eng
Выпуск #3-4/2025
В.С.Зиборов, И.Д.Шумов, Е.Е.Важенкова, А.Н.Аблеев, А.Ф.Козлов, А.В.Виноградова, Е.Д.Неведрова, О.Н.Афонин, В.Ю.Татур, А.А.Лукьяница, А.В.Щербаков, Н.Д.Иванова, Е.С.Юшков, Д.В.Еникеев, Ю.Д.Иванов
ВЛИЯНИЕ КАВИТИРОВАННОЙ ВОДЫ НА ФИЗИКО- ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА, ИССЛЕДОВАННОЕ НА УРОВНЕ ЕДИНИЧНЫХ МОЛЕКУЛ ФЕРМЕНТА. ИЗМЕНЕНИЕ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТА ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ КАВИТАЦИИ
ВЛИЯНИЕ КАВИТИРОВАННОЙ ВОДЫ НА ФИЗИКО- ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА, ИССЛЕДОВАННОЕ НА УРОВНЕ ЕДИНИЧНЫХ МОЛЕКУЛ ФЕРМЕНТА. ИЗМЕНЕНИЕ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТА ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ КАВИТАЦИИ
Просмотры: 1059
DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.3-4.184.192
Методами атомно-силовой микроскопии (АСМ) и спектрофотометрии (СФ) исследован эффект воздействия воды, подвергнутой кавитации, на фермент пероксидазы хрена (ПХ). Методом АСМ обнаружено существенное изменение адсорбции ПХ на свежесколотой слюде после выдержки раствора фермента в воде, подвергнутой кавитации, по сравнению с контрольным образцом фермента. По данным СФ, ферментативная активность ПХ при этом не изменялась. Обнаруженный эффект полезно принимать во внимание при работе с ферментами на промышленном и исследовательском оборудовании, в котором может иметь место возникновение кавитации в потоке водной среды.
Методами атомно-силовой микроскопии (АСМ) и спектрофотометрии (СФ) исследован эффект воздействия воды, подвергнутой кавитации, на фермент пероксидазы хрена (ПХ). Методом АСМ обнаружено существенное изменение адсорбции ПХ на свежесколотой слюде после выдержки раствора фермента в воде, подвергнутой кавитации, по сравнению с контрольным образцом фермента. По данным СФ, ферментативная активность ПХ при этом не изменялась. Обнаруженный эффект полезно принимать во внимание при работе с ферментами на промышленном и исследовательском оборудовании, в котором может иметь место возникновение кавитации в потоке водной среды.
Теги: cavitation enzyme adsorption horseradish peroxidase адсорбция фермента кавитация пероксидаза хрена
Получено: 28.03.2025 г. | Принято: 3.04.2025 г. | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.3-4.184.192
Научная статья
ВЛИЯНИЕ КАВИТИРОВАННОЙ ВОДЫ НА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА, ИССЛЕДОВАННОЕ НА УРОВНЕ ЕДИНИЧНЫХ МОЛЕКУЛ ФЕРМЕНТА. ИЗМЕНЕНИЕ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТА ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ КАВИТАЦИИ
В.С.Зиборов1, 2, к.ф.-м.н., ст. науч. сотр., ORCID: 0000-0001-7942-3337
И.Д.Шумов1, к.б.н., науч. сотр., ORCID: 0000-0002-9795-7065 / shum230988@yandex.ru
Е.Е.Важенкова1, лаб., ORCID: 0009-0001-4224-8907
А.Н.Аблеев1, вед. инж., ORCID: 0009-0004-3096-107X
А.Ф.Козлов1, вед. инж., ORCID: 0000-0002-2117-8743
А.В.Виноградова1, мл. науч. сотр., ORCID: 0009-0001-6044-3490
Е.Д.Неведрова1, мл. науч. сотр., ORCID: 0000-0003-2767-2299
О.Н.Афонин1, к.т.н., ст. науч. сотр., ORCID: 0009-0008-7947-3674
В.Ю.Татур3, исп. дир., ORCID: 0000-0002-6415-5189
А.А.Лукьяница3, 4, д.т.н., вед. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-0517-0602
А.В.Щербаков5, ген. дир., ORCID: 0000-0002-8067-4624
Н.Д.Иванова6, преп., ORCID: 0000-0001-5942-8050
Е.С.Юшков7, к.т.н., доц., ORCID: 0009-0002-9161-0877
Д.В.Еникеев8, д.м.н., проф., хирург-уролог, ORCID: 0000-0001-7169-2209
Ю.Д.Иванов1, 2, д.б.н., проф., зав. лаб. ORCID: 0000-0001-5041-1914
Аннотация. Методами атомно-силовой микроскопии (АСМ) и спектрофотометрии (СФ) исследован эффект воздействия воды, подвергнутой кавитации, на фермент пероксидазы хрена (ПХ). Методом АСМ обнаружено существенное изменение адсорбции ПХ на свежесколотой слюде после выдержки раствора фермента в воде, подвергнутой кавитации, по сравнению с контрольным образцом фермента. По данным СФ, ферментативная активность ПХ при этом не изменялась. Обнаруженный эффект полезно принимать во внимание при работе с ферментами на промышленном и исследовательском оборудовании, в котором может иметь место возникновение кавитации в потоке водной среды.
Ключевые слова: пероксидаза хрена, кавитация, адсорбция фермента
Для цитирования: В.С. Зиборов, И.Д. Шумов, Е.Е. Важенкова, А.Н. Аблеев, А.Ф. Козлов, А.В. Виноградова, Е.Д. Неведрова, О.Н. Афонин, В.Ю. Татур, А.А. Лукьяница, А.В. Щербаков, Н.Д. Иванова, Е.С. Юшков, Д.В. Еникеев, Ю.Д. Иванов. Влияние кавитированной воды на физико-химические свойства пероксидазы хрена, исследованное на уровне единичных молекул фермента. Изменение свойств фермента под воздействием кавитации. НАНОИНДУСТРИЯ. 2025. Т. 18. № 3–4. С. 184–192. https://doi.org/
10.22184/1993-8578.2025.18.3-4.184.192.
Received: 28.03.2025 | Accepted: 3.04.2025 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.3-4.184.192
Original paper
THE EFFECT OF CAVITED WATER ON PHYSICOCHEMICAL PROPERTIES OF HORSERADISH PEROXIDASE AS STUDIED AT THE LEVEL OF SINGLE ENZYME MOLECULES. CHANGE OF ENZYME PROPERTIES UNDER THE INFLUENCE OF CAVITATION
V.S.Ziborov1, 2, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Senior Researcher, ORCID: 0000-0001-7942-3337
I.D.Shumov1, Cand. of Sci. (Biology), Researcher, ORCID: 0000-0002-9795-7065 / shum230988@yandex.ru
E.E.Vazhenkova1, Laboratory assistant, ORCID: 0009-0001-4224-8907
A.N.Ableev1, Leading Engineer, ORCID: 0009-0004-3096-107X
A.F.Kozlov1, Leading Engineer, ORCID: 0000-0002-2117-8743
A.V.Vinogradova1, Junior Researcher, ORCID: 0009-0001-6044-3490
E.D.Nevedrova1, Junior Researcher, ORCID: 0000-0003-2767-2299
O.N.Afonin1, Cand. of Sci. (Tech), Senior Researcher, ORCID: 0009-0008-7947-3674
V.Yu.Tatur3, Executive Director, ORCID: 0000-0002-6415-5189
A.A.Lukyanitsa3, 4, Doct. of Sci. (Tech), Leading Researcher, ORCID: 0000-0002-0517-0602
A.V.Shcherbakov5, Director General, ORCID: 0000-0002-8067-4624
N.D.Ivanova6, Lecturer, ORCID: 0000-0001-5942-8050
E.S.Yushkov7, Cand. of Sci. (Tech), Prof., ORCID: 0009-0002-9161-0877
D.V.Enikeev8, Doct. of Sci. (Medicine), Prof., Urologist surgeon, ORCID: 0000-0001-7169-2209
Yu.D.Ivanov1, 2, Doct. of Sci. (Biology), Prof., Head of Laboratory, ORCID: 0000-0001-5041-1914
Abstract. The effect of water subjected to cavitation on horseradish peroxidase (HRP) enzyme is studied using atomic force microscopy (AFM) and spectrophotometry (SP). By AFM, a significant change in the adsorption of HRP on freshly cleaved mica after keeping the enzyme solution in water subjected to cavitation, is found – as compared to the control enzyme sample. According to SP, the enzymatic activity of HRP does not change. The effect observed is useful to take into account when working with enzymes on industrial and research equipment, in which cavitation may occur in the flow of an aqueous medium.
Keywords: horseradish peroxidase, cavitation, enzyme adsorption
For citation: V.S. Ziborov, I.D. Shumov, E.E. Vazhenkova, A.N. Ableev, A.F. Kozlov, A.V. Vinogradova, E.D. Nevedrova, O.N. Afonin, V.Yu. Tatur, A.A. Lukyanitsa, A.V. Shcherbakov, N.D. Ivanova, E.S. Yushkov, D.V. Enikeev, Yu.D. Ivanov. The effect of cavited water on physicochemical properties of horseradish peroxidase as studied at the level of single enzyme molecules. Change of enzyme properties under the influence of cavitation. NANOINDUSTRY. 2025. Vol. 18. No. 3–4. PP. 184–192. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.3-4.184.192.
ВВЕДЕНИЕ
Вода является основным компонентом живых систем [1]. Вследствие этого, вода широко используется как в биотехнологии, так и в исследованиях в области биомедицины как в качестве основного компонента обрабатываемых/исследуемых сред, так и в качестве теплоносителя [2, 3]. Так, в настоящее время разрабатываются технологии на базе высокопроизводительных систем очистки воды, а также организации терморегуляции и приготовления растворов на базе гидродинамических генераторов. Использование кавитационных генераторов для этих целей является эффективным и малоэнергоемким [4–6].
Ранее было показано, что кавитационная обработка воды приводит к изменению ее физико-химических свойств (электропроводности, окислительно-восстановительного потенциала и других параметров) [6]. Соответственно, использование такой воды в биомедицинском исследовательском либо в биотехнологическом оборудовании предполагает возможное влияние этой воды на свойства используемых в этом оборудовании биологических макромолекул (в частности, ферментов).
Интересно отметить, что ранее на примере пероксидазы хрена (ПХ) было экспериментально продемонстрировано влияние движения воды [7, 8] и неводной жидкости (глицерина) на свойства фермента [9–11]. В случае неводной жидкости (глицерина) было также обнаружено влияние движения жидкости на свойства ПХ в случае, когда поток глицерина был остановлен, но все равно наблюдалось влияние на фермент [12], а также наличие пост-эффекта движения неводной жидкости при ее движении во входной [13] и выходной [14] прямолинейных секций змеевикового теплообменника. Помимо этого, электромагнитные поля также оказывают заметное влияние на физико-химические свойства ПХ [15–25].
В настоящей работе исследовано влияние воды, подвергнутой кавитации, на свойства фермента на примере ПХ. Исследование проводили как методом АСМ на уровне единичных молекул фермента, так и методом спектрофотометрии (СФ). Было показано, что инкубация пробирки с раствором ПХ в воде, подвергнутой кавитации (кавитационной/кавитированной воде), приводит к существенному изменению адсорбционной способности фермента на поверхность свежесколотой слюды, а именно, к меньшей адсорбции белка по сравнению с контрольными образцами, не подвергнутыми инкубации в кавитационной воде. Более того, было продемонстрировано существование пост-эффекта от кавитационной воды на адсорбцию ПХ. Методом СФ было обнаружено, что ферментативная активность ПХ в реакции окисления его субстрата (2,2′-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната), АБТС) в присутствии H2O2 не изменялась ни во время инкубации раствора фермента в воде, подвергнутой кавитации, ни после удаления этой воды.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Использованные реактивы
Аналогично работам [7–25], в настоящей работе использовали белок ПХ, выделенный из хрена (Sigma, Cat. #6782). 2,2′-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат) (АБТС) был также приобретен в Sigma (Cat. #A-1888). Пероксид водорода (H2O2, ч.д.а.), лимонная кислота (ос.ч.) и однозамещенный фосфат натрия (Na2HPO4, ч.д.а.) были приобретены в Реахим (Москва). 2 мМ фосфатно-солевой буфер в модификации Дульбекко (ФСБ-Д; pH 7,4) готовили путем растворения готовой смеси солей (Pierce, США) в ультрачистой деионизированной воде. Все растворы, использованные в экспериментах, готовили, используя ультрачистую воду (18.2 MОм × см), очищенную с помощью установки Simplicity UV (Millipore, Франция).
Эксперименты на гидродинамическом генераторе
Для получения кавитационной воды использовали гидродинамический генератор (ГДГ), изготовленный в ООО "НПО "Курс" (Россия). ГДГ состоит из статора и ротора, изготовленных из пищевой нержавеющей стали. Основные параметры ГДГ: мощность электродвигателя 7,5 кВт, частота вращения ротора 4800 об/мин, объем рабочей камеры 0,3 л, число кавитации ~0,5. В процессе кавитационной обработки вода нагревалась до 62 °С. Фотоизображение установки на базе гидродинамического генератора представлено на рис.1.
Инкубация фермента в кавитационной воде
Для исследования воздействия кавитационной воды на ПХ 1 мл 10–7 М раствора этого фермента в 2 мМ ФСБ-Д (рабочий раствор ПХ) помещали в одноразовую полипропиленовую пробирку с раствором белка номинальным объемом 1,7 мл. Эту пробирку помещали в стеклянный стакан объемом 3 л, наполненный кавитационной водой (рис.2), где выдерживали при температуре 23 °С в течение 3 ч.
После этого кавитационную воду удаляли, и на место стакана с кавитационной водой устанавливали другую пробирку с образцом раствора ПХ для исследования пост-эффекта. Ее также выдерживали в течение 3 ч. Эти образцы затем исследовали методами АСМ и СФ.
Контрольные эксперименты
Контрольный образец 10–7 М раствора фермента в том же буфере (ФСБ-Д) объемом 1 мл помещали в такую же пробирку, как и рабочий раствор ПХ. Контрольный образец ПХ выдерживали на большом удалении (10 м) от зоны эксперимента с кавитационной водой в течение 3 ч. Этот контрольный образец затем также исследовали методами АСМ и СФ.
Измерения методом АСМ
Адсорбционные свойства ПХ исследовали с помощью АСМ на подложках из свежесколотой слюды. Для этого использовали метод непосредственной адсорбции [26] ПХ из исследуемых образцов на поверхность подложек, как описано в наших предыдущих работах [7–25]. Поверхность подложек визуализировали методом АСМ в полуконтактном режиме на воздухе при температуре 25 °С с помощью атомно-силового микроскопа NTEGRA PRIMA (NT-MDT, Зеленоград, Россия) с кантилеверами NSG10 ("ТипсНано", Зеленоград, Россия; резонансная частота 47–150 кГц, силовая постоянная от 0,35 до 6,1 Н/м). Площадь скана составляла 2 × 2 мкм (256 × 256 точек). Для каждого образца было сделано не менее 25 сканов в разных участках поверхности подложки. Калибровку микроскопа по высоте проводили по калибровочной решетке aTGZ1 (НТ-МДТ, Россия, высота шага 21,4 ± 1,5 нм). Общее число объектов, визуализированных на АСМ-изображениях для каждого образца, составляло не менее 200.
Гистограмму распределения абсолютного числа адсорбированных на подложке объектов по высотам N400(h) рассчитывали по ранее описанной методике [27].
Спектрофотометрические измерения
Ферментативную активность ПХ определяли методом СФ согласно методике Sanders et al. [28], как описано в наших предыдущих публикациях [7, 8, 10–25]. СФ измерения выполняли на спектрофотометре модели 8453 (Agilent Deutschland GmbH, Вальдбронн, Германия). В экспериментах использовали раствор, содержащий 10–9 М ПХ, 0,3 мМ ее субстрата АБТС и 2,5 мМ H2O2 в фосфатно-цитратном буфере (51 мМ Na2HPO4, 24 мМ лимонной кислоты, pH 5 [28]). Регистрировали зависимости поглощения этого раствора A405 при длине волны 405 нм от времени (t) в течение t = 5 мин. Измерения проводили в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см (Agilent Deutschland GmbH, Вальдбронн, Германия). Для проведения измерений 30 мкл 0,1 мкМ (10–7 М) исследуемого образца ПХ добавляли в кварцевую кювету, содержащую 2,95 мл вышеописанного буфера, содержащего субстрат АБТС, и тщательно перемешивали. Затем в кювету добавляли 8 мкл 3% (масс./масс.) H2O2 и мгновенно начинали регистрацию зависимости поглощения A405(t) исследуемого раствора от времени.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рис.3 показаны типичные АСМ-изображения поверхности подложек из свежесколотой слюды, инкубированных в рабочих и контрольном образцах раствора ПХ.
Из АСМ-изображений, представленных на рис.3, видно, что число объектов, адсорбированных на поверхность свежесколотой слюды из рабочих растворов ПХ, было незначительным. Для точной оценки количества и высот адсорбированных на слюде частиц ПХ требуется точный подсчет индивидуальных адсорбированных на слюде частиц и анализ распределения абсолютного числа визуализированных объектов по высотам N400(h), которое представлено на рис.4.
Представленная на рис.4 гистограмма четко показывает резкое уменьшение числа частиц ПХ, адсорбированных на слюде из рабочих растворов ПХ (красные и зеленые столбцы) относительно такового в случае контрольного раствора фермента (синие столбцы).
А именно, анализ гистограммы N400(h) показал, что из контрольного образца раствора фермента, инкубированного в 10 м от сосуда с кавитационной водой, адсорбировалось N400 = 2466 частиц/400 мкм2 (рис.4, синие столбцы). В то же время из раствора ПХ, инкубированного непосредственно в сосуде с кавитационной водой, адсорбировалось лишь 956 частиц/400 мкм2 (рис.4, красные столбцы). При этом из всех исследованных образцов фермент адсорбировался на слюду в виде смеси его мономерной и олигомерной форм. В нашей пионерской работе [25] было показано, что объекты с высотами ~ 1 нм следует относить к макромолекулам ПХ, адсорбированным в мономерной форме, в то время как объекты с большей высотой представляют собой олигомеры этого фермента.
Более того, для условий, когда сосуд с кавитационной водой был убран, а на его месте располагали пробирку с раствором фермента, наблюдалось фактически полное отсутствие адсорбции ПХ на слюду. В самом деле, абсолютное количество визуализированных на слюде частиц в этом случае составило лишь 356 частиц/400 мкм2 (зеленые столбцы) практически уменьшившись до фонового значения, составляющего для АСМ-измерений на слюде 500 частиц/400 мкм2 [29].
Отметим, что ферментативная активность ПХ после трех часов инкубации образца фермента как в сосуде с кавитационной водой, так и на месте его практически не изменялась относительно активности контрольного образца, что наглядно иллюстрируется полученными зависимостями A405(t), представленными на рис.5.
ОБСУЖДЕНИЕ
В работе были проведены исследования влияния воды, подвергшейся кавитации, на погруженный в нее раствор фермента ПХ путем подсчета количества частиц фермента, адсорбированных на свежесколотую слюду, и анализа распределения этих частиц по их высотам на основе анализа данных, полученных методом АСМ [7–25]. По сравнению с контрольным образцом раствора ПХ, для растворов фермента, инкубированных в кавитационной воде, наблюдалось значительное изменение в адсорбционных свойствах фермента на слюде. А именно, наблюдалась пониженная адсорбция белка на поверхности слюды – до 956 частиц/400 мкм2. В условиях, когда этот сосуд с кавитационной водой удаляли, а на его месте располагали другой образец раствора фермента, наблюдалось еще большее уменьшение адсорбции белка практически до фоновых значений <500 частиц/400 мкм2 (т.е. до уровня шума, типичного для АСМ-экспериментов [29]). Наблюдаемый эффект можно объяснить следующим образом.
Известно, что вода является неравновесной системой в плане ее спинового состояния, а именно, для воды характерно определенное соотношение орто- и параизомеров [30]. Отмечено, что после испарения воды в кавитационном фонтане и последующей конденсации центры колебательной OH-полосы воды смещаются в сторону высоких частот на 10–12 см–1 [31]. Подобное смещение наблюдалось и для коммерческой воды Penta, которая после дистилляции подвергалась кавитационной обработке и разливалась в бутылки. Такой сдвиг указывает на перегрев воды на 10–12 °С и повышение ее мобильности. Важно отметить, что этот сдвиг наблюдался в Penta воде и после года хранения. Как отмечено в этой работе, кавитационные микровзрывы могут сопровождаться разрывами водородных связей и перегревом молекул по вращательным состояниям и генерацией орто-спин-изомеров молекул в сверхкритических условиях [31]. Мы предполагаем, что при этом, после кавитационной обработки, вода может переходить в новое равновесное состояние, что приводит к новым характеристикам взаимодействия молекул с подложкой из слюды. Что же касается пост-эффекта, то физические причины его возникновения требуют дальнейшего изучения.
Таким образом, в работе показано влияние кавитационной воды и постэффекта от кавитационной воды на свойства белка в плане изменения его адсорбционной способности к поверхности слюды. Обнаруженные нами эффекты воздействия кавитационной воды на фермент следует учитывать при разработке и использовании как аналитического, так и промышленного оборудования, в котором существует вероятность возникновения кавитационных процессов – таких, как биосенсоры [2] и биореакторы с теплообменниками [3], а также для уточнения моделей влияния кавитационных процессов на гемодинамику в организме человека [30].
ВЫВОДЫ
Методом АСМ экспериментально продемонстрировано влияние воды, подвергнутой кавитации, на адсорбционные свойства белка ПХ на слюде на уровне единичных молекул этого фермента. Обнаружена существенно пониженная адсорбция фермента, раствор которого инкубировали в воде, подвергнутой кавитации, по сравнению с контрольным образцом ПХ. Более того, еще большее снижение адсорбции наблюдалось после инкубации на месте сосуда с кавитационной водой. При этом ферментативная активность ПХ практически не изменялась по сравнению с контрольным образцом ПХ. Обнаруженный эффект полезно учитывать при работе с аналитическими системами, а также при работе на оборудовании, работающих с водой высокой степени очистки и обеззараживания, полученной с помощью кавитаторов, а также и в других областях биохимии, для уточнения моделей влияния кавитационных процессов на гемодинамику в организме человека.
БЛАГОДАРНОСТИ
Эксперименты на гидродинамическом генераторе выполнены при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (Государственное задание № 075-00269-25-00). Измерения свойств фермента методами АСМ и спектрофотометрии выполнены в рамках Программы фундаментальных научных исследований в Российской Федерации на долгосрочный период (2021–2030 годы) (№122030100168-2).
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Metzler D.E. Biochemistry, the Chemical Reactions of Living Cells, 1st ed.; Academic Press: Cambridge, UK, 1977.
IAsys Cuvette System User’s Guide. First edition. Fisons plc., 1993.
Androga D.D., Uyar B., Koku H., Eroglu I. Dynamic modeling of temperature change in outdoor operated tubular photobioreactors. Bioprocess Biosyst. Eng. 2017. Vol. 40 (7), PP. 1017–1031. http://dx.doi.org/10.1007/s00449-017-1765-3
Ивченко В.М., Кулагин В.А. Немчин А.Ф. Кавитационная технология. Красноярск: Изд-во КГУ, 1990. 200 c.
Дубровская О.Г., Евстигнеев В.В., Кулагин В.А. Проблемы очистки сточных вод, содержащих эмульгированные нефтепродукты в оборотных системах замкнутых циклов водопользования, и пути их решения. Журнал Сибирского Федерального Университета. Серия: Техника и технологии. 2013. № 6 (6), С. 680–688.
Кулагин В.А., Сапожникова Е.С., Стебелева О.П., Кашкина Л.В., Чжэн Ч. Ин, Ли Ц., Ли Ф.Ч. Особенности влияния эффектов кавитации на физико-химические свойства воды и стоков. Журнал Сибирского федерального университета. Серия: Техника и технологии. 2014. № 7 (5). С. 605–614.
Ivanov Y.D., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Romanova T.S.; Valueva A.A., Tatur V.Y., Stepanov I.N., Ziborov V.S. Investigation of the Influence of Liquid Motion in a Flow-based System on an Enzyme Aggregation State with an Atomic Force Microscopy Sensor: The Effect of Water Flow. Appl. Sci. 2020. Vol. 10 (13). P. 4560. https://doi.org/10.3390/app 10134560
Ivanov Y.D., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Larionov D.I., Repnikov V.V., Ivanova N.D., Tatur V.Yu., Stepanov I.N., Ziborov V.S. AFM and FTIR Investigation of the Effect of Water Flow on Horseradish Peroxidase. Molecules. 2021. Vol. 26 (2). P. 306. https://doi.org/10.3390/molecules26020306
Ziborov V.S., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Ivanova I.A., Valueva A.A., Tatur V.Y., Negodailov A.N., Lukyanitsa A.A., Ivanov Y.D. Investigation of the Influence of Liquid Motion in a Flow-Based System on an Enzyme Aggregation State with an Atomic Force Microscopy Sensor: The Effect of Glycerol Flow. Appl. Sci. 2020. Vol. 10 (14). P. 4825. https://doi.org/10.3390/app 10144825
Ivanov Y.D., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Ivanova I.A., Ershova M.O., Tatur V.Yu., Ziborov V.S. AFM Study of the Influence of Glycerol Flow on Horseradish Peroxidase near the in/out Linear Sections of a Coil. Appl. Sci. 2021. Vol. 11 (4). P. 1723. https://doi.org/10.3390/app 11041723
Ivanov Y.D., Shumov I.D., Kozlov A.F., Ershova M.O., Valueva A.A., Ivanova I.A., Tatur V.Y., Lukyanitsa A.A., Ivanova N.D., Ziborov V.S. Glycerol Flow through a Shielded Coil Induces Aggregation and Activity Enhancement of Horseradish Peroxidase. Appl. Sci. 2023. Vol. 13. P. 7516. https://doi.org/10.3390/app 13137516
Ivanov Y.D., Shumov I.D., Kozlov A.F., Ershova M.O., Valueva A.A., Ivanova I.A., Tatur V.Y., Lukyanitsa A.A., Ivanova N.D., Ziborov V.S. Stopped Flow of Glycerol Induces the Enhancement of Adsorption and Aggregation of HRP on Mica. Micromachines. 2023. Vol. 14. P. 1024. https://doi.org/10.3390/mi14051024
Ivanov Y.D., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ershova M.O., Ivanova I.A., Ableev A.N., Tatur V.Y., Lukyanitsa A.A., Ivanova N.D., Ziborov V.S. Atomic Force Microscopy Study of the Long-Term Effect of the Glycerol Flow, Stopped in a Coiled Heat Exchanger, on Horseradish Peroxidase. Micromachines. 2024. Vol. 15 (4). P. 499. https://doi.org/10.3390/mi15040499
Иванов Ю.Д., Шумов И.Д., Козлов А.Ф., Ершова М.О., Валуева А.А., Иванова И.А., Татур В.Ю., Лукьяница А.А., Иванова Н.Д., Неведрова Е.Д., Зиборов В.С. АСМ-исследование пост-эффекта движения глицерина в выходной части проточной системы на адсорбционные свойства белка. НАНОИНДУСТРИЯ. 2023. Т. 16. № 2. С. 106–113. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2023.16.2.106.113
Ivanov Y.D., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Ivanova I.A., Valueva A.A., Tatur V.Y., Smelov M.V., Ivanova N.D., Ziborov V.S. AFM imaging of protein aggregation in studying the impact of knotted electromagnetic field on a peroxidase. Sci. Rep. 2020. Vol. 10. P. 9022. https://doi.org/10.1038/s41598-020-65888-z
Ziborov V.S., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Larionov D.I., Evdokimov A.N., Tatur V.Y., Aleshko A.I., Sakharov K.Y., Dolgoborodov A.Y., Fortov V.E., Archakov A.I., Ivanov Y.D. The Impact of Fast-Rise-Time Electromagnetic Field and Pressure on the Aggregation of Peroxidase upon Its Adsorption onto Mica. Appl. Sci. 2021. Vol. 11 (24). P. 11677. https://doi.org/10.3390/app 112411677
Ivanov Yu.D., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Ivanova I.A., Valueva A.A., Ershova M.O., Tatur V.Yu., Stepanov I.N., Repnikov V.V., Ziborov V.S. AFM study of changes in properties of horseradish peroxidase after incubation of its solution near a pyramidal structure. Sci. Rep. 2021. Vol. 11 (1). P. 9907. https://doi.org/10.1038/s41598-021-89377-z
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Repnikov V.V., Stepanov I.N., Ziborov V.S. Effect of Spherical Elements of Biosensors and Bioreactors on the Physicochemical Properties of a Peroxidase Protein. Polymers. 2021. Vol. 13 (10). P. 1601. https://doi.org/10.3390/polym13101601
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. The Effect of Incubation near an Inversely Oriented Square Pyramidal Structure on Adsorption Properties of Horseradish Peroxidase. Appl. Sci. 2022. Vol. 12. P. 4042. https://doi.org/10.3390/app 12084042
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. The Effect of a Dodecahedron-Shaped Structure on the Properties of an Enzyme. J. Funct. Biomater. 2022. Vol. 13. P. 166. https://doi.org/10.3390/jfb13040166.
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. Atomic Force Microscopy Study of the Effect of an Electric Field, Applied to a Pyramidal Structure, on Enzyme Biomolecules. J. Funct. Biomater. 2022. Vol. 13. P. 234. https://doi.org/10.3390/jfb13040234
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. The Influence of a High-Voltage Discharge in a Helicoidal Twisted-Pair Structure on Enzyme Adsorption. Electronics. 2022. Vol. 11. P. 3276. https://doi.org/10.3390/electronics11203276
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. The Effect of a Rotating Cone on Horseradish Peroxidase Aggregation on Mica Revealed by Atomic Force Microscopy. Micromachines 2022. Vol. 13. P. 1947. https://doi.org/10.3390/mi13111947
Ivanov Y.D., Shumov I.D., Tatur V.Y., Valueva A.A., Kozlov A.F., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. AFM Investigation of the Influence of Steam Flow through a Conical Coil Heat Exchanger on Enzyme Properties. Micromachines. 2022. Vol. 13. P. 2041. https://doi.org/10.3390/mi13122041
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. Effect of a Conical Cellulose Structure on Horseradish Peroxidase Biomacromolecules. Appl. Sci. 2022. Vol. 12. P. 11994. https://doi.org/10.3390/app 122311994
Kiselyova O.I., Yaminsky I., Ivanov Y.D., Kanaeva I.P., Kuznetsov V.Y., Archakov A.I. AFM study of membrane proteins, cytochrome P 4502B4, and NADPH–Cytochrome P 450 reductase and their complex formation. Arch. Biochem. Biophys. 1999. Vol. 371. P.P. 1–7. https://doi.org/10.1006/abbi.1999.1412.
Pleshakova T.O., Kaysheva A.L., Shumov I.D., Ziborov V.S., Bayzyanova J.M., Konev V.A., Uchaikin V.F., Archakov A.I., Ivanov Y.D. Detection of hepatitis C virus core protein in serum using aptamer-functionalized AFM chips. Micromachines. 2019. Vol. 10. P. 129. https://doi.org/10.3390/mi10020129
Sanders S.A., Bray R.C., Smith A.T. pH-dependent properties of a mutant horseradish peroxidase isoenzyme C in which Arg38 has been replaced with lysine, Eur J Biochem. 1994. Vol. 224. PP. 1029–1037. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1994.01029.x
Ivanov Y.D., Danichev V.V., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Ziborov V.S., Krokhin N.V., Zagumenniy M.N., Ustinov V.S., Smirnov L.P., Shironin A.V., Archakov A.I. Irreversible chemical AFM-based fishing for detection of low-copied proteins. Biochem. (Moscow) Suppl. Ser. B: Biomed. Chem. 2013. Vol. 7. PP. 46–61. https://doi.org/10.1134/S1990750813010071
Pershin S.M. Conversion of Ortho-Para-H2O Isomers in Water and a Jump in Erythrocyte Fluidity through a Microcapillary at a Temperature of 36.6 ±0.3 °C. Phys. Wave Phenom. 2009. Vol. 17 (4), PP. 241–250.
Першин С.М. Двухкомпонентная вода. СПб: Агентство "Информатика". С. 71.
Научная статья
ВЛИЯНИЕ КАВИТИРОВАННОЙ ВОДЫ НА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА, ИССЛЕДОВАННОЕ НА УРОВНЕ ЕДИНИЧНЫХ МОЛЕКУЛ ФЕРМЕНТА. ИЗМЕНЕНИЕ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТА ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ КАВИТАЦИИ
В.С.Зиборов1, 2, к.ф.-м.н., ст. науч. сотр., ORCID: 0000-0001-7942-3337
И.Д.Шумов1, к.б.н., науч. сотр., ORCID: 0000-0002-9795-7065 / shum230988@yandex.ru
Е.Е.Важенкова1, лаб., ORCID: 0009-0001-4224-8907
А.Н.Аблеев1, вед. инж., ORCID: 0009-0004-3096-107X
А.Ф.Козлов1, вед. инж., ORCID: 0000-0002-2117-8743
А.В.Виноградова1, мл. науч. сотр., ORCID: 0009-0001-6044-3490
Е.Д.Неведрова1, мл. науч. сотр., ORCID: 0000-0003-2767-2299
О.Н.Афонин1, к.т.н., ст. науч. сотр., ORCID: 0009-0008-7947-3674
В.Ю.Татур3, исп. дир., ORCID: 0000-0002-6415-5189
А.А.Лукьяница3, 4, д.т.н., вед. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-0517-0602
А.В.Щербаков5, ген. дир., ORCID: 0000-0002-8067-4624
Н.Д.Иванова6, преп., ORCID: 0000-0001-5942-8050
Е.С.Юшков7, к.т.н., доц., ORCID: 0009-0002-9161-0877
Д.В.Еникеев8, д.м.н., проф., хирург-уролог, ORCID: 0000-0001-7169-2209
Ю.Д.Иванов1, 2, д.б.н., проф., зав. лаб. ORCID: 0000-0001-5041-1914
Аннотация. Методами атомно-силовой микроскопии (АСМ) и спектрофотометрии (СФ) исследован эффект воздействия воды, подвергнутой кавитации, на фермент пероксидазы хрена (ПХ). Методом АСМ обнаружено существенное изменение адсорбции ПХ на свежесколотой слюде после выдержки раствора фермента в воде, подвергнутой кавитации, по сравнению с контрольным образцом фермента. По данным СФ, ферментативная активность ПХ при этом не изменялась. Обнаруженный эффект полезно принимать во внимание при работе с ферментами на промышленном и исследовательском оборудовании, в котором может иметь место возникновение кавитации в потоке водной среды.
Ключевые слова: пероксидаза хрена, кавитация, адсорбция фермента
Для цитирования: В.С. Зиборов, И.Д. Шумов, Е.Е. Важенкова, А.Н. Аблеев, А.Ф. Козлов, А.В. Виноградова, Е.Д. Неведрова, О.Н. Афонин, В.Ю. Татур, А.А. Лукьяница, А.В. Щербаков, Н.Д. Иванова, Е.С. Юшков, Д.В. Еникеев, Ю.Д. Иванов. Влияние кавитированной воды на физико-химические свойства пероксидазы хрена, исследованное на уровне единичных молекул фермента. Изменение свойств фермента под воздействием кавитации. НАНОИНДУСТРИЯ. 2025. Т. 18. № 3–4. С. 184–192. https://doi.org/
10.22184/1993-8578.2025.18.3-4.184.192.
Received: 28.03.2025 | Accepted: 3.04.2025 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.3-4.184.192
Original paper
THE EFFECT OF CAVITED WATER ON PHYSICOCHEMICAL PROPERTIES OF HORSERADISH PEROXIDASE AS STUDIED AT THE LEVEL OF SINGLE ENZYME MOLECULES. CHANGE OF ENZYME PROPERTIES UNDER THE INFLUENCE OF CAVITATION
V.S.Ziborov1, 2, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Senior Researcher, ORCID: 0000-0001-7942-3337
I.D.Shumov1, Cand. of Sci. (Biology), Researcher, ORCID: 0000-0002-9795-7065 / shum230988@yandex.ru
E.E.Vazhenkova1, Laboratory assistant, ORCID: 0009-0001-4224-8907
A.N.Ableev1, Leading Engineer, ORCID: 0009-0004-3096-107X
A.F.Kozlov1, Leading Engineer, ORCID: 0000-0002-2117-8743
A.V.Vinogradova1, Junior Researcher, ORCID: 0009-0001-6044-3490
E.D.Nevedrova1, Junior Researcher, ORCID: 0000-0003-2767-2299
O.N.Afonin1, Cand. of Sci. (Tech), Senior Researcher, ORCID: 0009-0008-7947-3674
V.Yu.Tatur3, Executive Director, ORCID: 0000-0002-6415-5189
A.A.Lukyanitsa3, 4, Doct. of Sci. (Tech), Leading Researcher, ORCID: 0000-0002-0517-0602
A.V.Shcherbakov5, Director General, ORCID: 0000-0002-8067-4624
N.D.Ivanova6, Lecturer, ORCID: 0000-0001-5942-8050
E.S.Yushkov7, Cand. of Sci. (Tech), Prof., ORCID: 0009-0002-9161-0877
D.V.Enikeev8, Doct. of Sci. (Medicine), Prof., Urologist surgeon, ORCID: 0000-0001-7169-2209
Yu.D.Ivanov1, 2, Doct. of Sci. (Biology), Prof., Head of Laboratory, ORCID: 0000-0001-5041-1914
Abstract. The effect of water subjected to cavitation on horseradish peroxidase (HRP) enzyme is studied using atomic force microscopy (AFM) and spectrophotometry (SP). By AFM, a significant change in the adsorption of HRP on freshly cleaved mica after keeping the enzyme solution in water subjected to cavitation, is found – as compared to the control enzyme sample. According to SP, the enzymatic activity of HRP does not change. The effect observed is useful to take into account when working with enzymes on industrial and research equipment, in which cavitation may occur in the flow of an aqueous medium.
Keywords: horseradish peroxidase, cavitation, enzyme adsorption
For citation: V.S. Ziborov, I.D. Shumov, E.E. Vazhenkova, A.N. Ableev, A.F. Kozlov, A.V. Vinogradova, E.D. Nevedrova, O.N. Afonin, V.Yu. Tatur, A.A. Lukyanitsa, A.V. Shcherbakov, N.D. Ivanova, E.S. Yushkov, D.V. Enikeev, Yu.D. Ivanov. The effect of cavited water on physicochemical properties of horseradish peroxidase as studied at the level of single enzyme molecules. Change of enzyme properties under the influence of cavitation. NANOINDUSTRY. 2025. Vol. 18. No. 3–4. PP. 184–192. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.3-4.184.192.
ВВЕДЕНИЕ
Вода является основным компонентом живых систем [1]. Вследствие этого, вода широко используется как в биотехнологии, так и в исследованиях в области биомедицины как в качестве основного компонента обрабатываемых/исследуемых сред, так и в качестве теплоносителя [2, 3]. Так, в настоящее время разрабатываются технологии на базе высокопроизводительных систем очистки воды, а также организации терморегуляции и приготовления растворов на базе гидродинамических генераторов. Использование кавитационных генераторов для этих целей является эффективным и малоэнергоемким [4–6].
Ранее было показано, что кавитационная обработка воды приводит к изменению ее физико-химических свойств (электропроводности, окислительно-восстановительного потенциала и других параметров) [6]. Соответственно, использование такой воды в биомедицинском исследовательском либо в биотехнологическом оборудовании предполагает возможное влияние этой воды на свойства используемых в этом оборудовании биологических макромолекул (в частности, ферментов).
Интересно отметить, что ранее на примере пероксидазы хрена (ПХ) было экспериментально продемонстрировано влияние движения воды [7, 8] и неводной жидкости (глицерина) на свойства фермента [9–11]. В случае неводной жидкости (глицерина) было также обнаружено влияние движения жидкости на свойства ПХ в случае, когда поток глицерина был остановлен, но все равно наблюдалось влияние на фермент [12], а также наличие пост-эффекта движения неводной жидкости при ее движении во входной [13] и выходной [14] прямолинейных секций змеевикового теплообменника. Помимо этого, электромагнитные поля также оказывают заметное влияние на физико-химические свойства ПХ [15–25].
В настоящей работе исследовано влияние воды, подвергнутой кавитации, на свойства фермента на примере ПХ. Исследование проводили как методом АСМ на уровне единичных молекул фермента, так и методом спектрофотометрии (СФ). Было показано, что инкубация пробирки с раствором ПХ в воде, подвергнутой кавитации (кавитационной/кавитированной воде), приводит к существенному изменению адсорбционной способности фермента на поверхность свежесколотой слюды, а именно, к меньшей адсорбции белка по сравнению с контрольными образцами, не подвергнутыми инкубации в кавитационной воде. Более того, было продемонстрировано существование пост-эффекта от кавитационной воды на адсорбцию ПХ. Методом СФ было обнаружено, что ферментативная активность ПХ в реакции окисления его субстрата (2,2′-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната), АБТС) в присутствии H2O2 не изменялась ни во время инкубации раствора фермента в воде, подвергнутой кавитации, ни после удаления этой воды.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Использованные реактивы
Аналогично работам [7–25], в настоящей работе использовали белок ПХ, выделенный из хрена (Sigma, Cat. #6782). 2,2′-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат) (АБТС) был также приобретен в Sigma (Cat. #A-1888). Пероксид водорода (H2O2, ч.д.а.), лимонная кислота (ос.ч.) и однозамещенный фосфат натрия (Na2HPO4, ч.д.а.) были приобретены в Реахим (Москва). 2 мМ фосфатно-солевой буфер в модификации Дульбекко (ФСБ-Д; pH 7,4) готовили путем растворения готовой смеси солей (Pierce, США) в ультрачистой деионизированной воде. Все растворы, использованные в экспериментах, готовили, используя ультрачистую воду (18.2 MОм × см), очищенную с помощью установки Simplicity UV (Millipore, Франция).
Эксперименты на гидродинамическом генераторе
Для получения кавитационной воды использовали гидродинамический генератор (ГДГ), изготовленный в ООО "НПО "Курс" (Россия). ГДГ состоит из статора и ротора, изготовленных из пищевой нержавеющей стали. Основные параметры ГДГ: мощность электродвигателя 7,5 кВт, частота вращения ротора 4800 об/мин, объем рабочей камеры 0,3 л, число кавитации ~0,5. В процессе кавитационной обработки вода нагревалась до 62 °С. Фотоизображение установки на базе гидродинамического генератора представлено на рис.1.
Инкубация фермента в кавитационной воде
Для исследования воздействия кавитационной воды на ПХ 1 мл 10–7 М раствора этого фермента в 2 мМ ФСБ-Д (рабочий раствор ПХ) помещали в одноразовую полипропиленовую пробирку с раствором белка номинальным объемом 1,7 мл. Эту пробирку помещали в стеклянный стакан объемом 3 л, наполненный кавитационной водой (рис.2), где выдерживали при температуре 23 °С в течение 3 ч.
После этого кавитационную воду удаляли, и на место стакана с кавитационной водой устанавливали другую пробирку с образцом раствора ПХ для исследования пост-эффекта. Ее также выдерживали в течение 3 ч. Эти образцы затем исследовали методами АСМ и СФ.
Контрольные эксперименты
Контрольный образец 10–7 М раствора фермента в том же буфере (ФСБ-Д) объемом 1 мл помещали в такую же пробирку, как и рабочий раствор ПХ. Контрольный образец ПХ выдерживали на большом удалении (10 м) от зоны эксперимента с кавитационной водой в течение 3 ч. Этот контрольный образец затем также исследовали методами АСМ и СФ.
Измерения методом АСМ
Адсорбционные свойства ПХ исследовали с помощью АСМ на подложках из свежесколотой слюды. Для этого использовали метод непосредственной адсорбции [26] ПХ из исследуемых образцов на поверхность подложек, как описано в наших предыдущих работах [7–25]. Поверхность подложек визуализировали методом АСМ в полуконтактном режиме на воздухе при температуре 25 °С с помощью атомно-силового микроскопа NTEGRA PRIMA (NT-MDT, Зеленоград, Россия) с кантилеверами NSG10 ("ТипсНано", Зеленоград, Россия; резонансная частота 47–150 кГц, силовая постоянная от 0,35 до 6,1 Н/м). Площадь скана составляла 2 × 2 мкм (256 × 256 точек). Для каждого образца было сделано не менее 25 сканов в разных участках поверхности подложки. Калибровку микроскопа по высоте проводили по калибровочной решетке aTGZ1 (НТ-МДТ, Россия, высота шага 21,4 ± 1,5 нм). Общее число объектов, визуализированных на АСМ-изображениях для каждого образца, составляло не менее 200.
Гистограмму распределения абсолютного числа адсорбированных на подложке объектов по высотам N400(h) рассчитывали по ранее описанной методике [27].
Спектрофотометрические измерения
Ферментативную активность ПХ определяли методом СФ согласно методике Sanders et al. [28], как описано в наших предыдущих публикациях [7, 8, 10–25]. СФ измерения выполняли на спектрофотометре модели 8453 (Agilent Deutschland GmbH, Вальдбронн, Германия). В экспериментах использовали раствор, содержащий 10–9 М ПХ, 0,3 мМ ее субстрата АБТС и 2,5 мМ H2O2 в фосфатно-цитратном буфере (51 мМ Na2HPO4, 24 мМ лимонной кислоты, pH 5 [28]). Регистрировали зависимости поглощения этого раствора A405 при длине волны 405 нм от времени (t) в течение t = 5 мин. Измерения проводили в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см (Agilent Deutschland GmbH, Вальдбронн, Германия). Для проведения измерений 30 мкл 0,1 мкМ (10–7 М) исследуемого образца ПХ добавляли в кварцевую кювету, содержащую 2,95 мл вышеописанного буфера, содержащего субстрат АБТС, и тщательно перемешивали. Затем в кювету добавляли 8 мкл 3% (масс./масс.) H2O2 и мгновенно начинали регистрацию зависимости поглощения A405(t) исследуемого раствора от времени.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рис.3 показаны типичные АСМ-изображения поверхности подложек из свежесколотой слюды, инкубированных в рабочих и контрольном образцах раствора ПХ.
Из АСМ-изображений, представленных на рис.3, видно, что число объектов, адсорбированных на поверхность свежесколотой слюды из рабочих растворов ПХ, было незначительным. Для точной оценки количества и высот адсорбированных на слюде частиц ПХ требуется точный подсчет индивидуальных адсорбированных на слюде частиц и анализ распределения абсолютного числа визуализированных объектов по высотам N400(h), которое представлено на рис.4.
Представленная на рис.4 гистограмма четко показывает резкое уменьшение числа частиц ПХ, адсорбированных на слюде из рабочих растворов ПХ (красные и зеленые столбцы) относительно такового в случае контрольного раствора фермента (синие столбцы).
А именно, анализ гистограммы N400(h) показал, что из контрольного образца раствора фермента, инкубированного в 10 м от сосуда с кавитационной водой, адсорбировалось N400 = 2466 частиц/400 мкм2 (рис.4, синие столбцы). В то же время из раствора ПХ, инкубированного непосредственно в сосуде с кавитационной водой, адсорбировалось лишь 956 частиц/400 мкм2 (рис.4, красные столбцы). При этом из всех исследованных образцов фермент адсорбировался на слюду в виде смеси его мономерной и олигомерной форм. В нашей пионерской работе [25] было показано, что объекты с высотами ~ 1 нм следует относить к макромолекулам ПХ, адсорбированным в мономерной форме, в то время как объекты с большей высотой представляют собой олигомеры этого фермента.
Более того, для условий, когда сосуд с кавитационной водой был убран, а на его месте располагали пробирку с раствором фермента, наблюдалось фактически полное отсутствие адсорбции ПХ на слюду. В самом деле, абсолютное количество визуализированных на слюде частиц в этом случае составило лишь 356 частиц/400 мкм2 (зеленые столбцы) практически уменьшившись до фонового значения, составляющего для АСМ-измерений на слюде 500 частиц/400 мкм2 [29].
Отметим, что ферментативная активность ПХ после трех часов инкубации образца фермента как в сосуде с кавитационной водой, так и на месте его практически не изменялась относительно активности контрольного образца, что наглядно иллюстрируется полученными зависимостями A405(t), представленными на рис.5.
ОБСУЖДЕНИЕ
В работе были проведены исследования влияния воды, подвергшейся кавитации, на погруженный в нее раствор фермента ПХ путем подсчета количества частиц фермента, адсорбированных на свежесколотую слюду, и анализа распределения этих частиц по их высотам на основе анализа данных, полученных методом АСМ [7–25]. По сравнению с контрольным образцом раствора ПХ, для растворов фермента, инкубированных в кавитационной воде, наблюдалось значительное изменение в адсорбционных свойствах фермента на слюде. А именно, наблюдалась пониженная адсорбция белка на поверхности слюды – до 956 частиц/400 мкм2. В условиях, когда этот сосуд с кавитационной водой удаляли, а на его месте располагали другой образец раствора фермента, наблюдалось еще большее уменьшение адсорбции белка практически до фоновых значений <500 частиц/400 мкм2 (т.е. до уровня шума, типичного для АСМ-экспериментов [29]). Наблюдаемый эффект можно объяснить следующим образом.
Известно, что вода является неравновесной системой в плане ее спинового состояния, а именно, для воды характерно определенное соотношение орто- и параизомеров [30]. Отмечено, что после испарения воды в кавитационном фонтане и последующей конденсации центры колебательной OH-полосы воды смещаются в сторону высоких частот на 10–12 см–1 [31]. Подобное смещение наблюдалось и для коммерческой воды Penta, которая после дистилляции подвергалась кавитационной обработке и разливалась в бутылки. Такой сдвиг указывает на перегрев воды на 10–12 °С и повышение ее мобильности. Важно отметить, что этот сдвиг наблюдался в Penta воде и после года хранения. Как отмечено в этой работе, кавитационные микровзрывы могут сопровождаться разрывами водородных связей и перегревом молекул по вращательным состояниям и генерацией орто-спин-изомеров молекул в сверхкритических условиях [31]. Мы предполагаем, что при этом, после кавитационной обработки, вода может переходить в новое равновесное состояние, что приводит к новым характеристикам взаимодействия молекул с подложкой из слюды. Что же касается пост-эффекта, то физические причины его возникновения требуют дальнейшего изучения.
Таким образом, в работе показано влияние кавитационной воды и постэффекта от кавитационной воды на свойства белка в плане изменения его адсорбционной способности к поверхности слюды. Обнаруженные нами эффекты воздействия кавитационной воды на фермент следует учитывать при разработке и использовании как аналитического, так и промышленного оборудования, в котором существует вероятность возникновения кавитационных процессов – таких, как биосенсоры [2] и биореакторы с теплообменниками [3], а также для уточнения моделей влияния кавитационных процессов на гемодинамику в организме человека [30].
ВЫВОДЫ
Методом АСМ экспериментально продемонстрировано влияние воды, подвергнутой кавитации, на адсорбционные свойства белка ПХ на слюде на уровне единичных молекул этого фермента. Обнаружена существенно пониженная адсорбция фермента, раствор которого инкубировали в воде, подвергнутой кавитации, по сравнению с контрольным образцом ПХ. Более того, еще большее снижение адсорбции наблюдалось после инкубации на месте сосуда с кавитационной водой. При этом ферментативная активность ПХ практически не изменялась по сравнению с контрольным образцом ПХ. Обнаруженный эффект полезно учитывать при работе с аналитическими системами, а также при работе на оборудовании, работающих с водой высокой степени очистки и обеззараживания, полученной с помощью кавитаторов, а также и в других областях биохимии, для уточнения моделей влияния кавитационных процессов на гемодинамику в организме человека.
БЛАГОДАРНОСТИ
Эксперименты на гидродинамическом генераторе выполнены при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (Государственное задание № 075-00269-25-00). Измерения свойств фермента методами АСМ и спектрофотометрии выполнены в рамках Программы фундаментальных научных исследований в Российской Федерации на долгосрочный период (2021–2030 годы) (№122030100168-2).
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Metzler D.E. Biochemistry, the Chemical Reactions of Living Cells, 1st ed.; Academic Press: Cambridge, UK, 1977.
IAsys Cuvette System User’s Guide. First edition. Fisons plc., 1993.
Androga D.D., Uyar B., Koku H., Eroglu I. Dynamic modeling of temperature change in outdoor operated tubular photobioreactors. Bioprocess Biosyst. Eng. 2017. Vol. 40 (7), PP. 1017–1031. http://dx.doi.org/10.1007/s00449-017-1765-3
Ивченко В.М., Кулагин В.А. Немчин А.Ф. Кавитационная технология. Красноярск: Изд-во КГУ, 1990. 200 c.
Дубровская О.Г., Евстигнеев В.В., Кулагин В.А. Проблемы очистки сточных вод, содержащих эмульгированные нефтепродукты в оборотных системах замкнутых циклов водопользования, и пути их решения. Журнал Сибирского Федерального Университета. Серия: Техника и технологии. 2013. № 6 (6), С. 680–688.
Кулагин В.А., Сапожникова Е.С., Стебелева О.П., Кашкина Л.В., Чжэн Ч. Ин, Ли Ц., Ли Ф.Ч. Особенности влияния эффектов кавитации на физико-химические свойства воды и стоков. Журнал Сибирского федерального университета. Серия: Техника и технологии. 2014. № 7 (5). С. 605–614.
Ivanov Y.D., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Romanova T.S.; Valueva A.A., Tatur V.Y., Stepanov I.N., Ziborov V.S. Investigation of the Influence of Liquid Motion in a Flow-based System on an Enzyme Aggregation State with an Atomic Force Microscopy Sensor: The Effect of Water Flow. Appl. Sci. 2020. Vol. 10 (13). P. 4560. https://doi.org/10.3390/app 10134560
Ivanov Y.D., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Larionov D.I., Repnikov V.V., Ivanova N.D., Tatur V.Yu., Stepanov I.N., Ziborov V.S. AFM and FTIR Investigation of the Effect of Water Flow on Horseradish Peroxidase. Molecules. 2021. Vol. 26 (2). P. 306. https://doi.org/10.3390/molecules26020306
Ziborov V.S., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Ivanova I.A., Valueva A.A., Tatur V.Y., Negodailov A.N., Lukyanitsa A.A., Ivanov Y.D. Investigation of the Influence of Liquid Motion in a Flow-Based System on an Enzyme Aggregation State with an Atomic Force Microscopy Sensor: The Effect of Glycerol Flow. Appl. Sci. 2020. Vol. 10 (14). P. 4825. https://doi.org/10.3390/app 10144825
Ivanov Y.D., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Ivanova I.A., Ershova M.O., Tatur V.Yu., Ziborov V.S. AFM Study of the Influence of Glycerol Flow on Horseradish Peroxidase near the in/out Linear Sections of a Coil. Appl. Sci. 2021. Vol. 11 (4). P. 1723. https://doi.org/10.3390/app 11041723
Ivanov Y.D., Shumov I.D., Kozlov A.F., Ershova M.O., Valueva A.A., Ivanova I.A., Tatur V.Y., Lukyanitsa A.A., Ivanova N.D., Ziborov V.S. Glycerol Flow through a Shielded Coil Induces Aggregation and Activity Enhancement of Horseradish Peroxidase. Appl. Sci. 2023. Vol. 13. P. 7516. https://doi.org/10.3390/app 13137516
Ivanov Y.D., Shumov I.D., Kozlov A.F., Ershova M.O., Valueva A.A., Ivanova I.A., Tatur V.Y., Lukyanitsa A.A., Ivanova N.D., Ziborov V.S. Stopped Flow of Glycerol Induces the Enhancement of Adsorption and Aggregation of HRP on Mica. Micromachines. 2023. Vol. 14. P. 1024. https://doi.org/10.3390/mi14051024
Ivanov Y.D., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ershova M.O., Ivanova I.A., Ableev A.N., Tatur V.Y., Lukyanitsa A.A., Ivanova N.D., Ziborov V.S. Atomic Force Microscopy Study of the Long-Term Effect of the Glycerol Flow, Stopped in a Coiled Heat Exchanger, on Horseradish Peroxidase. Micromachines. 2024. Vol. 15 (4). P. 499. https://doi.org/10.3390/mi15040499
Иванов Ю.Д., Шумов И.Д., Козлов А.Ф., Ершова М.О., Валуева А.А., Иванова И.А., Татур В.Ю., Лукьяница А.А., Иванова Н.Д., Неведрова Е.Д., Зиборов В.С. АСМ-исследование пост-эффекта движения глицерина в выходной части проточной системы на адсорбционные свойства белка. НАНОИНДУСТРИЯ. 2023. Т. 16. № 2. С. 106–113. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2023.16.2.106.113
Ivanov Y.D., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Ivanova I.A., Valueva A.A., Tatur V.Y., Smelov M.V., Ivanova N.D., Ziborov V.S. AFM imaging of protein aggregation in studying the impact of knotted electromagnetic field on a peroxidase. Sci. Rep. 2020. Vol. 10. P. 9022. https://doi.org/10.1038/s41598-020-65888-z
Ziborov V.S., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Larionov D.I., Evdokimov A.N., Tatur V.Y., Aleshko A.I., Sakharov K.Y., Dolgoborodov A.Y., Fortov V.E., Archakov A.I., Ivanov Y.D. The Impact of Fast-Rise-Time Electromagnetic Field and Pressure on the Aggregation of Peroxidase upon Its Adsorption onto Mica. Appl. Sci. 2021. Vol. 11 (24). P. 11677. https://doi.org/10.3390/app 112411677
Ivanov Yu.D., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Ivanova I.A., Valueva A.A., Ershova M.O., Tatur V.Yu., Stepanov I.N., Repnikov V.V., Ziborov V.S. AFM study of changes in properties of horseradish peroxidase after incubation of its solution near a pyramidal structure. Sci. Rep. 2021. Vol. 11 (1). P. 9907. https://doi.org/10.1038/s41598-021-89377-z
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Repnikov V.V., Stepanov I.N., Ziborov V.S. Effect of Spherical Elements of Biosensors and Bioreactors on the Physicochemical Properties of a Peroxidase Protein. Polymers. 2021. Vol. 13 (10). P. 1601. https://doi.org/10.3390/polym13101601
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. The Effect of Incubation near an Inversely Oriented Square Pyramidal Structure on Adsorption Properties of Horseradish Peroxidase. Appl. Sci. 2022. Vol. 12. P. 4042. https://doi.org/10.3390/app 12084042
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. The Effect of a Dodecahedron-Shaped Structure on the Properties of an Enzyme. J. Funct. Biomater. 2022. Vol. 13. P. 166. https://doi.org/10.3390/jfb13040166.
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. Atomic Force Microscopy Study of the Effect of an Electric Field, Applied to a Pyramidal Structure, on Enzyme Biomolecules. J. Funct. Biomater. 2022. Vol. 13. P. 234. https://doi.org/10.3390/jfb13040234
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. The Influence of a High-Voltage Discharge in a Helicoidal Twisted-Pair Structure on Enzyme Adsorption. Electronics. 2022. Vol. 11. P. 3276. https://doi.org/10.3390/electronics11203276
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. The Effect of a Rotating Cone on Horseradish Peroxidase Aggregation on Mica Revealed by Atomic Force Microscopy. Micromachines 2022. Vol. 13. P. 1947. https://doi.org/10.3390/mi13111947
Ivanov Y.D., Shumov I.D., Tatur V.Y., Valueva A.A., Kozlov A.F., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. AFM Investigation of the Influence of Steam Flow through a Conical Coil Heat Exchanger on Enzyme Properties. Micromachines. 2022. Vol. 13. P. 2041. https://doi.org/10.3390/mi13122041
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. Effect of a Conical Cellulose Structure on Horseradish Peroxidase Biomacromolecules. Appl. Sci. 2022. Vol. 12. P. 11994. https://doi.org/10.3390/app 122311994
Kiselyova O.I., Yaminsky I., Ivanov Y.D., Kanaeva I.P., Kuznetsov V.Y., Archakov A.I. AFM study of membrane proteins, cytochrome P 4502B4, and NADPH–Cytochrome P 450 reductase and their complex formation. Arch. Biochem. Biophys. 1999. Vol. 371. P.P. 1–7. https://doi.org/10.1006/abbi.1999.1412.
Pleshakova T.O., Kaysheva A.L., Shumov I.D., Ziborov V.S., Bayzyanova J.M., Konev V.A., Uchaikin V.F., Archakov A.I., Ivanov Y.D. Detection of hepatitis C virus core protein in serum using aptamer-functionalized AFM chips. Micromachines. 2019. Vol. 10. P. 129. https://doi.org/10.3390/mi10020129
Sanders S.A., Bray R.C., Smith A.T. pH-dependent properties of a mutant horseradish peroxidase isoenzyme C in which Arg38 has been replaced with lysine, Eur J Biochem. 1994. Vol. 224. PP. 1029–1037. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1994.01029.x
Ivanov Y.D., Danichev V.V., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Ziborov V.S., Krokhin N.V., Zagumenniy M.N., Ustinov V.S., Smirnov L.P., Shironin A.V., Archakov A.I. Irreversible chemical AFM-based fishing for detection of low-copied proteins. Biochem. (Moscow) Suppl. Ser. B: Biomed. Chem. 2013. Vol. 7. PP. 46–61. https://doi.org/10.1134/S1990750813010071
Pershin S.M. Conversion of Ortho-Para-H2O Isomers in Water and a Jump in Erythrocyte Fluidity through a Microcapillary at a Temperature of 36.6 ±0.3 °C. Phys. Wave Phenom. 2009. Vol. 17 (4), PP. 241–250.
Першин С.М. Двухкомпонентная вода. СПб: Агентство "Информатика". С. 71.
Отзывы читателей
