПМ. С помощью комбинированного микроскопа были исследованы синтетические мембраны в режимах контакта и тэппинга в жидкости. Пипетки были изготовлены из боросиликатного стекла или кварцевых капиллярных трубок. Хотя боросиликатное стекло оказалось удобным и простым в обращении, Хансма и его коллеги получили наивысшее разрешение и высокую воспроизводимость, используя вытянутые кварцевые трубки (Nanonics, Израиль). В статье указано, что, хотя работа в режиме контакта возможна, но более высокий контраст и менее заметное повреждение образца при получении изображений топографии и ионной проводимости обеспечиваются в режиме тэппинга [2].
Годом позже проф. Корчев с коллегами опубликовал работу о сканирующей ион-проводящей микроскопии живых клеток, которая позволяет изучать топографию, не повреждая образец. Изображения напоминают снимки, полученные с помощью сканирующей электронной микроскопии, с существенной разницей в том, что клетки остаются жизнеспособными и активными. Прибор может контролировать мелкомасштабную динамику клеточных поверхностей, а также движение целых клеток [3].
В работе [4] были проведены опыты с меланоцитами мышей, которые показали, что СИПМ наиболее подходит для визуализации образцов, погруженных в водные растворы. Поскольку зонд измеряет ионный ток без физического контакта с образцом во время сканирования, то не требуется предварительной подготовки клеток (фиксация на подложке).
СИПМ состоит из четырех основных компонентов: ионно-чувствительного стеклянного зонда (микропипетки), заполненного электролитом; сканирующей пьезоэлектрической системы; специализированного электронно-измерительного оборудования, включающего систему обратной связи; цифровой электроники и компьютера, который обеспечивает пользовательский интерфейс для микроскопа, управление системой, а также позволяет выполнять обработку полученных данных. Уже тогда предсказывалось, что СИПМ потенциально может быть применим для исследований в реальном времени в электрофизиологии, при проведении микроманипуляций и доставки лекарств.
В [5] показано, что СИПМ может измерять изменения в объеме клеток в диапазоне от 10–19 до 10–9 литра.
В [6] представлен гибрид СИПМ и сканирующей ближнепольной оптической микроскопии. Этот метод позволяет выполнять количественный анализ поверхности ячейки с высоким разрешением и проводить одновременную запись топографических и оптических изображений. Особенностью метода является надежный механизм управления расстоянием между зондом и образцом в физиологическом буфере.
В работе [7] проведено сравнение сканирующей ион-проводящей и атомно-силовой (АСМ) микроскопии. В качестве модельных образцов для сравнения возможностей АСМ- и СИПМ-визуализации использовались микроворсинки живых клеток A6. Качество АСМ-изображений значительно улучшилось после фиксации клеток, в то время как на СИПМ-снимках оно не изменилось. В АСМ измеренная высота и ширина целых клеток зависели от значения силы, в то время как в СИПМ они были постоянными в пределах большого диапазона заданных значений. Таким образом, было показано, что получение точной топографии живых клеток в АСМ возможно только с использованием режима силового картирования, который, помимо определения механических свойств образца, обеспечивает изображение "нулевой силы" или "высоты контакта" ячейки. Однако скорость формирования изображения в жидкости обычно ограничена несколькими пикселями в секунду, что требует достаточно много времени для его получения с необходимым разрешением.
В статье [8] подробно описаны три распространенных метода обратной связи в СИПМ: постоянного тока (dc), переменного тока (ac) и прыжковый режим.
Разрешение в СИПМ определяется геометрией наконечника пипетки и расстоянием между пипеткой и образцом. Типичное значение достигаемого разрешения составляет около 10 нм по вертикали и около 50 нм в поперечном направлении [9]. Наилучшее разрешение (3–6 нм) было получено при визуализации белков S-слоя из Bacillus sphaericus на поверхности слюды с нанопипеткой диаметром 13 нм [10].
В [11] использовали прыжковый режим ион-проводящей микроскопии, позволяющий регулировать угол, под которым нанопипетка приближается к клетке. Угол может быть отрегулирован в диапазоне 0–90⁰ к поверхности.
В дополнение к наблюдению топографии с высоким разрешением СИПМ может выполнять многофункциональный анализ живых клеток, включая морфологические трансформации, вызванные физиологическими воздействиями, идентификацию внутриклеточных сигнальных путей и определение характеристик механических ответов, что демонстрирует универсальность метода.
С помощью СИПМ были исследованы желудочковые миоциты, полученные из ткани сердец [12], подвергшихся длительной механической разгрузке [13] или рассечению, вызванному осмотическим шоком [14]. Во всех этих случаях СИПМ выявил очевидные изменения в структуре поверхности по сравнению с изображениями миоцитов здоровой ткани.
В работе [15] продемонстрирована возможность использования нанопипетки как датчика pH.
Таким образом, мы видим, что капиллярный зонд или нанопипетка могут выступать в качестве средства доставки лекарств, электрохимического сенсора, биосенсора pH, тест-системы для обнаружения ионов металлов и многое другого. Капилляры с двумя или несколькими каналами дают также возможность реализовать направленный массоперенос веществ, биомакромолекул (пептидов, белков, нуклеиновых кислот и пр.) на поверхность биообъектов или внутрь их объема [16].
В наших исследованиях по сканирующей капиллярной микроскопии мы используем установку, встроенную в инвертированный микроскоп (Nikon, Япония, рис.1). В работе [17] с помощью СИПМ наблюдались эритроциты, и анализ полученных результатов показал, что среднеквадратичная шероховатость их поверхности равна 20 нм.
В заголовок мы вынесли название "капиллярная микроскопия", так как оно объединяет гораздо больше функций и способов применения по сравнению с термином "ион-проводящая микроскопия". СИПМ успешно развивается с разработкой новых технологий создания многоканальных капилляров для направленной модификации поверхности. Можно прогнозировать дальнейшее широкое применение ион-проводящего микроскопа в биомедицинских приложениях, тестировании лекарственных средств с использованием всего лишь одной клетки, а не их культуры [18].
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта 17-52-560001.
ЛИТЕРАТУРА
Hansma P.K., Drake B., Marti O., Gould S.A., Prater C.B. The scanning ion-conductance microscope // Science. 243: 641–643. 1989.
Proksch R., Lal R., Hansma P.K., Morse D., Stucky G. Imaging the internal and external pore structure of membranes in fluid: TappingMode scanning ion conductance microscopy // Biophys. J. 71: 2155–2157. 1996.
Korchev Y.E., Bashford C.L., Milovanovic M., Vodyanoy I., Lab M.J. Scanning ion conductance microscopy of living cells // Biophys. J. 73: 653–658. 1997.
Korchev Y.E., Milovanovic M., Bashford C.L., Bennett D.C., Sviderskaya E.V., Vodyanoy I., Lab M.J. Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells // J. Microsc. 188: 17–23. 1997.
Korchev Y.E., Gorelik J., Lab M.J., Sviderskaya E.V., Johnston C.L., Coombes C.R., Vodyanoy I., Edwards C.R. Cell volume measurement using scanning ion conductance microscopy // Biophys. J. 78: 451–457. 2000.
Korchev Y.E., Raval M., Lab M.J., Gorelik J., Edwards C.R., Rayment T., Klenerman D. Hybrid scanning ion conductance and scanning near-field optical microscopy for the study of living cells // Biophys. J. 78: 2675–2679. 2000.
Seifert J., Rheinlaender J., Novak P., Korchev Y., Schäffer T.E. Comparison of atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy for live cell imaging // Langmuir. 2015.
Chen C., Zhou Y., Baker L.A. Scanning Ion Conductance Microscopy // Annual Review of Analytical Chemistry. 2012.
Ying L.M., Bruckbauer A., Zhou D., Gorelik J., Shevchuk A., et al. The scanned nanopipette: a new tool for high-resolution bioimaging and controlled deposition of biomolecules // Phys. Chem. Chem. Phys.7: 2859–66. 2005.
Shevchuk A.I., Frolenkov G.I., Sanchez D., James P.S., Freedman N., et al. Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy // Angew. Chem. Int. Ed. 45: 2212–16. 2006.
Leo-Macias A., Agullo-Pascual E., Sanchez-Alonso J.L., Keegan S., Lin X., Arcos T., Feng-Xia-Liang, Korchev Y.E., Gorelik J., Fenyo D., Rothenberg E., Delmar M., et al. Nanoscale visualization of functional adhesion/excitability nodes at the intercalated disc // Nature Communications, Vol: 7, ISSN: 2041-1723. 2016.
Lyon A.R., MacLeod K.T., Zhang Y.J., Garcia E., Kanda G.K., et al. Loss of T-tubules and other changes to surface topography in ventricular myocytes from failing human and rat heart // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106: 6854–59. 2009.
Ibrahim M., Al Masri A., Navaratnarajah M., Siedlecka U., Soppa G.K., et al. Prolonged mechanical unloading affects cardiomyocyte excitation-contraction coupling, transverse-tubule structure, and the cell surface // FASEB J. 24: 3321–29. 2010.
Gorelik J., Yang L.Q., Zhang Y.J., Lab M., Korchev Y., Harding S.E. A novel Z-groove index characterizing myocardial surface structure // Cardiovasc. Res. 72: 422–29. 2006.
Piper J.D., Clarke R.W., Korchev Y.E., Ying L., Klenerman D., et al. A renewable nanosensor based on a glass nanopipette // Journal of the American Chemical Society. Vol 128. P. 16462–16463. 2006. ISSN: 0002-7863.
Яминский И.В. Сканирующая капиллярная микроскопия // НАНОИНДУСТРИЯ. 2016. № 1(63). С. 76–79.
Макарова Е., Багров Д., Горелкин П., Яминский И. Наблюдение эритроцитов с помощью атомно-силовой и сканирующей ион-проводящей микроскопии // НАНОИНДУСТРИЯ. 2015. № 2(56). С. 42–47.
Макарова Е.С., Багров Д.В., Горелкин П.В., Ерофеев А.С., Яминский И.В. Визуализация эритроцитов методами атомно-силовой и сканирующей ион-проводящей микроскопии //Медицина и высокие технологии. 2015. № 2. С. 42–45.
В своей следующей публикации Хансма с коллегами предложил совмещенный атомно-силовой и ион-проводящий микроскоп. Конструкция основана на использовании изогнутой стеклянной пипетки, которая действует как датчики силы и проводимости. Измерение отклонения пипетки позволило получить более стабильную обратную связь, чем возможно было в предыдущих версиях СИПМ. С помощью комбинированного микроскопа были исследованы синтетические мембраны в режимах контакта и тэппинга в жидкости. Пипетки были изготовлены из боросиликатного стекла или кварцевых капиллярных трубок. Хотя боросиликатное стекло оказалось удобным и простым в обращении, Хансма и его коллеги получили наивысшее разрешение и высокую воспроизводимость, используя вытянутые кварцевые трубки (Nanonics, Израиль). В статье указано, что, хотя работа в режиме контакта возможна, но более высокий контраст и менее заметное повреждение образца при получении изображений топографии и ионной проводимости обеспечиваются в режиме тэппинга [2].
Годом позже проф. Корчев с коллегами опубликовал работу о сканирующей ион-проводящей микроскопии живых клеток, которая позволяет изучать топографию, не повреждая образец. Изображения напоминают снимки, полученные с помощью сканирующей электронной микроскопии, с существенной разницей в том, что клетки остаются жизнеспособными и активными. Прибор может контролировать мелкомасштабную динамику клеточных поверхностей, а также движение целых клеток [3].
В работе [4] были проведены опыты с меланоцитами мышей, которые показали, что СИПМ наиболее подходит для визуализации образцов, погруженных в водные растворы. Поскольку зонд измеряет ионный ток без физического контакта с образцом во время сканирования, то не требуется предварительной подготовки клеток (фиксация на подложке).
СИПМ состоит из четырех основных компонентов: ионно-чувствительного стеклянного зонда (микропипетки), заполненного электролитом; сканирующей пьезоэлектрической системы; специализированного электронно-измерительного оборудования, включающего систему обратной связи; цифровой электроники и компьютера, который обеспечивает пользовательский интерфейс для микроскопа, управление системой, а также позволяет выполнять обработку полученных данных. Уже тогда предсказывалось, что СИПМ потенциально может быть применим для исследований в реальном времени в электрофизиологии, при проведении микроманипуляций и доставки лекарств.
В [5] показано, что СИПМ может измерять изменения в объеме клеток в диапазоне от 10–19 до 10–9 литра.
В [6] представлен гибрид СИПМ и сканирующей ближнепольной оптической микроскопии. Этот метод позволяет выполнять количественный анализ поверхности ячейки с высоким разрешением и проводить одновременную запись топографических и оптических изображений. Особенностью метода является надежный механизм управления расстоянием между зондом и образцом в физиологическом буфере.
В работе [7] проведено сравнение сканирующей ион-проводящей и атомно-силовой (АСМ) микроскопии. В качестве модельных образцов для сравнения возможностей АСМ- и СИПМ-визуализации использовались микроворсинки живых клеток A6. Качество АСМ-изображений значительно улучшилось после фиксации клеток, в то время как на СИПМ-снимках оно не изменилось. В АСМ измеренная высота и ширина целых клеток зависели от значения силы, в то время как в СИПМ они были постоянными в пределах большого диапазона заданных значений. Таким образом, было показано, что получение точной топографии живых клеток в АСМ возможно только с использованием режима силового картирования, который, помимо определения механических свойств образца, обеспечивает изображение "нулевой силы" или "высоты контакта" ячейки. Однако скорость формирования изображения в жидкости обычно ограничена несколькими пикселями в секунду, что требует достаточно много времени для его получения с необходимым разрешением.
В статье [8] подробно описаны три распространенных метода обратной связи в СИПМ: постоянного тока (dc), переменного тока (ac) и прыжковый режим.
Разрешение в СИПМ определяется геометрией наконечника пипетки и расстоянием между пипеткой и образцом. Типичное значение достигаемого разрешения составляет около 10 нм по вертикали и около 50 нм в поперечном направлении [9]. Наилучшее разрешение (3–6 нм) было получено при визуализации белков S-слоя из Bacillus sphaericus на поверхности слюды с нанопипеткой диаметром 13 нм [10].
В [11] использовали прыжковый режим ион-проводящей микроскопии, позволяющий регулировать угол, под которым нанопипетка приближается к клетке. Угол может быть отрегулирован в диапазоне 0–90⁰ к поверхности.
В дополнение к наблюдению топографии с высоким разрешением СИПМ может выполнять многофункциональный анализ живых клеток, включая морфологические трансформации, вызванные физиологическими воздействиями, идентификацию внутриклеточных сигнальных путей и определение характеристик механических ответов, что демонстрирует универсальность метода.
С помощью СИПМ были исследованы желудочковые миоциты, полученные из ткани сердец [12], подвергшихся длительной механической разгрузке [13] или рассечению, вызванному осмотическим шоком [14]. Во всех этих случаях СИПМ выявил очевидные изменения в структуре поверхности по сравнению с изображениями миоцитов здоровой ткани.
В работе [15] продемонстрирована возможность использования нанопипетки как датчика pH.
Таким образом, мы видим, что капиллярный зонд или нанопипетка могут выступать в качестве средства доставки лекарств, электрохимического сенсора, биосенсора pH, тест-системы для обнаружения ионов металлов и многое другого. Капилляры с двумя или несколькими каналами дают также возможность реализовать направленный массоперенос веществ, биомакромолекул (пептидов, белков, нуклеиновых кислот и пр.) на поверхность биообъектов или внутрь их объема [16].
В наших исследованиях по сканирующей капиллярной микроскопии мы используем установку, встроенную в инвертированный микроскоп (Nikon, Япония, рис.1). В работе [17] с помощью СИПМ наблюдались эритроциты, и анализ полученных результатов показал, что среднеквадратичная шероховатость их поверхности равна 20 нм.
В заголовок мы вынесли название "капиллярная микроскопия", так как оно объединяет гораздо больше функций и способов применения по сравнению с термином "ион-проводящая микроскопия". СИПМ успешно развивается с разработкой новых технологий создания многоканальных капилляров для направленной модификации поверхности. Можно прогнозировать дальнейшее широкое применение ион-проводящего микроскопа в биомедицинских приложениях, тестировании лекарственных средств с использованием всего лишь одной клетки, а не их культуры [18].
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта 17-52-560001.
ЛИТЕРАТУРА
Hansma P.K., Drake B., Marti O., Gould S.A., Prater C.B. The scanning ion-conductance microscope // Science. 243: 641–643. 1989.
Proksch R., Lal R., Hansma P.K., Morse D., Stucky G. Imaging the internal and external pore structure of membranes in fluid: TappingMode scanning ion conductance microscopy // Biophys. J. 71: 2155–2157. 1996.
Korchev Y.E., Bashford C.L., Milovanovic M., Vodyanoy I., Lab M.J. Scanning ion conductance microscopy of living cells // Biophys. J. 73: 653–658. 1997.
Korchev Y.E., Milovanovic M., Bashford C.L., Bennett D.C., Sviderskaya E.V., Vodyanoy I., Lab M.J. Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells // J. Microsc. 188: 17–23. 1997.
Korchev Y.E., Gorelik J., Lab M.J., Sviderskaya E.V., Johnston C.L., Coombes C.R., Vodyanoy I., Edwards C.R. Cell volume measurement using scanning ion conductance microscopy // Biophys. J. 78: 451–457. 2000.
Korchev Y.E., Raval M., Lab M.J., Gorelik J., Edwards C.R., Rayment T., Klenerman D. Hybrid scanning ion conductance and scanning near-field optical microscopy for the study of living cells // Biophys. J. 78: 2675–2679. 2000.
Seifert J., Rheinlaender J., Novak P., Korchev Y., Schäffer T.E. Comparison of atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy for live cell imaging // Langmuir. 2015.
Chen C., Zhou Y., Baker L.A. Scanning Ion Conductance Microscopy // Annual Review of Analytical Chemistry. 2012.
Ying L.M., Bruckbauer A., Zhou D., Gorelik J., Shevchuk A., et al. The scanned nanopipette: a new tool for high-resolution bioimaging and controlled deposition of biomolecules // Phys. Chem. Chem. Phys.7: 2859–66. 2005.
Shevchuk A.I., Frolenkov G.I., Sanchez D., James P.S., Freedman N., et al. Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy // Angew. Chem. Int. Ed. 45: 2212–16. 2006.
Leo-Macias A., Agullo-Pascual E., Sanchez-Alonso J.L., Keegan S., Lin X., Arcos T., Feng-Xia-Liang, Korchev Y.E., Gorelik J., Fenyo D., Rothenberg E., Delmar M., et al. Nanoscale visualization of functional adhesion/excitability nodes at the intercalated disc // Nature Communications, Vol: 7, ISSN: 2041-1723. 2016.
Lyon A.R., MacLeod K.T., Zhang Y.J., Garcia E., Kanda G.K., et al. Loss of T-tubules and other changes to surface topography in ventricular myocytes from failing human and rat heart // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106: 6854–59. 2009.
Ibrahim M., Al Masri A., Navaratnarajah M., Siedlecka U., Soppa G.K., et al. Prolonged mechanical unloading affects cardiomyocyte excitation-contraction coupling, transverse-tubule structure, and the cell surface // FASEB J. 24: 3321–29. 2010.
Gorelik J., Yang L.Q., Zhang Y.J., Lab M., Korchev Y., Harding S.E. A novel Z-groove index characterizing myocardial surface structure // Cardiovasc. Res. 72: 422–29. 2006.
Piper J.D., Clarke R.W., Korchev Y.E., Ying L., Klenerman D., et al. A renewable nanosensor based on a glass nanopipette // Journal of the American Chemical Society. Vol 128. P. 16462–16463. 2006. ISSN: 0002-7863.
Яминский И.В. Сканирующая капиллярная микроскопия // НАНОИНДУСТРИЯ. 2016. № 1(63). С. 76–79.
Макарова Е., Багров Д., Горелкин П., Яминский И. Наблюдение эритроцитов с помощью атомно-силовой и сканирующей ион-проводящей микроскопии // НАНОИНДУСТРИЯ. 2015. № 2(56). С. 42–47.
Макарова Е.С., Багров Д.В., Горелкин П.В., Ерофеев А.С., Яминский И.В. Визуализация эритроцитов методами атомно-силовой и сканирующей ион-проводящей микроскопии //Медицина и высокие технологии. 2015. № 2. С. 42–45.
Отзывы читателей
