eng
Выпуск #5/2022
М.В.Зубашева, А.И.Ахметова, Т.А.Смирнова, Н.В.Шевлягина, Ю.А.Смирнов, В.Г.Жуховицкий, И.В.Яминский
КРИСТАЛЛООБРАЗОВАНИЕ В БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ BREVIBACILLUS LATEROSPORUS
КРИСТАЛЛООБРАЗОВАНИЕ В БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ BREVIBACILLUS LATEROSPORUS
Просмотры: 450
DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2022.15.5.254.261
Бациллы Brevibacillus laterosporus (Вl) являются перспективным источником бактериальных инсектицидов. Способность к кристаллообразованию у бактерий Bl до недавнего времени не была установлена. Методами сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии охарактеризованы бактериальные клетки Brevibacillus laterosporus. Изучено образование в бактериях белковых кристаллов от первых этапов зарождения в клетках и до стадии появления свободных кристаллов. Получены изображения кристаллов с молекулярным разрешением и определены параметры кристаллической решетки. В случае энтомоцидных бацилл в клетках образуются кристаллические белковые токсины, которые приводят к гибели насекомых после поглощения ими бактерий. Таков механизм защиты этих бактериальных клеток. В этом случае кристаллы выполняют защитную функцию живых организмов.
Бациллы Brevibacillus laterosporus (Вl) являются перспективным источником бактериальных инсектицидов. Способность к кристаллообразованию у бактерий Bl до недавнего времени не была установлена. Методами сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии охарактеризованы бактериальные клетки Brevibacillus laterosporus. Изучено образование в бактериях белковых кристаллов от первых этапов зарождения в клетках и до стадии появления свободных кристаллов. Получены изображения кристаллов с молекулярным разрешением и определены параметры кристаллической решетки. В случае энтомоцидных бацилл в клетках образуются кристаллические белковые токсины, которые приводят к гибели насекомых после поглощения ими бактерий. Таков механизм защиты этих бактериальных клеток. В этом случае кристаллы выполняют защитную функцию живых организмов.
Теги: brevibacillus laterosporus crystal formation protective function spores toxins transmission electron microscopy защитная функция образование кристаллов просвечивающая электронная микроскопия споры токсины
Получено: 11.08.2022 г. | Принято: 17.08.2022 г. | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2022.15.5.254.261
Научная статья
КРИСТАЛЛООБРАЗОВАНИЕ В БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ BREVIBACILLUS LATEROSPORUS
М.В.Зубашева1, к.б.н., науч. сотр., ORCID: 0000-0001-7330-7343
А.И.Ахметова2, 3, инженер НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ, ведущий специалист Центра перспективных технологий, ORCID: 0000-0002-5115-8030
Т.А.Смирнова1, д.б.н., вед. науч. сотр., ORCID: 0000-0001-7121-635Х
Н.В.Шевлягина1, к.м.н., ст. науч. сотр., ORCID: 0000-0001-9651-1654
Ю.А.Смирнов1, д.м.н., проф., вед. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-2215-5420
В.Г.Жуховицкий1, 4, к.м.н., руководитель лаб., ORCID: 0000-0002-4653-2446
И.В.Яминский2, 3, д.ф.-м.н., проф. физического и химического факультетов МГУ имени М. В.Ломоносова, директор Центра перспективных технологий, ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Аннотация. Бациллы Brevibacillus laterosporus (Вl) являются перспективным источником бактериальных инсектицидов. Способность к кристаллообразованию у бактерий Bl до недавнего времени не была установлена. Методами сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии охарактеризованы бактериальные клетки Brevibacillus laterosporus. Изучено образование в бактериях белковых кристаллов от первых этапов зарождения в клетках и до стадии появления свободных кристаллов. Получены изображения кристаллов с молекулярным разрешением и определены параметры кристаллической решетки. В случае энтомоцидных бацилл в клетках образуются кристаллические белковые токсины, которые приводят к гибели насекомых после поглощения ими бактерий. Таков механизм защиты этих бактериальных клеток. В этом случае кристаллы выполняют защитную функцию живых организмов.
Ключевые слова: Brevibacillus laterosporus, просвечивающая электронная микроскопия, образование кристаллов, споры, токсины, защитная функция
Для цитирования: М.В. Зубашева, А.И. Ахметова, Т.А. Смирнова, Н.В. Шевлягина, Ю.А. Смирнов, В.Г. Жуховицкий, И.В. Яминский. Кристаллообразование в бактериальных клетках Brevibacillus laterosporus. НАНОИНДУСТРИЯ. 2022. Т. 15, № 5. С.254–261. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2022.15.5.254.261
Received: 11.08.2022 | Accepted: 17.08.2022 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2022.15.5.254.261
Original paper
CRYSTAL FORMATION IN BACTERIAL CELLS OF BREVIBACILLUS LATEROSPORUS
M.V.Zubasheva1, Cand. of Sci. (Biology), Researcher, ORCID: 0000-0001-7330-7343
A.I.Akhmetova2, 3, Engineer of A.N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Leading Specialist of Advanced Technologies Center, ORCID: 0000-0002-5115-8030
Т.А.Smirnova1, Doct. of Sci. (Biology), Leading Researcher, ORCID: 0000-0001-7121-635Х
N.V.Shevlyagina1, Cand. of Sci. (Medical), Senior Researcher, ORCID: 0000-0001-9651-1654
Yu.A.Smirnov1, Doct. of Sci. (Medical), Prof., Leading Researcher, ORCID: 0000-0002-2215-5420
V.G.Zhukhovitsky1, 4, Cand. of Sci. (Medical), Head of Laboratory ORCID: 0000-0002-4653-2446
I.V.Yaminsky2, 3, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Prof. of Lomonosov Moscow State University, Physical and Chemical departments, Director of Advanced Technologies Center, ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Abstract. Bacillus Brevibacillus laterosporus (Bl) is a promising source of bacterial insecticides. The crystal-forming ability of Bl bacteria has not been established until recently. Bacterial cells of Brevibacillus laterosporus were characterized with the aid of scanning and transmission electron microscopy. The formation of protein crystals in bacteria from the first stages of nucleation in the cells up to the stage of free crystals was studied. Molecular resolution images of the crystals have been obtained and the crystal lattice parameters have been determined. In the case of entomocidal bacilli, crystalline protein toxins are formed in the cells, which lead to death of insects after absorption by the bacteria. This is the defense mechanism of these bacterial cells. In such case, the crystals perform the protective function of living organisms.
Keywords: Brevibacillus laterosporus, transmission electron microscopy, crystal formation, spores, toxins, protective function
For citation: M.V. Zubasheva, A.I. Akhmetova, Т.А. Smirnova, N.V. Shevlyagina, Yu.A. Smirnov, V.G. Zhukhovitsky, I.V. Yaminsky. Crystal formation in bacterial cells of Brevibacillus laterosporus. NANOINDUSTRY. 2022. V. 15, no. 5. PP.254–261. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2022.15.5.254.261
ВВЕДЕНИЕ
Образование кристаллов или кристаллических включений является редким явлением в живой природе. В основном кристаллы образуются в неживой природе. Они представляют собой кристаллические породы, драгоценные камни и др. Углерод имеет несколько кристаллических форм – алмаз, графит, а также мелкокристаллический порошок карбин. Образование кристаллов происходит при суммарном уменьшении энергии строительных единиц – атомов или молекул – в кристалле по сравнению с их энергией в растворе. Может происходить и обратный процесс, растворение кристаллов, если в растворе наблюдается явный недостаток растворенного вещества. Кристаллы присутствуют в живой природе, например, в магнитотактических бактериях синтезируются магнитные кристаллы оксида или сульфида железа. Размеры кристаллов находятся в диапазоне 25–130 нм [1, 2]. Эти кристаллы обеспечивают защитные функции у бактерий за счет присутствия токсичного двухвалентного иона. Среда обитания этих бактерий содержит избыток железа. Эти бактерии перемещаются вдоль силовых линий магнитного поля. Магнитные кристаллы действуют, как магнитная стрелка.
Наиболее хорошо изучены кристаллы Bacillus thuringiensis (Bt) в связи с их энтомоцидной активностью против чешуекрылых (Lepidoptera), двукрылых (Diptera), жесткокрылых (Coleoptera) насекомых. Изучение энтомоцидных кристаллов Bt обнаружило несколько их основных морфологических типов: бипирамидальный, сферическо-аморфный, плоский квадратный, кубический, палочковидный. Большинство кристаллов, активных против лепидоптера, имели бипирамидальную или кубическую форму. Иррегулярные, сферические и палочковидные кристаллы могли быть москитоцидными. Плоские, квадратные кристаллы активны против Coleoptera [3]. Cпоры и кристаллы Bt применяются для борьбы с насекомыми-вредителями. Однако препараты на их основе не полностью отвечают необходимым требованиям. В настоящее время проводится поиск и изучение других экологически безопасных бактериальных препаратов.
Бациллы Brevibacillus laterosporus (Bl), в отличие от Bt, относятся к малоизученным энтомопатогенным бактериям. Их отличительная особенность – наличие каноэвидного включения, прикрепленного к споре. Ранее нами были изучены и охарактеризованы штаммы Bl, способные образовывать параспоральные кристаллы [4]. У исследованных штаммов Bl удалось обнаружить кристаллические включения, различающиеся по форме и размерам, подобные тем, что описаны для энтомопатогенных бактерий Bt. Наибольшая активность у Bl выявлена против насекомых отряда двукрылых (Díptera). К этому отряду относятся комары родов Aedes, Anopheles, Culex и черные мушки (Simulium vittatum). Многие виды комаров являются переносчиками возбудителей малярии, желтой лихорадки, лихорадки денге, геморрагической лихорадки и лимфатического филяриаоза. Синтетические инсектициды оказывают неблагоприятное воздействие на человека и природу. Кроме того, обнаружена устойчивость к таким инсектицидам у комаров, являющихся переносчиками патогенов.
Альтернативой для решения этих проблем и ограничений является биологический контроль с помощью энтомопатогенных бактерий. Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (Bti) оказался первым подвидом Bt, токсичным для двукрылых [5]. Исследование природы инсектицидных факторов показало, что насекомые отряда двукрылых (Diptera) комары и черные мушки чувствительны к параспоральному включению Bti, которое состоит из четырех белков Cry4Aa, Cry4Ba, Cry11Aa, Cyt1Aa [6]. Ben-Dov [7] сообщил, что ларвицидная активность заключается в четырех основных (134, 128, 72 и 27 кДа) и, по крайней мере, двух второстепенных (78 и 29 кДа) полипептидах, кодируемых генами cry4Aa, cry4Ba, cry11Aa, cyt1Aa, cry10Aa и cyt2Ba, картированных на плазмиде размером 128 т.п.н., известной как pBtoxis. Эти δ-эндотоксины образуют сложное параспоральное кристаллическое тело с чрезвычайно высокой специфичностью. Электронная микроскопия показала, что клетки Bti образуют включения, которые состоят из различных сегментов, осмиофобного или слегка окрашенного, кристаллизованного в виде решетки с периодом 4,3 нм и осмиофильного окрашенного сегмента с кристаллической решеткой с периодом 7,8 нм. Комплекс из нескольких кристаллов заключен в общую оболочку [8].
Кристаллические включения Bl могут иметь кубическую форму. О кубической форме кристаллов мы писали ранее [9]. В настоящей статье мы приводим результаты изучения ромбических кристаллов в клетках Bl. Данная работа посвящена изучению процесса кристаллообразования у Bl при споруляции, а также анализу структуры кристаллов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штамм B. laterosporus (Bl) 16–92 был выделен из погибшего насекомого.
Штамм выращивали на агаризованной среде NBY в течение 48–96 ч при 30 °С.
Электронная микроскопия.
Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ).
Нативную споро-кристаллическую суспензию исследовали с помощью электронно-ионного сканирующего микроскопа Quanta 2003D (FEI Compani, USA). Образцы нативной суспензии помещали на кремниевую подложку, которую с помощью углеродного скотча фиксировали к алюминиевому столику. Препараты исследовали в режиме высокого и низкого вакуума. Поверхность образца сканировали при ускоряющем напряжении 5–30 кВ.
Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)
Бациллы штамма 16–92 смывали с агара и фиксировали сначала по методу Ито-Карновски [10]. Затем материал фиксировали в 1% ОsО4 растворе на 0,2 М какодилатном буфере и в 1% растворе уранилацетата на 0,2 М малеатном буфере. Материал обезвоживали в спиртах с концентрациями 50°, 70°, 96°, 100°, далее помещали в смесь 100° спирта со смолой LR White, а затем в чистую смолу LR White. Материал переносили в желатиновые капсулы, которые помещали в термостат при 56 °C. Срезы получали на ультратоме LKB III (LKB, Sweden) и контрастировали 1% раствором уранилацетата в 70° спирте и лимоннокислым свинцом. Суспензию спор и кристаллов для исследования методом негативного контрастирования наносили на сетки, покрытые углеродной пленкой, и окрашивали 2% водным раствором NANOWtm. Препараты исследовали на электронных микроскопах JEM -100 B и LEO912AB.
Обработка изображений проведена в программном обеспечении "ФемтоСкан Онлайн" [11]. Для определения параметров кристаллической решетки наблюдаемых кристаллов использовано двумерное Фурье-преобразование.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Было изучено кристаллобразование у Bl: от первых этапов и до стадии появления свободных кристаллов. Для обнаружения кристаллов споро-кристаллическую суспензию штамма 16–92 исследовали с помощью СЭМ. На рис.1 видны зрелые споры с каноэвидным включением и ромбические кристаллы. Кристаллы были связаны со спорами либо находились в свободном состоянии.
Электронно-микроскопическое изучение ультратонких срезов штамма Bl 16–92 методом ПЭМ показало, что растущие, делящиеся клетки не содержали кристаллов. Кристаллы появлялись в вегетативных клетках до вхождения в стадию споруляции. В дальнейшем кристаллообразующие клетки проходили все этапы спорообразования. На рис.2 видна проспора, на некотором расстоянии от которой находится ромбовидный кристалл. У Bl кристаллы формируются без связи со споровыми структурами. Около кристалла наблюдается разряженность цитоплазмы.
Лизис цитоплазмы спорангия вокруг споры и кристалла нарастает по мере созревания споры. Наряду с кристаллическим включением наблюдается разрастание пластинчатого каноэвидного включения. На рис.3 видно, что цитоплазма спорангия полностью лизирована, а клеточная оболочка у большей части спор сохранена, но у некоторых частично разрушена. На рис.4 видны спора с каноэвидным включением и кристалл после выхода из спорангия. Как и у Bt, при лизисе спорангия споры и кристаллы Bl освобождаются раздельно.
В некоторых клетках Bl образуется по два и более кристаллов. Это видно на рис.5: различим кристалл сложного строения.
Кристаллы заключены в общую оболочку (рис.5, 6, 7, 8).
Кристаллы имеют одинаковую электронную плотность, что отличает их от комплекса кристаллов Bti. У Bti имеется несколько кристаллов в общей оболочке, различающихся по электронной плотности.
Сложное строение кристаллов Bl подтверждено дальнейшими исследованиями.
Область кристаллических включений, видимая при негативном контрастировании, имеет ромбовидную форму, как представлено на рис.9.
Следует заметить, что наблюдаемая область ромбовидной формы размером 320 × 540 нм (рис.9) является не единичным кристаллом, а скорее представляет собой скопление отдельных кристаллов меньшего размера. При этом размеры отдельных кристаллов находятся в диапазоне от 25 до 120 нм. Если рассматривать поверхность одиночного кристалла, то по Фурье-образу заметна скорее гексагональная упаковка белков в кристалле (рис.10). Соответственно, на Фурье-образе наблюдается шесть рефлексов. Рефлексы расположены не на окружности, а на эллипсе. Причинами могут являться два обстоятельства:
белковые молекулы, составляющие кристалл, имеют вытянутую форму;
это аппаратный эффект (артефакт).
Наличие нескольких возможных упаковок белковых кристаллов наблюдается, например, в случае лизоцима. При разных условиях кристаллизации получается тетрагональная или орторомбическая упаковка [12].
В случае кристаллов Bl наличия двух упаковок показывает, что должен более или менее существенно различаться биохимический состав внутреннего компартмента клетки, где происходит кристаллизация. Это наблюдение показывает, что включение Bl сходно с похожим включением Bti.
БЛАГОДАРНОСТИ
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Лондонского Королевского Общества № 21-58-10005, РФФИ, проект № 20-32-90036, РНФ, проект № 20-12-00389. Работа выполнена при финансовой поддержке Фонда содействия инновациям, проект № 71108.
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Bazylinski D.A., Heywood B.R., Mann S., Frankel R.B. Fe304 and Fe3S4 in a bacterium. Natura. 1993. 366, 6452, pp. 218–218.
Bazylinski D.A., Frankel R.B., Heywood B.R., Mann S., King J.W., Donaghay P.L., Hanson A.K. Controlled Biomineralization of Magnetite (Fe(inf3)O(inf4)) and Greigite (Fe(inf3)S(inf4)) in a Magnetotactic Bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 1995. Vol. 61, 9, pp. 3232—3239. https://doi.org/10.1128/aem.61.9.3232–3239.1995
Benintende G., López-Meza J., Cozzi J., Piccinetti C., Ibarra J. Characterization of INTA 51-3, a New Atypical Strain of Bacillus thuringiensis from Argentina. Current Microbiology. 2000. Vol. 41, pp. 396–401. https://doi.org/10.1007/s002840010157
Smirnova T.A., Minenkova I.B., Orlova M.V., Azizbekyan R.R., Lecadet M. The crystal-forming strains of Bacillus laterosporus. Research in Microbiology. 1996. Vol. 147, pp. 343–350. https://doi.org/10.1016/0923-2508(96)84709-7
Goldberg L., Margalit J. A bacterial spore demonstrating rapid larvicidal activity against Anopheles sergentii, Uranotaenia unguiculata, Culex univitatus, Aedes aegypti and Culex pipiens. Mosq. News 1977. Vol. 37, pp. 355–358.
Federici B.A., Park H., Bideshi D.K. Overview of the Basic Biology of Bacillus thuringiensis with Emphasis on Genetic Engineering of Bacterial Larvicides for Mosquito Control. The Open Toxinology Journal. 2010. Vol. 3, pp. 154–171.
Ben-Dov E. Bacillus thuringiensis subsp. israelensis and Its Dipteran-Specific Toxins. Toxins. 2014. Vol. 6, no. 4, pp. 1222–1243. https://doi.org/10.3390/toxins6041222
Insell J.P., Fitz-James P.C. Composition and Toxicity of the Inclusion of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis. Appl. Environ. Microbiol. 1985. Vol. 50, no. 1, pp. 56–62.
Zubasheva M., Smirnov Yu., Smirnova T., Azizbekyan R., Zhukhovitsky V., Yaminsky I. Nanostructure of protein crystals of Brevibacillus laterosporus bacteria. Nanoindustry. 2020. Vol. 13, no. 2, pp. 126–131. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2020.13.2.126.131
Ito S., Karnovsky M. Formaldehide glutaraldehyde fixatives containing trinitrocompound. J. Cell biol. 1969, Vol. 39, pp. 168a–169a.
Yaminsky I.V., Filonov A.S., Sinitsyna O.V., Meshkov G.B. FemtoScan Online software. Nanoindustry. 2016. no. 2, vol. 64. PP. 42–46. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2016.64.2.42.46
Yaminsky I.V., Gvozdev N.V., Sil’nikova M.I., Rashkovich L.N. Atomic force microscopy study of lysozyme crystallization. Crystallography Reports. 2002. Vol. 47, pp. S149–S158. https://doi.org/10.1134/1.1529969
Научная статья
КРИСТАЛЛООБРАЗОВАНИЕ В БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ BREVIBACILLUS LATEROSPORUS
М.В.Зубашева1, к.б.н., науч. сотр., ORCID: 0000-0001-7330-7343
А.И.Ахметова2, 3, инженер НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ, ведущий специалист Центра перспективных технологий, ORCID: 0000-0002-5115-8030
Т.А.Смирнова1, д.б.н., вед. науч. сотр., ORCID: 0000-0001-7121-635Х
Н.В.Шевлягина1, к.м.н., ст. науч. сотр., ORCID: 0000-0001-9651-1654
Ю.А.Смирнов1, д.м.н., проф., вед. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-2215-5420
В.Г.Жуховицкий1, 4, к.м.н., руководитель лаб., ORCID: 0000-0002-4653-2446
И.В.Яминский2, 3, д.ф.-м.н., проф. физического и химического факультетов МГУ имени М. В.Ломоносова, директор Центра перспективных технологий, ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Аннотация. Бациллы Brevibacillus laterosporus (Вl) являются перспективным источником бактериальных инсектицидов. Способность к кристаллообразованию у бактерий Bl до недавнего времени не была установлена. Методами сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии охарактеризованы бактериальные клетки Brevibacillus laterosporus. Изучено образование в бактериях белковых кристаллов от первых этапов зарождения в клетках и до стадии появления свободных кристаллов. Получены изображения кристаллов с молекулярным разрешением и определены параметры кристаллической решетки. В случае энтомоцидных бацилл в клетках образуются кристаллические белковые токсины, которые приводят к гибели насекомых после поглощения ими бактерий. Таков механизм защиты этих бактериальных клеток. В этом случае кристаллы выполняют защитную функцию живых организмов.
Ключевые слова: Brevibacillus laterosporus, просвечивающая электронная микроскопия, образование кристаллов, споры, токсины, защитная функция
Для цитирования: М.В. Зубашева, А.И. Ахметова, Т.А. Смирнова, Н.В. Шевлягина, Ю.А. Смирнов, В.Г. Жуховицкий, И.В. Яминский. Кристаллообразование в бактериальных клетках Brevibacillus laterosporus. НАНОИНДУСТРИЯ. 2022. Т. 15, № 5. С.254–261. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2022.15.5.254.261
Received: 11.08.2022 | Accepted: 17.08.2022 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2022.15.5.254.261
Original paper
CRYSTAL FORMATION IN BACTERIAL CELLS OF BREVIBACILLUS LATEROSPORUS
M.V.Zubasheva1, Cand. of Sci. (Biology), Researcher, ORCID: 0000-0001-7330-7343
A.I.Akhmetova2, 3, Engineer of A.N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Leading Specialist of Advanced Technologies Center, ORCID: 0000-0002-5115-8030
Т.А.Smirnova1, Doct. of Sci. (Biology), Leading Researcher, ORCID: 0000-0001-7121-635Х
N.V.Shevlyagina1, Cand. of Sci. (Medical), Senior Researcher, ORCID: 0000-0001-9651-1654
Yu.A.Smirnov1, Doct. of Sci. (Medical), Prof., Leading Researcher, ORCID: 0000-0002-2215-5420
V.G.Zhukhovitsky1, 4, Cand. of Sci. (Medical), Head of Laboratory ORCID: 0000-0002-4653-2446
I.V.Yaminsky2, 3, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Prof. of Lomonosov Moscow State University, Physical and Chemical departments, Director of Advanced Technologies Center, ORCID: 0000-0001-8731-3947 / yaminsky@nanoscopy.ru
Abstract. Bacillus Brevibacillus laterosporus (Bl) is a promising source of bacterial insecticides. The crystal-forming ability of Bl bacteria has not been established until recently. Bacterial cells of Brevibacillus laterosporus were characterized with the aid of scanning and transmission electron microscopy. The formation of protein crystals in bacteria from the first stages of nucleation in the cells up to the stage of free crystals was studied. Molecular resolution images of the crystals have been obtained and the crystal lattice parameters have been determined. In the case of entomocidal bacilli, crystalline protein toxins are formed in the cells, which lead to death of insects after absorption by the bacteria. This is the defense mechanism of these bacterial cells. In such case, the crystals perform the protective function of living organisms.
Keywords: Brevibacillus laterosporus, transmission electron microscopy, crystal formation, spores, toxins, protective function
For citation: M.V. Zubasheva, A.I. Akhmetova, Т.А. Smirnova, N.V. Shevlyagina, Yu.A. Smirnov, V.G. Zhukhovitsky, I.V. Yaminsky. Crystal formation in bacterial cells of Brevibacillus laterosporus. NANOINDUSTRY. 2022. V. 15, no. 5. PP.254–261. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2022.15.5.254.261
ВВЕДЕНИЕ
Образование кристаллов или кристаллических включений является редким явлением в живой природе. В основном кристаллы образуются в неживой природе. Они представляют собой кристаллические породы, драгоценные камни и др. Углерод имеет несколько кристаллических форм – алмаз, графит, а также мелкокристаллический порошок карбин. Образование кристаллов происходит при суммарном уменьшении энергии строительных единиц – атомов или молекул – в кристалле по сравнению с их энергией в растворе. Может происходить и обратный процесс, растворение кристаллов, если в растворе наблюдается явный недостаток растворенного вещества. Кристаллы присутствуют в живой природе, например, в магнитотактических бактериях синтезируются магнитные кристаллы оксида или сульфида железа. Размеры кристаллов находятся в диапазоне 25–130 нм [1, 2]. Эти кристаллы обеспечивают защитные функции у бактерий за счет присутствия токсичного двухвалентного иона. Среда обитания этих бактерий содержит избыток железа. Эти бактерии перемещаются вдоль силовых линий магнитного поля. Магнитные кристаллы действуют, как магнитная стрелка.
Наиболее хорошо изучены кристаллы Bacillus thuringiensis (Bt) в связи с их энтомоцидной активностью против чешуекрылых (Lepidoptera), двукрылых (Diptera), жесткокрылых (Coleoptera) насекомых. Изучение энтомоцидных кристаллов Bt обнаружило несколько их основных морфологических типов: бипирамидальный, сферическо-аморфный, плоский квадратный, кубический, палочковидный. Большинство кристаллов, активных против лепидоптера, имели бипирамидальную или кубическую форму. Иррегулярные, сферические и палочковидные кристаллы могли быть москитоцидными. Плоские, квадратные кристаллы активны против Coleoptera [3]. Cпоры и кристаллы Bt применяются для борьбы с насекомыми-вредителями. Однако препараты на их основе не полностью отвечают необходимым требованиям. В настоящее время проводится поиск и изучение других экологически безопасных бактериальных препаратов.
Бациллы Brevibacillus laterosporus (Bl), в отличие от Bt, относятся к малоизученным энтомопатогенным бактериям. Их отличительная особенность – наличие каноэвидного включения, прикрепленного к споре. Ранее нами были изучены и охарактеризованы штаммы Bl, способные образовывать параспоральные кристаллы [4]. У исследованных штаммов Bl удалось обнаружить кристаллические включения, различающиеся по форме и размерам, подобные тем, что описаны для энтомопатогенных бактерий Bt. Наибольшая активность у Bl выявлена против насекомых отряда двукрылых (Díptera). К этому отряду относятся комары родов Aedes, Anopheles, Culex и черные мушки (Simulium vittatum). Многие виды комаров являются переносчиками возбудителей малярии, желтой лихорадки, лихорадки денге, геморрагической лихорадки и лимфатического филяриаоза. Синтетические инсектициды оказывают неблагоприятное воздействие на человека и природу. Кроме того, обнаружена устойчивость к таким инсектицидам у комаров, являющихся переносчиками патогенов.
Альтернативой для решения этих проблем и ограничений является биологический контроль с помощью энтомопатогенных бактерий. Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (Bti) оказался первым подвидом Bt, токсичным для двукрылых [5]. Исследование природы инсектицидных факторов показало, что насекомые отряда двукрылых (Diptera) комары и черные мушки чувствительны к параспоральному включению Bti, которое состоит из четырех белков Cry4Aa, Cry4Ba, Cry11Aa, Cyt1Aa [6]. Ben-Dov [7] сообщил, что ларвицидная активность заключается в четырех основных (134, 128, 72 и 27 кДа) и, по крайней мере, двух второстепенных (78 и 29 кДа) полипептидах, кодируемых генами cry4Aa, cry4Ba, cry11Aa, cyt1Aa, cry10Aa и cyt2Ba, картированных на плазмиде размером 128 т.п.н., известной как pBtoxis. Эти δ-эндотоксины образуют сложное параспоральное кристаллическое тело с чрезвычайно высокой специфичностью. Электронная микроскопия показала, что клетки Bti образуют включения, которые состоят из различных сегментов, осмиофобного или слегка окрашенного, кристаллизованного в виде решетки с периодом 4,3 нм и осмиофильного окрашенного сегмента с кристаллической решеткой с периодом 7,8 нм. Комплекс из нескольких кристаллов заключен в общую оболочку [8].
Кристаллические включения Bl могут иметь кубическую форму. О кубической форме кристаллов мы писали ранее [9]. В настоящей статье мы приводим результаты изучения ромбических кристаллов в клетках Bl. Данная работа посвящена изучению процесса кристаллообразования у Bl при споруляции, а также анализу структуры кристаллов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штамм B. laterosporus (Bl) 16–92 был выделен из погибшего насекомого.
Штамм выращивали на агаризованной среде NBY в течение 48–96 ч при 30 °С.
Электронная микроскопия.
Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ).
Нативную споро-кристаллическую суспензию исследовали с помощью электронно-ионного сканирующего микроскопа Quanta 2003D (FEI Compani, USA). Образцы нативной суспензии помещали на кремниевую подложку, которую с помощью углеродного скотча фиксировали к алюминиевому столику. Препараты исследовали в режиме высокого и низкого вакуума. Поверхность образца сканировали при ускоряющем напряжении 5–30 кВ.
Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)
Бациллы штамма 16–92 смывали с агара и фиксировали сначала по методу Ито-Карновски [10]. Затем материал фиксировали в 1% ОsО4 растворе на 0,2 М какодилатном буфере и в 1% растворе уранилацетата на 0,2 М малеатном буфере. Материал обезвоживали в спиртах с концентрациями 50°, 70°, 96°, 100°, далее помещали в смесь 100° спирта со смолой LR White, а затем в чистую смолу LR White. Материал переносили в желатиновые капсулы, которые помещали в термостат при 56 °C. Срезы получали на ультратоме LKB III (LKB, Sweden) и контрастировали 1% раствором уранилацетата в 70° спирте и лимоннокислым свинцом. Суспензию спор и кристаллов для исследования методом негативного контрастирования наносили на сетки, покрытые углеродной пленкой, и окрашивали 2% водным раствором NANOWtm. Препараты исследовали на электронных микроскопах JEM -100 B и LEO912AB.
Обработка изображений проведена в программном обеспечении "ФемтоСкан Онлайн" [11]. Для определения параметров кристаллической решетки наблюдаемых кристаллов использовано двумерное Фурье-преобразование.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Было изучено кристаллобразование у Bl: от первых этапов и до стадии появления свободных кристаллов. Для обнаружения кристаллов споро-кристаллическую суспензию штамма 16–92 исследовали с помощью СЭМ. На рис.1 видны зрелые споры с каноэвидным включением и ромбические кристаллы. Кристаллы были связаны со спорами либо находились в свободном состоянии.
Электронно-микроскопическое изучение ультратонких срезов штамма Bl 16–92 методом ПЭМ показало, что растущие, делящиеся клетки не содержали кристаллов. Кристаллы появлялись в вегетативных клетках до вхождения в стадию споруляции. В дальнейшем кристаллообразующие клетки проходили все этапы спорообразования. На рис.2 видна проспора, на некотором расстоянии от которой находится ромбовидный кристалл. У Bl кристаллы формируются без связи со споровыми структурами. Около кристалла наблюдается разряженность цитоплазмы.
Лизис цитоплазмы спорангия вокруг споры и кристалла нарастает по мере созревания споры. Наряду с кристаллическим включением наблюдается разрастание пластинчатого каноэвидного включения. На рис.3 видно, что цитоплазма спорангия полностью лизирована, а клеточная оболочка у большей части спор сохранена, но у некоторых частично разрушена. На рис.4 видны спора с каноэвидным включением и кристалл после выхода из спорангия. Как и у Bt, при лизисе спорангия споры и кристаллы Bl освобождаются раздельно.
В некоторых клетках Bl образуется по два и более кристаллов. Это видно на рис.5: различим кристалл сложного строения.
Кристаллы заключены в общую оболочку (рис.5, 6, 7, 8).
Кристаллы имеют одинаковую электронную плотность, что отличает их от комплекса кристаллов Bti. У Bti имеется несколько кристаллов в общей оболочке, различающихся по электронной плотности.
Сложное строение кристаллов Bl подтверждено дальнейшими исследованиями.
Область кристаллических включений, видимая при негативном контрастировании, имеет ромбовидную форму, как представлено на рис.9.
Следует заметить, что наблюдаемая область ромбовидной формы размером 320 × 540 нм (рис.9) является не единичным кристаллом, а скорее представляет собой скопление отдельных кристаллов меньшего размера. При этом размеры отдельных кристаллов находятся в диапазоне от 25 до 120 нм. Если рассматривать поверхность одиночного кристалла, то по Фурье-образу заметна скорее гексагональная упаковка белков в кристалле (рис.10). Соответственно, на Фурье-образе наблюдается шесть рефлексов. Рефлексы расположены не на окружности, а на эллипсе. Причинами могут являться два обстоятельства:
белковые молекулы, составляющие кристалл, имеют вытянутую форму;
это аппаратный эффект (артефакт).
Наличие нескольких возможных упаковок белковых кристаллов наблюдается, например, в случае лизоцима. При разных условиях кристаллизации получается тетрагональная или орторомбическая упаковка [12].
В случае кристаллов Bl наличия двух упаковок показывает, что должен более или менее существенно различаться биохимический состав внутреннего компартмента клетки, где происходит кристаллизация. Это наблюдение показывает, что включение Bl сходно с похожим включением Bti.
БЛАГОДАРНОСТИ
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Лондонского Королевского Общества № 21-58-10005, РФФИ, проект № 20-32-90036, РНФ, проект № 20-12-00389. Работа выполнена при финансовой поддержке Фонда содействия инновациям, проект № 71108.
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Bazylinski D.A., Heywood B.R., Mann S., Frankel R.B. Fe304 and Fe3S4 in a bacterium. Natura. 1993. 366, 6452, pp. 218–218.
Bazylinski D.A., Frankel R.B., Heywood B.R., Mann S., King J.W., Donaghay P.L., Hanson A.K. Controlled Biomineralization of Magnetite (Fe(inf3)O(inf4)) and Greigite (Fe(inf3)S(inf4)) in a Magnetotactic Bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 1995. Vol. 61, 9, pp. 3232—3239. https://doi.org/10.1128/aem.61.9.3232–3239.1995
Benintende G., López-Meza J., Cozzi J., Piccinetti C., Ibarra J. Characterization of INTA 51-3, a New Atypical Strain of Bacillus thuringiensis from Argentina. Current Microbiology. 2000. Vol. 41, pp. 396–401. https://doi.org/10.1007/s002840010157
Smirnova T.A., Minenkova I.B., Orlova M.V., Azizbekyan R.R., Lecadet M. The crystal-forming strains of Bacillus laterosporus. Research in Microbiology. 1996. Vol. 147, pp. 343–350. https://doi.org/10.1016/0923-2508(96)84709-7
Goldberg L., Margalit J. A bacterial spore demonstrating rapid larvicidal activity against Anopheles sergentii, Uranotaenia unguiculata, Culex univitatus, Aedes aegypti and Culex pipiens. Mosq. News 1977. Vol. 37, pp. 355–358.
Federici B.A., Park H., Bideshi D.K. Overview of the Basic Biology of Bacillus thuringiensis with Emphasis on Genetic Engineering of Bacterial Larvicides for Mosquito Control. The Open Toxinology Journal. 2010. Vol. 3, pp. 154–171.
Ben-Dov E. Bacillus thuringiensis subsp. israelensis and Its Dipteran-Specific Toxins. Toxins. 2014. Vol. 6, no. 4, pp. 1222–1243. https://doi.org/10.3390/toxins6041222
Insell J.P., Fitz-James P.C. Composition and Toxicity of the Inclusion of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis. Appl. Environ. Microbiol. 1985. Vol. 50, no. 1, pp. 56–62.
Zubasheva M., Smirnov Yu., Smirnova T., Azizbekyan R., Zhukhovitsky V., Yaminsky I. Nanostructure of protein crystals of Brevibacillus laterosporus bacteria. Nanoindustry. 2020. Vol. 13, no. 2, pp. 126–131. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2020.13.2.126.131
Ito S., Karnovsky M. Formaldehide glutaraldehyde fixatives containing trinitrocompound. J. Cell biol. 1969, Vol. 39, pp. 168a–169a.
Yaminsky I.V., Filonov A.S., Sinitsyna O.V., Meshkov G.B. FemtoScan Online software. Nanoindustry. 2016. no. 2, vol. 64. PP. 42–46. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2016.64.2.42.46
Yaminsky I.V., Gvozdev N.V., Sil’nikova M.I., Rashkovich L.N. Atomic force microscopy study of lysozyme crystallization. Crystallography Reports. 2002. Vol. 47, pp. S149–S158. https://doi.org/10.1134/1.1529969
Отзывы читателей
