eng
Выпуск #3-4/2021
И.В.Яминский, А.И.Ахметова
Электромеханические кантилеверные сенсоры для обнаружения биологических объектов
Электромеханические кантилеверные сенсоры для обнаружения биологических объектов
Просмотры: 1242
DOI: 10.22184/1993-8578.2021.14.3-4.224.230
В медицинской диагностике распознавание вирусов выполняется с помощью полимеразной цепной реакции и иммуноферментного анализа. Их высокая чувствительность и селективность требуют привлечения высококвалифицированного персонала, использования дополнительных меток, времени для анализа данных и инвестиции. Существует потребность в небольших , эффективных датчиках, показывающих результат с высокой специфичностью.
В медицинской диагностике распознавание вирусов выполняется с помощью полимеразной цепной реакции и иммуноферментного анализа. Их высокая чувствительность и селективность требуют привлечения высококвалифицированного персонала, использования дополнительных меток, времени для анализа данных и инвестиции. Существует потребность в небольших , эффективных датчиках, показывающих результат с высокой специфичностью.
Теги: electromechanical cantilever sensors immunosorbent assay pcr иммуноферментный анализ пцр электромеханические кантилеверные сенсоры
ЭЛЕКТРОМЕХАНИЧЕСКИЕ КАНТИЛЕВЕРНЫЕ СЕНСОРЫ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ
БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
ELECTROMECHANICAL CANTILEVER SENSORS
FOR DETECTION OF BIOLOGICAL OBJECTS
И.В.Яминский1, 2, 3, 4, д.ф.-м.н., проф. физического и химического факультетов МГУ имени М.В.Ломоносова, генеральный директор Центра перспективных технологий, директор Энергоэффективных технологий, вед. науч. сотр. ИНЭОС РАН, (ORCID: 0000-0001-8731-3947), А.И.Ахметова1, 2, 3, инженер НИИ ФХБ имени А.Н.Белозерского МГУ, ведущий специалист Центра перспективных технологий и Энергоэффективных технологий, (ORCID: 0000-0002-5115-8030) / yaminsky@nanoscopy.ru
I.V.Yaminskiy1, 2, 3, 4, Doct. of Sc. (Physics and Mathematics), Prof. of Lomonosov Moscow State University, Physical and Chemical departments, Director of Energy Efficient Technologies, Leading Sci. of INEOS RAS, A.I.Akhmetova1, 2, 3, Engineer of A.N.Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Leading Specialist of Advanced Technologies Center and of Energy Efficient Technologies
DOI: 10.22184/1993-8578.2021.14.3-4.224.230
Получено: 11.05.2021 г.
В медицинской диагностике распознавание вирусов может выполняться в лабораториях с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуноферментного анализа. Хотя эти традиционные методы обладают чрезвычайно высокой чувствительностью и селективностью, необходимость привлечения высококвалифицированного персонала, использование дополнительных меток, длительное время на анализ данных и огромные вложения в ресурсы часто затрудняют диагностику. В настоящее время существует острая потребность в эффективных датчиках, небольших и простых в эксплуатации, быстро показывающих результат с высокой специфичностью. В данной статье рассматриваются электромеханические кантилеверные датчики, которые нашли применение в обнаружении вирусов, бактерий и измерении их антибиотикорезистентности. Особенность данного метода состоит в высокой потенциальной чувствительности и скорости теста без использования меток.
Recognition of viruses in the medical diagnostics can be performed using a polymerase chain reaction (PCR) and an enzyme-linked immunosorbent assay. Although these conventional methods have extremely high sensitivity and selectivity, it is necessary to involve a highly qualified personnel, huge investments, use additional labels and spend a long period of time to process data that often makes it difficult to diagnose. Nowadays, effective and easy-to-use small sensors quickly indicating the result with high specificity are absolutely necessary. In this paper the electromechanical cantilever sensors applied for detection of viruses and bacteria, and measurements of their antibiotic resistance are considered. The peculiarity of this method is in its high potential sensitivity and test speed without using labels.
ВВЕДЕНИЕ
Значительное распространение вирусных и бактериальных заболеваний, особенно в зимний период, приводит к тому, что диагноз ставится неточно, больные принимают антибиотики при любых признаках простуды. Поставить однозначный диагноз, вызвано ли заболевание вирусной или бактериальной инфекцией, по внешним симптомам бывает сложно.
Адекватное лечение инфекции зависит от ранней диагностики, однако современные стандартные методы на основе культивирования для обнаружения бактерий и тестирования чувствительности к антибиотикам включают продолжительные во времени протоколы и порой бывают в значительной степени трудозатратны. Повсеместное использование антибиотиков приводит к появлению антибиотикорезистентных бактерий, что усложняет лечение. Инфекционные заболевания, вызываемые бактериальными патогенами, по-прежнему считаются одной из самых серьезных угроз глобальному здоровью. Устойчивые к лекарствам бактерии ежегодно вызывают 700 тыс. смертей во всем мире, и эксперты прогнозируют, что к 2050 году это число может вырасти до 10 млн из-за появления массовой устойчивости бактерий к антибиотикам [1].
Несмотря на большое количество исследований, посвященных различным методам диагностики, ПЦР до сих пор остается самым надежным методом, но требующим специализированного персонала, дорогостоящего оборудования и транспортировки пробы до лаборатории. Все это не позволяет реализовать принцип прикроватной диагностики, когда участковый врач может за 10–15 мин поставить точный диагноз. Тест-полоски частично решают эту проблему, так как результаты могут быть ложноположительными, при этом стоимость такого теста остается сопоставимой с лабораторным анализом.
Таким образом, в сфере медицинской диагностики до сих пор нет простого, точного, компактного прибора, который мог бы справиться с данной задачей. Альтернативным высокочувствительным и недорогим решением могут стать электромеханические кантилеверные сенсоры.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Существуют два основных режима работы электромеханических кантилеверных сенсоров – статический и динамический. Обнаружение патогенов (включая измерение скорости их роста или метаболической активности) происходит на поверхности чувствительного элемента сенсора, вызывая его отклонение (статический режим) или изменение резонансной частоты колебаний датчика (динамический режим).
С помощью статического режима в работе [2] было продемонстрировано прямое обнаружение вируса гриппа А в концентрациях ниже 105 вирионов/мл с помощью пьезокерамического диска, модифицированного синтетическими сиалилгликополимерами, которые биоспецифически связывают белки гемагглютинина. Также было показано, что сдвиг частоты пропорционален изменению поверхностного напряжения, вызванного адсорбцией вируса, а чувствительность обратно пропорциональна толщине резонатора. Следовательно, используя более тонкую пьезокерамическую пластинку, можно легко повысить чувствительность в несколько раз.
В динамическом режиме резонансная частота пьезоэлектрического элемента (кантилевера) изменяется в зависимости от прикрепившейся массы и изменившейся вследствие этого жесткости поверхностного слоя. В этом режиме кантилевер ведет себя, как гармонический осциллятор, и его эффективность зависит от резонансной частоты f, определяемой жесткостью самого кантилевера, адсорбированного слоя k и эффективной массой m, а также добротностью Q.
Чувствительность электромеханических датчиков для обнаружения биологических объектов зависит от различных параметров, таких как форма, размеры, материалы, режим работы, схема обнаружения, окружающая среда и сенсорный слой, который необходимо подбирать в зависимости от обнаруживаемой мишени.
Механические характеристики кантилевера – статическое отклонение и амплитуда резонансных колебаний – могут варьироваться от ангстремов до сотен нанометров, что требует прецизионных методов считывания сигнала для точной количественной оценки. Наиболее популярные схемы – оптическая, пьезорезистивная и пьезоэлектрическая. Оптическая схема регистрирует отклонения лазерного луча от кончика кантилевера.
Пьезорезистивная схема основана на изменении сопротивления проводника при изгибе кантилевера и, как правило, использует электрическую систему регистрации на основе моста Уитстона для уменьшения перекрестных помех и улучшения отношения сигнал/шум.
Пьезоэлектрическая схема регистрирует механические колебания под действием переменного напряжения. Когда масса m увеличивается из-за присоединения молекул, резонансная частота f уменьшается. Сенсорный слой (как правило, антитела) закрепляется на поверхности одного из электродов пьезоэлектрического датчика. Электроды возбуждают резонанс в пьезоэлектрике, а также считывают сигнал с датчика. Когда мишень связывается с сенсорным слоем, происходит изменение массы Δm на поверхности электрода, что приводит к зависящему от времени сдвигу частоты Δf [3] (рис.1).
С помощью пьезоэлектрической пластинки (piezoelectric plate sensor, PEPS) в проточной жидкостной ячейке удалось обнаружить Clostridium difficile в течение 40 мин без выделения генов, амплификации и флуоресцентных меток [4]. В работе [5] использовались PEPS, покрытые ДНК зондом, для обнаружения двойной мутации вируса гепатита B. С помощью зонда ДНК, иммобилизованного на поверхности PEPS, реализовали in situ обнаружение ДНК в реальном времени и с аттомолярной чувствительностью [6].
В работе [7] пьезоэлектрические пластинки, модифицированные антителами на микроальбумин, использовались для исследования активности коньюгатов антител, меченых пероксидазой, что позволило провести контроль с помощью иммуноферментного анализа. Также с помощью пьезокерамических датчиков было продемонстрировано обнаружение ДНК [8].
С помощью пьезоэлектрической пластинки, покрытой ДНК-зондами, было показано обнаружение двойной мутации вируса гепатита в моче in situ [9]. Пьезоэлектрический датчик был покрыт золотыми электродами с двух сторон и тонким слоем изоляции.
Связывание ДНК мишени из образца биологической жидкости с ДНК-зондами на поверхности прямоугольной пьезоэлектрической пластины вызывало сдвиг резонансной частоты, что увеличивало длину и ширину датчика. Было показано, что чувствительность метода составляет 60 копий/мл, при этом измерение проводится за 30 мин.
В работе [10] объединили пьезоэлектрические датчики с ПЦР для одновременного обнаружения и генотипирования 16 штаммов вируса папилломы человека в образцах соскобов с поверхности шейки матки. Пьезоэлектрические датчики покрыли синтетическими олигонуклеотидами и выполнили тесты после амплификации ПЦР без использования меток, результаты показали высокую селективность и воспроизводимость метода, сопоставимого со стандартным анализом. Чен и др. [11] разработали пьезоэлектрический датчик из нержавеющей стали с металлическими зажимами для обнаружения гибридизации продуктов ПЦР вируса папилломы человека и рассмотрели влияние изменения температуры на стабильность резонансной частоты.
Электромеханические биосенсоры, работающие в динамическом режиме, способны взвесить массу прикрепившейся мишени с высокой чувствительностью: на уровне пикограмм и даже фемтограмм [12]. Кроме того, с помощью биосенсора можно проводить измерение массы бактерии в среде и использовать эти данные как индикатор скорости роста бактерий [13].
Микрокантилеверы, покрытые питательными слоями, например, агарозой, были способны обнаруживать активный рост E. coli в течение 1 ч в условиях контролируемой температуры и влажности [14]. Расчетная чувствительность по росту бактерий составляла ~ 140 пг/Гц, что соответствует примерно 200 клеткам E. coli. Рост иммобилизованного мицелиального гриба Aspergillus niger и одноклеточных дрожжей S. cerevisiae приводил к сдвигу резонансной частоты в течение нескольких часов, регистрация роста при использовании традиционных методов культивирования занимает большее время [15].
ВЫВОДЫ
Метаболизм бактерий можно отследить по колебаниям кантилевера в квазистатическом режиме измерений в водной среде, а также при этом параллельно провести тест на резистентность к антибиотикам. В работе [16] измерялось не статическое отклонение кантилевера или изменение его резонансной частоты, а анализировались флуктуации (фоновый шум) колебаний кантилевера в зависимости от времени. Живые бактерии были ковалентно пришиты к обеим сторонам кремниевых v-образных кантилеверов с использованием аминопропилтриэтоксисилана (APTES) в качестве линкерной молекулы с хорошей биосовместимостью. Метаболическая активность прикрепленных E. coli и S. aureus вызывала низкочастотные отклонения кантилевера. В присутствии антибиотиков ампициллина и канамицина колебания резко уменьшились из-за воздействия на бактерии лекарствами, что позволило быстро подтвердить антибактериальный эффект.
Кроме того, в работе [17] было показано, что 50 клеток способны генерировать измеримые колебания. Таким образом, кантилеверные сенсоры вполне пригодны для проведения менее чем за один час теста на антибиотикорезистентность небольшого числа бактерий.
БЛАГОДАРНОСТИ
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Лондонского Королевского Общества № 21-58-10005, РНФ, проект № 20-12-00389, РФФИ, проект № 20-32-90036.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Aslam B., Wang W., Arshad M.I., Khurshid M., Muzammil S., Rasool M.H. et al. Antibiotic resistance: a rundown of a global crisis. Infect. Drug Resist. (2018). 11, 1645–1658. https://doi.org/10.2147/IDR.S173867
Erofeev A.S., Gorelkin P.V., Kolesov D.V., Yaminsky I.V. Label-free sensitive detection of influenza virus using pzt discs with a synthetic sialylglycopolymer receptor layer. Royal Society Open Science, (2019). 6:190255, https://doi.org/10.1098/rsos.190255.
Chen Y., Qian C., Liu C., Shen H., Wang Z., Ping J., Wu J., Chen H. Nucleic acid amplification free biosensors for pathogen detection. Biosens. Bioelectron. (2020), 153, 112049.
Han S., Soylu M.C., Kirimli C.E., Wu W., Sen B., Joshi S.G., Emery C.L., Au G., Niu X., Hamilton R., Krevolin K., Shih W.H., Shih W.Y. Rapid, label-free genetic detection of enteropathogens in stool without genetic isolation or amplification. Biosens. Bioelectron. (2019). 130, 73–80. https://doi.org/10.1016/j.bios.2019.01.025
Kirimli C.E., Shih W., Shih W.Y. Specific in situ hepatitis b viral double mutation (hbvdm) detection in urine with 60 copies ml(-1) analytical sensitivity in a background of 250-fold wild type without DNA isolation and amplification. Analyst (2015) 140 (5), 1590–1598.
Wu W., Kirimli C.E., Shih W.H., Shih W.Y. Real-time, in situ DNA hybridization detection with attomolar sensitivity without amplification using (pb(mg1/3nb2/3) o3)0.65-(pbtio3)0.35 piezoelectric plate sensors. Biosens. Bioelectron. (2013) 43, 391–399. https://doi.org/10.1016/j.bios.2012.12.044
Akhmetova A., Nazarov I., Presnova G., Rubtsova M.Yu., Egorov A., Yaminsky I. Detection of protein biomacromolecules using a piezoceramic biochip. Nanoindustry, (2017) 8 (79): 44–49. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2017.79.8.44.48
Dubrovin E.V., Presnova G.V., Rubtsova M.Yu. et al. Application of atomic force microscopy for 3D analysis of the results of hybridization of nucleic acids on microchips. Acta naturae (2015) 7, 117–124.
Kirimli C.E., Shih W.H., Shih W.Y. (2015) Specific in situ hepatitis B viral double mutation (HBVDM) detection in urine with 60 copies ml(−1) analytical sensitivity in a background of 250-fold wild type without DNA isolation and amplification. Analyst 140:1590–1598. https://doi.org/10.1039/c 4an01885k
Dell’Atti D., Zavaglia M., Tombelli S., Bertacca G., Cavazzana A.O., Bevilacqua G., Minunni M., Mascini M. Clin. Chim. Acta 2007, 383, 140. https://doi.org/10.1016/j.cca.2007.05.009
Chen Q., Bian Z., Hua X., Yao C., Wu W., Zhang X., Zhang B., Huang J., Tang W., Fu W. Detection of hybridization of single-strand DNA PCR products in temperature change process by a novel metal-clamping piezoelectric sensor. Biosens. Bioelectron. (2010), 25, 2161–2166. https://doi.org/10.1016/j.bios.2010.02.028
Burg T.P., Godin M., Knudsen S.M., Shen W., Carlson G., Foster J.S. et al. Weighing of biomolecules, single cells and single nanoparticles in fluid. Nature (2007) 446, 1066–1069. https://doi.org/10.1038/nature05741
Gfeller K.Y., Nugaeva N., Hegner M. Micromechanical oscillators as rapid biosensor for the detection of active growth of Escherichia coli. Biosens. Bioelectron. (2005) 21, 528–533. https://doi.org/10.1016/j.bios.2004.11.018
Gfeller K.Y., Nugaeva N., Hegner M. Rapid biosensor for detection of antibiotic-selective growth of Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. (2005) 71, 2626–2631. https://doi: 10.1128/AEM.71.5.2626-2631.2005
Nugaeva N., Gfeller K.Y., Backmann N., Lang H.P., Düggelin M., Hegner M. Micromechanical cantilever array sensors for selective fungal immobilization and fast growth detection. Biosens. Bioelectron. (2005) 21, 849–856. https://doi.org/10.1016/j.bios.2005.02.004
Longo G., Alonso-Sarduy L., Rio L.M., Bizzini A., Trampuz A., Notz J. et al. Rapid detection of bacterial resistance to antibiotics using AFM cantilevers as nanomechanical sensors. Nat. Nanotech. (2013) 8, 522–526. https://doi.org/10.1038/nnano.2013.120
Aghayee S., Benadiba C., Notz J., Kasas S., Dietler G., Longo G. Combination of fluorescence microscopy and nanomotion detection to characterize bacteria. J. Mol. Recognit. (2013) 26, 590–595. https://doi.org/10.1002/jmr.2306
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
ELECTROMECHANICAL CANTILEVER SENSORS
FOR DETECTION OF BIOLOGICAL OBJECTS
И.В.Яминский1, 2, 3, 4, д.ф.-м.н., проф. физического и химического факультетов МГУ имени М.В.Ломоносова, генеральный директор Центра перспективных технологий, директор Энергоэффективных технологий, вед. науч. сотр. ИНЭОС РАН, (ORCID: 0000-0001-8731-3947), А.И.Ахметова1, 2, 3, инженер НИИ ФХБ имени А.Н.Белозерского МГУ, ведущий специалист Центра перспективных технологий и Энергоэффективных технологий, (ORCID: 0000-0002-5115-8030) / yaminsky@nanoscopy.ru
I.V.Yaminskiy1, 2, 3, 4, Doct. of Sc. (Physics and Mathematics), Prof. of Lomonosov Moscow State University, Physical and Chemical departments, Director of Energy Efficient Technologies, Leading Sci. of INEOS RAS, A.I.Akhmetova1, 2, 3, Engineer of A.N.Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Leading Specialist of Advanced Technologies Center and of Energy Efficient Technologies
DOI: 10.22184/1993-8578.2021.14.3-4.224.230
Получено: 11.05.2021 г.
В медицинской диагностике распознавание вирусов может выполняться в лабораториях с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуноферментного анализа. Хотя эти традиционные методы обладают чрезвычайно высокой чувствительностью и селективностью, необходимость привлечения высококвалифицированного персонала, использование дополнительных меток, длительное время на анализ данных и огромные вложения в ресурсы часто затрудняют диагностику. В настоящее время существует острая потребность в эффективных датчиках, небольших и простых в эксплуатации, быстро показывающих результат с высокой специфичностью. В данной статье рассматриваются электромеханические кантилеверные датчики, которые нашли применение в обнаружении вирусов, бактерий и измерении их антибиотикорезистентности. Особенность данного метода состоит в высокой потенциальной чувствительности и скорости теста без использования меток.
Recognition of viruses in the medical diagnostics can be performed using a polymerase chain reaction (PCR) and an enzyme-linked immunosorbent assay. Although these conventional methods have extremely high sensitivity and selectivity, it is necessary to involve a highly qualified personnel, huge investments, use additional labels and spend a long period of time to process data that often makes it difficult to diagnose. Nowadays, effective and easy-to-use small sensors quickly indicating the result with high specificity are absolutely necessary. In this paper the electromechanical cantilever sensors applied for detection of viruses and bacteria, and measurements of their antibiotic resistance are considered. The peculiarity of this method is in its high potential sensitivity and test speed without using labels.
ВВЕДЕНИЕ
Значительное распространение вирусных и бактериальных заболеваний, особенно в зимний период, приводит к тому, что диагноз ставится неточно, больные принимают антибиотики при любых признаках простуды. Поставить однозначный диагноз, вызвано ли заболевание вирусной или бактериальной инфекцией, по внешним симптомам бывает сложно.
Адекватное лечение инфекции зависит от ранней диагностики, однако современные стандартные методы на основе культивирования для обнаружения бактерий и тестирования чувствительности к антибиотикам включают продолжительные во времени протоколы и порой бывают в значительной степени трудозатратны. Повсеместное использование антибиотиков приводит к появлению антибиотикорезистентных бактерий, что усложняет лечение. Инфекционные заболевания, вызываемые бактериальными патогенами, по-прежнему считаются одной из самых серьезных угроз глобальному здоровью. Устойчивые к лекарствам бактерии ежегодно вызывают 700 тыс. смертей во всем мире, и эксперты прогнозируют, что к 2050 году это число может вырасти до 10 млн из-за появления массовой устойчивости бактерий к антибиотикам [1].
Несмотря на большое количество исследований, посвященных различным методам диагностики, ПЦР до сих пор остается самым надежным методом, но требующим специализированного персонала, дорогостоящего оборудования и транспортировки пробы до лаборатории. Все это не позволяет реализовать принцип прикроватной диагностики, когда участковый врач может за 10–15 мин поставить точный диагноз. Тест-полоски частично решают эту проблему, так как результаты могут быть ложноположительными, при этом стоимость такого теста остается сопоставимой с лабораторным анализом.
Таким образом, в сфере медицинской диагностики до сих пор нет простого, точного, компактного прибора, который мог бы справиться с данной задачей. Альтернативным высокочувствительным и недорогим решением могут стать электромеханические кантилеверные сенсоры.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Существуют два основных режима работы электромеханических кантилеверных сенсоров – статический и динамический. Обнаружение патогенов (включая измерение скорости их роста или метаболической активности) происходит на поверхности чувствительного элемента сенсора, вызывая его отклонение (статический режим) или изменение резонансной частоты колебаний датчика (динамический режим).
С помощью статического режима в работе [2] было продемонстрировано прямое обнаружение вируса гриппа А в концентрациях ниже 105 вирионов/мл с помощью пьезокерамического диска, модифицированного синтетическими сиалилгликополимерами, которые биоспецифически связывают белки гемагглютинина. Также было показано, что сдвиг частоты пропорционален изменению поверхностного напряжения, вызванного адсорбцией вируса, а чувствительность обратно пропорциональна толщине резонатора. Следовательно, используя более тонкую пьезокерамическую пластинку, можно легко повысить чувствительность в несколько раз.
В динамическом режиме резонансная частота пьезоэлектрического элемента (кантилевера) изменяется в зависимости от прикрепившейся массы и изменившейся вследствие этого жесткости поверхностного слоя. В этом режиме кантилевер ведет себя, как гармонический осциллятор, и его эффективность зависит от резонансной частоты f, определяемой жесткостью самого кантилевера, адсорбированного слоя k и эффективной массой m, а также добротностью Q.
Чувствительность электромеханических датчиков для обнаружения биологических объектов зависит от различных параметров, таких как форма, размеры, материалы, режим работы, схема обнаружения, окружающая среда и сенсорный слой, который необходимо подбирать в зависимости от обнаруживаемой мишени.
Механические характеристики кантилевера – статическое отклонение и амплитуда резонансных колебаний – могут варьироваться от ангстремов до сотен нанометров, что требует прецизионных методов считывания сигнала для точной количественной оценки. Наиболее популярные схемы – оптическая, пьезорезистивная и пьезоэлектрическая. Оптическая схема регистрирует отклонения лазерного луча от кончика кантилевера.
Пьезорезистивная схема основана на изменении сопротивления проводника при изгибе кантилевера и, как правило, использует электрическую систему регистрации на основе моста Уитстона для уменьшения перекрестных помех и улучшения отношения сигнал/шум.
Пьезоэлектрическая схема регистрирует механические колебания под действием переменного напряжения. Когда масса m увеличивается из-за присоединения молекул, резонансная частота f уменьшается. Сенсорный слой (как правило, антитела) закрепляется на поверхности одного из электродов пьезоэлектрического датчика. Электроды возбуждают резонанс в пьезоэлектрике, а также считывают сигнал с датчика. Когда мишень связывается с сенсорным слоем, происходит изменение массы Δm на поверхности электрода, что приводит к зависящему от времени сдвигу частоты Δf [3] (рис.1).
С помощью пьезоэлектрической пластинки (piezoelectric plate sensor, PEPS) в проточной жидкостной ячейке удалось обнаружить Clostridium difficile в течение 40 мин без выделения генов, амплификации и флуоресцентных меток [4]. В работе [5] использовались PEPS, покрытые ДНК зондом, для обнаружения двойной мутации вируса гепатита B. С помощью зонда ДНК, иммобилизованного на поверхности PEPS, реализовали in situ обнаружение ДНК в реальном времени и с аттомолярной чувствительностью [6].
В работе [7] пьезоэлектрические пластинки, модифицированные антителами на микроальбумин, использовались для исследования активности коньюгатов антител, меченых пероксидазой, что позволило провести контроль с помощью иммуноферментного анализа. Также с помощью пьезокерамических датчиков было продемонстрировано обнаружение ДНК [8].
С помощью пьезоэлектрической пластинки, покрытой ДНК-зондами, было показано обнаружение двойной мутации вируса гепатита в моче in situ [9]. Пьезоэлектрический датчик был покрыт золотыми электродами с двух сторон и тонким слоем изоляции.
Связывание ДНК мишени из образца биологической жидкости с ДНК-зондами на поверхности прямоугольной пьезоэлектрической пластины вызывало сдвиг резонансной частоты, что увеличивало длину и ширину датчика. Было показано, что чувствительность метода составляет 60 копий/мл, при этом измерение проводится за 30 мин.
В работе [10] объединили пьезоэлектрические датчики с ПЦР для одновременного обнаружения и генотипирования 16 штаммов вируса папилломы человека в образцах соскобов с поверхности шейки матки. Пьезоэлектрические датчики покрыли синтетическими олигонуклеотидами и выполнили тесты после амплификации ПЦР без использования меток, результаты показали высокую селективность и воспроизводимость метода, сопоставимого со стандартным анализом. Чен и др. [11] разработали пьезоэлектрический датчик из нержавеющей стали с металлическими зажимами для обнаружения гибридизации продуктов ПЦР вируса папилломы человека и рассмотрели влияние изменения температуры на стабильность резонансной частоты.
Электромеханические биосенсоры, работающие в динамическом режиме, способны взвесить массу прикрепившейся мишени с высокой чувствительностью: на уровне пикограмм и даже фемтограмм [12]. Кроме того, с помощью биосенсора можно проводить измерение массы бактерии в среде и использовать эти данные как индикатор скорости роста бактерий [13].
Микрокантилеверы, покрытые питательными слоями, например, агарозой, были способны обнаруживать активный рост E. coli в течение 1 ч в условиях контролируемой температуры и влажности [14]. Расчетная чувствительность по росту бактерий составляла ~ 140 пг/Гц, что соответствует примерно 200 клеткам E. coli. Рост иммобилизованного мицелиального гриба Aspergillus niger и одноклеточных дрожжей S. cerevisiae приводил к сдвигу резонансной частоты в течение нескольких часов, регистрация роста при использовании традиционных методов культивирования занимает большее время [15].
ВЫВОДЫ
Метаболизм бактерий можно отследить по колебаниям кантилевера в квазистатическом режиме измерений в водной среде, а также при этом параллельно провести тест на резистентность к антибиотикам. В работе [16] измерялось не статическое отклонение кантилевера или изменение его резонансной частоты, а анализировались флуктуации (фоновый шум) колебаний кантилевера в зависимости от времени. Живые бактерии были ковалентно пришиты к обеим сторонам кремниевых v-образных кантилеверов с использованием аминопропилтриэтоксисилана (APTES) в качестве линкерной молекулы с хорошей биосовместимостью. Метаболическая активность прикрепленных E. coli и S. aureus вызывала низкочастотные отклонения кантилевера. В присутствии антибиотиков ампициллина и канамицина колебания резко уменьшились из-за воздействия на бактерии лекарствами, что позволило быстро подтвердить антибактериальный эффект.
Кроме того, в работе [17] было показано, что 50 клеток способны генерировать измеримые колебания. Таким образом, кантилеверные сенсоры вполне пригодны для проведения менее чем за один час теста на антибиотикорезистентность небольшого числа бактерий.
БЛАГОДАРНОСТИ
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Лондонского Королевского Общества № 21-58-10005, РНФ, проект № 20-12-00389, РФФИ, проект № 20-32-90036.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Aslam B., Wang W., Arshad M.I., Khurshid M., Muzammil S., Rasool M.H. et al. Antibiotic resistance: a rundown of a global crisis. Infect. Drug Resist. (2018). 11, 1645–1658. https://doi.org/10.2147/IDR.S173867
Erofeev A.S., Gorelkin P.V., Kolesov D.V., Yaminsky I.V. Label-free sensitive detection of influenza virus using pzt discs with a synthetic sialylglycopolymer receptor layer. Royal Society Open Science, (2019). 6:190255, https://doi.org/10.1098/rsos.190255.
Chen Y., Qian C., Liu C., Shen H., Wang Z., Ping J., Wu J., Chen H. Nucleic acid amplification free biosensors for pathogen detection. Biosens. Bioelectron. (2020), 153, 112049.
Han S., Soylu M.C., Kirimli C.E., Wu W., Sen B., Joshi S.G., Emery C.L., Au G., Niu X., Hamilton R., Krevolin K., Shih W.H., Shih W.Y. Rapid, label-free genetic detection of enteropathogens in stool without genetic isolation or amplification. Biosens. Bioelectron. (2019). 130, 73–80. https://doi.org/10.1016/j.bios.2019.01.025
Kirimli C.E., Shih W., Shih W.Y. Specific in situ hepatitis b viral double mutation (hbvdm) detection in urine with 60 copies ml(-1) analytical sensitivity in a background of 250-fold wild type without DNA isolation and amplification. Analyst (2015) 140 (5), 1590–1598.
Wu W., Kirimli C.E., Shih W.H., Shih W.Y. Real-time, in situ DNA hybridization detection with attomolar sensitivity without amplification using (pb(mg1/3nb2/3) o3)0.65-(pbtio3)0.35 piezoelectric plate sensors. Biosens. Bioelectron. (2013) 43, 391–399. https://doi.org/10.1016/j.bios.2012.12.044
Akhmetova A., Nazarov I., Presnova G., Rubtsova M.Yu., Egorov A., Yaminsky I. Detection of protein biomacromolecules using a piezoceramic biochip. Nanoindustry, (2017) 8 (79): 44–49. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2017.79.8.44.48
Dubrovin E.V., Presnova G.V., Rubtsova M.Yu. et al. Application of atomic force microscopy for 3D analysis of the results of hybridization of nucleic acids on microchips. Acta naturae (2015) 7, 117–124.
Kirimli C.E., Shih W.H., Shih W.Y. (2015) Specific in situ hepatitis B viral double mutation (HBVDM) detection in urine with 60 copies ml(−1) analytical sensitivity in a background of 250-fold wild type without DNA isolation and amplification. Analyst 140:1590–1598. https://doi.org/10.1039/c 4an01885k
Dell’Atti D., Zavaglia M., Tombelli S., Bertacca G., Cavazzana A.O., Bevilacqua G., Minunni M., Mascini M. Clin. Chim. Acta 2007, 383, 140. https://doi.org/10.1016/j.cca.2007.05.009
Chen Q., Bian Z., Hua X., Yao C., Wu W., Zhang X., Zhang B., Huang J., Tang W., Fu W. Detection of hybridization of single-strand DNA PCR products in temperature change process by a novel metal-clamping piezoelectric sensor. Biosens. Bioelectron. (2010), 25, 2161–2166. https://doi.org/10.1016/j.bios.2010.02.028
Burg T.P., Godin M., Knudsen S.M., Shen W., Carlson G., Foster J.S. et al. Weighing of biomolecules, single cells and single nanoparticles in fluid. Nature (2007) 446, 1066–1069. https://doi.org/10.1038/nature05741
Gfeller K.Y., Nugaeva N., Hegner M. Micromechanical oscillators as rapid biosensor for the detection of active growth of Escherichia coli. Biosens. Bioelectron. (2005) 21, 528–533. https://doi.org/10.1016/j.bios.2004.11.018
Gfeller K.Y., Nugaeva N., Hegner M. Rapid biosensor for detection of antibiotic-selective growth of Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. (2005) 71, 2626–2631. https://doi: 10.1128/AEM.71.5.2626-2631.2005
Nugaeva N., Gfeller K.Y., Backmann N., Lang H.P., Düggelin M., Hegner M. Micromechanical cantilever array sensors for selective fungal immobilization and fast growth detection. Biosens. Bioelectron. (2005) 21, 849–856. https://doi.org/10.1016/j.bios.2005.02.004
Longo G., Alonso-Sarduy L., Rio L.M., Bizzini A., Trampuz A., Notz J. et al. Rapid detection of bacterial resistance to antibiotics using AFM cantilevers as nanomechanical sensors. Nat. Nanotech. (2013) 8, 522–526. https://doi.org/10.1038/nnano.2013.120
Aghayee S., Benadiba C., Notz J., Kasas S., Dietler G., Longo G. Combination of fluorescence microscopy and nanomotion detection to characterize bacteria. J. Mol. Recognit. (2013) 26, 590–595. https://doi.org/10.1002/jmr.2306
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
Отзывы читателей
