eng
Выпуск #3-4/2025
Ю.Д.Иванов, И.Д.Шумов, Е.Е.Важенкова, А.Н.Аблеев, А.Ф.Козлов, А.В.Виноградова, Е.Д.Неведрова, О.Н.Афонин, В.Ю.Татур, А.А.Лукьяница, А.Л.Шишкин, Н.Д.Иванова, Д.В.Еникеев, Е.С.Юшков, М.М.Кузнецов, А.Ю.Долгобородов, В.С.Зиборов
ВЛИЯНИЕ КАВИТИРОВАННОЙ ВОДЫ НА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА, ИССЛЕДОВАННОЕ НА УРОВНЕ ЕДИНИЧНЫХ МОЛЕКУЛ ФЕРМЕНТА. ВРЕМЕННАЯ ЗАВИСИМОСТЬ КАВИТАЦИОННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА СВОЙСТВА ФЕРМЕНТА
ВЛИЯНИЕ КАВИТИРОВАННОЙ ВОДЫ НА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА, ИССЛЕДОВАННОЕ НА УРОВНЕ ЕДИНИЧНЫХ МОЛЕКУЛ ФЕРМЕНТА. ВРЕМЕННАЯ ЗАВИСИМОСТЬ КАВИТАЦИОННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА СВОЙСТВА ФЕРМЕНТА
Просмотры: 1082
DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.3-4.194.202
Методами атомно-силовой микроскопии (АСМ) и спектрофотометрии (СФ) исследован эффект воздействия воды, подвергнутой кавитации и выдержанной после кавитационного воздействия на нее в течение восьми месяцев, на фермент пероксидазы хрена (ПХ). В сравнении с контрольным образцом фермента, не обнаружено существенных изменений адсорбции ПХ на свежесколотой слюде. Напротив, ферментативная активность ПХ после инкубации в воде, подвергнутой кавитации восемь месяцев назад, снижалась в два раза после выдержки раствора фермента в воде, подвергнутой кавитации, по сравнению с контрольным образцом фермента. Обнаруженный эффект следует учитывать в разработке биотехнологических процессов, в которых предполагается использование кавитации жидких сред.
Методами атомно-силовой микроскопии (АСМ) и спектрофотометрии (СФ) исследован эффект воздействия воды, подвергнутой кавитации и выдержанной после кавитационного воздействия на нее в течение восьми месяцев, на фермент пероксидазы хрена (ПХ). В сравнении с контрольным образцом фермента, не обнаружено существенных изменений адсорбции ПХ на свежесколотой слюде. Напротив, ферментативная активность ПХ после инкубации в воде, подвергнутой кавитации восемь месяцев назад, снижалась в два раза после выдержки раствора фермента в воде, подвергнутой кавитации, по сравнению с контрольным образцом фермента. Обнаруженный эффект следует учитывать в разработке биотехнологических процессов, в которых предполагается использование кавитации жидких сред.
Теги: cavitation enzyme adsorption horseradish peroxidase адсорбция фермента кавитация пероксидаза хрена
Получено: 28.03.2025 г. | Принято: 3.04.2025 г. | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.3-4.194.202
Научная статья
ВЛИЯНИЕ КАВИТИРОВАННОЙ ВОДЫ НА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА, ИССЛЕДОВАННОЕ НА УРОВНЕ ЕДИНИЧНЫХ МОЛЕКУЛ ФЕРМЕНТА. ВРЕМЕННАЯ ЗАВИСИМОСТЬ КАВИТАЦИОННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА СВОЙСТВА ФЕРМЕНТА
Ю.Д.Иванов1, 2, д.б.н., проф., зав. лаб. ORCID: 0000-0001-5041-1914
И.Д.Шумов1, к.б.н., науч. сотр., ORCID: 0000-0002-9795-7065 / shum230988@yandex.ru
Е.Е.Важенкова1, лаб., ORCID: 0009-0001-4224-8907
А.Н.Аблеев1, вед. инж., ORCID: 0009-0004-3096-107X
А.Ф.Козлов1, вед. инж., ORCID: 0000-0002-2117-8743
А.В.Виноградова1, мл. науч. сотр., ORCID: 0009-0001-6044-3490
Е.Д.Неведрова1, мл. науч. сотр., ORCID: 0000-0003-2767-2299
О.Н.Афонин1, к.т.н., ст. науч. сотр., ORCID: 0009-0008-7947-3674
В.Ю.Татур3, исп. дир., ORCID: 0000-0002-6415-5189
А.А.Лукьяница3, 4, д.т.н., вед. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-0517-0602
А.Л.Шишкин5, дир., ORCID: 0009-0008-2041-6368
Н.Д.Иванова6, преп., ORCID: 0000-0001-5942-8050
Д.В.Еникеев7, д.м.н., проф., хирург-уролог, ORCID: 0000-0001-7169-2209
Е.С.Юшков8, к.т.н., доц., ORCID: 0009-0002-9161-0877
М.М.Кузнецов9, д.ф.-м.н., проф., доц., ORCID: 0000-0001-5625-1560
А.Ю.Долгобородов2, д.ф.-м.н., зав. лаб., ORCID: 0000-0001-7054-7341
В.С.Зиборов1, 2, к.ф.-м.н., ст. науч. сотр., ORCID: 0000-0001-7942-3337
Аннотация. Методами атомно-силовой микроскопии (АСМ) и спектрофотометрии (СФ) исследован эффект воздействия воды, подвергнутой кавитации и выдержанной после кавитационного воздействия на нее в течение восьми месяцев, на фермент пероксидазы хрена (ПХ). В сравнении с контрольным образцом фермента, не обнаружено существенных изменений адсорбции ПХ на свежесколотой слюде. Напротив, ферментативная активность ПХ после инкубации в воде, подвергнутой кавитации восемь месяцев назад, снижалась в два раза после выдержки раствора фермента в воде, подвергнутой кавитации, по сравнению с контрольным образцом фермента. Обнаруженный эффект следует учитывать в разработке биотехнологических процессов, в которых предполагается использование кавитации жидких сред.
Ключевые слова: пероксидаза хрена, кавитация, адсорбция фермента
Для цитирования: Ю.Д. Иванов, И.Д. Шумов, Е.Е. Важенкова, А.Н. Аблеев, А.Ф. Козлов, А.В. Виноградова, Е.Д. Неведрова, О.Н. Афонин, В.Ю. Татур, А.А. Лукьяница, А.Л. Шишкин, Н.Д. Иванова, Д.В. Еникеев, Е.С. Юшков, М.М. Кузнецов, А.Ю. Долгобородов, В.С. Зиборов. Влияние кавитированной воды на физико-химические свойства пероксидазы хрена, исследованное на уровне единичных молекул фермента. Временная зависимость кавитационного воздействия на свойства фермента. НАНОИНДУСТРИЯ. 2025. Т. 18. № 3–4. С. 194–202. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.3-4.194.202.
Received: 28.03.2025 | Accepted: 3.04.2025 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.3-4.194.202
Original paper
THE EFFECT OF CAVITATED WATER ON THE PHYSICOCHEMICAL PROPERTIES OF HORSERADISH PEROXIDASE AS STUDIED AT THE LEVEL OF SINGLE ENZYME MOLECULES. TIME DEPENDENCE OF CAVITATION EFFECT ON ENZYME PROPERTIES
Yu.D.Ivanov1, 2, Doct. of Sci. (Biology), Prof., Head of Laboratory, ORCID: 0000-0001-5041-1914
I.D.Shumov1, Cand. of Sci. (Biology), Researcher, ORCID: 0000-0002-9795-7065 / shum230988@yandex.ru
E.E.Vazhenkova1, Laboratory assistant, ORCID: 0009-0001-4224-8907
A.N.Ableev1, Leading Engineer, ORCID: 0009-0004-3096-107X
A.F.Kozlov1, Leading Engineer, ORCID: 0000-0002-2117-8743
A.V.Vinogradova1, Junior Researcher, ORCID: 0009-0001-6044-3490
E.D.Nevedrova1, Junior Researcher, ORCID: 0000-0003-2767-2299
O.N.Afonin1, Cand. of Sci. (Tech), Senior Researcher, ORCID: 0009-0008-7947-3674
V.Yu.Tatur3, Executive Director, ORCID: 0000-0002-6415-5189
A.A.Lukyanitsa3, 4, Doct. of Sci. (Tech), Leading Researcher, ORCID: 0000-0002-0517-0602
A.L.Shishkin5, Director, ORCID: 0009-0008-2041-6368
N.D.Ivanova6, Lecturer, ORCID: 0000-0001-5942-8050
D.V.Enikeev7, Doct. of Sci. (Medicine), Prof., Urologist surgeon, ORCID: 0000-0001-7169-2209
E.S.Yushkov8, Cand. of Sci. (Tech), Docent, ORCID: 0009-0002-9161-0877
М.М.Kuznetsov9, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Prof., Docent, ORCID: 0000-0001-5625-1560
A.Yu.Dolgoborodov2, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Head of Laboratory, ORCID: 0000-0001-7054-7341
V.S.Ziborov1, 2, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Senior Researcher, ORCID: 0000-0001-7942-3337
Abstract. The effect of water subjected to cavitation and kept after cavitation for 8 months on the enzyme horseradish peroxidase (HRP) was studied using atomic force microscopy (AFM) and spectrophotometry (SP). No significant changes in the adsorption of HRP on freshly cleaved mica were detected compared to the control enzyme sample. On the contrary, the enzymatic activity of HRP after incubation in water subjected to cavitation 8 months ago decreased twofold. After keeping the enzyme solution in water subjected to cavitation, compared to the control enzyme sample. The detected effect should be considered in the development of biotechnological processes that involve the use of liquid media cavitation.
Keywords: horseradish peroxidase, cavitation, enzyme adsorption
For citation: Yu.D. Ivanov, I.D. Shumov, E.E. Vazhenkova, A.N. Ableev, A.F. Kozlov, A.V. Vinogradova, E.D. Nevedrova, O.N. Afonin, V.Yu. Tatur, A.A. Lukyanitsa, A.L. Shishkin, N.D. Ivanova, D.V. Enikeev, E.S. Yushkov, М.М. Kuznetsov, A.Yu. Dolgoborodov, V.S. Ziborov. The effect of cavitated water on the physicochemical properties of horseradish peroxidase as studied at the level of single enzyme molecules. Time dependence of cavitation effect on enzyme properties. NANOINDUSTRY. 2025. Vol. 18. No. 3–4. PP. 194–202. https://doi.org/
10.22184/1993-8578.2025.18.3-4.194.202.
ВВЕДЕНИЕ
В последнее десятилетие неуклонно растет число научных публикаций, посвященных изучению кавитационных процессов в жидкости и использованию этих процессов в биотехнологии [1] и синтезе наноматериалов [2]. Так, сообщается о перспективности использования кавитационных процессов для обработки шлама [3], очистки сточных вод [4, 5], в пищевой промышленности [6, 7] и биомедицине [1].
В этой связи важно отметить, что кавитационная обработка воды приводит к изменению ее физико-химических свойств [8]. Учитывая растущий интерес к использованию методов кавитационной обработки водных сред в биотехнологии [1], необходимо изучение возможных эффектов водной среды, прошедшей кавитационную обработку, на свойства ферментных систем.
Ранее на примере пероксидазы хрена (ПХ) было продемонстрировано, что движение жидкостей (как воды [9, 10], так и неводных жидкостей [11–16]) и пара [17] может влиять на свойства ферментов. Это влияние объясняется возникновением электромагнитных полей при движении жидкостей вследствие трибоэлектрического эффекта [18–20]. На самом деле внешние электромагнитные поля оказывают заметное влияние на физико-химические свойства ПХ [21–30].
В настоящей работе продолжено исследование воздействия водной среды, подвергнутой кавитационному воздействию, на свойства ПХ методами атомно-силовой микроскопии (АСМ) и спектрофотометрии (СФ). В отличие от первой части работы, в настоящем исследовании изучали эффект воздействия кавитационной воды на ПХ через восемь месяцев после кавитационной обработки воды. В этом случае инкубация пробирки с раствором ПХ в кавитационной воде не приводила к изменению адсорбционных свойств ПХ на слюде. Напротив, методом СФ было зарегистрировано существенное снижение ферментативной активности ПХ после инкубации раствора фермента в воде, подвергнутой кавитации за восемь месяцев до инкубации в ней фермента, в сравнении с контрольным образцом фермента, инкубированным в водопроводной воде.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Использованные реактивы
Как и в первой части исследования, в настоящей работе использовали фермент ПХ, выделенный из хрена (Sigma, Cat. #6782), и 2,2′-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат) (АБТС), который также был приобретен в Sigma (Cat. #A-1888). Пероксид водорода (H2O2, ч.д.а.), лимонная кислота (ос.ч.) и однозамещенный фосфат натрия (Na2HPO4, ч.д.а.) были приобретены в Реахим (Москва). 2 мМ фосфатно-солевой буфер в модификации Дульбекко (ФСБ-Д; pH 7,4) готовили путем растворения готовой смеси солей (Pierce, США) в ультрачистой деионизированной воде. Все растворы, использованные в экспериментах, готовили, используя ультрачистую воду (18.2 MОм × см), очищенную с помощью установки Simplicity UV (Millipore, Франция).
Водопроводная вода
Водопроводная вода соответствовала ГОСТ Р 51232-98 и была отобрана из водопроводной сети. ГОСТ Р 51232-98 распространяется на питьевую воду, производимую и подаваемую централизованными системами питьевого водоснабжения, и устанавливает общие требования к организации и методам контроля качества питьевой воды.
Эксперименты на гидродинамическом генераторе
Для кавитационной обработки воды использовали гидродинамический генератор (ГДГ), изготовленный в ООО ВФ "АВК-БЕТА". ГДГ состоял из статора и ротора, изготовленных из пищевой нержавеющей стали. В статоре имеется паз глубиной 9 мм и шириной 12 мм на среднем радиусе 75 мм. Через 300 мм в статоре размещены радиальные пазы шириной 12 мм. На среднем радиусе 75 мм на роторе имеется шип глубиной 9 мм и шириной 12 мм. Через 300 мм в роторе размещены также радиальные пазы шириной 12 мм. Зазор между пазом статора и шипом ротора составляет 0,3 мм. Скорость вращения ротора составляла 5400 об/мин. Поэтому средняя скорость движений воды, движущейся по пазу статора, составляла 42 м/с. Кавитационные процессы происходят в радиальных пазах статора и ротора. ГДГ работает как центробежный насос со скоростью обработки воды (при однократном пропускании) не менее 5 л/мин. Потребляемая мощность установки при работе на частоте питания 50 Гц – до 8,5 кВт. При работе ГДГ в звуковом диапазоне наблюдаются частоты выше 18 кГц. Основная несущая частота образования зон кавитации при частоте электропитания двигателя 50 Гц составляла 1,9 кГц. Температура воды составляла 70 °C. Фотоизображение ГДГ в сборе представлено на рис.1.
Инкубация фермента в кавитационной воде
Для исследования воздействия кавитационной воды на ПХ 1 мл 10–7 М раствора этого фермента в 2 мМ ФСБ-Д (рабочий раствор ПХ) помещали в одноразовую полипропиленовую пробирку с раствором белка номинальным объемом 1,7 мл. Эту пробирку помещали в стеклянный стакан объемом 2 л, наполненный водой, подвергнутой кавитации восемь месяцев назад (рис.2), и выдерживали в этом стакане при температуре 23 °С в течение трех часов.
Пробирку с контрольным образцом раствора ПХ инкубировали в стакане объемом 2 л с водопроводной водой, не подвергнутой кавитации. Стакан с водопроводной водой размещали на расстоянии 10 м от стакана с водой, подвергнутой кавитации восемь месяцев назад. Время инкубации пробирки с контрольным образцом ПХ в стакане с водопроводной водой также составляло три часа. Рабочий и контрольный образцы раствора ПХ затем исследовали методами АСМ и СФ.
Измерения физико-химических свойств ПХ
АСМ и СФ измерения проводили точно так же, как описано в первой части нашей работы и наших предыдущих статьях [9, 10, 12–16, 21–30]. Коротко, ПХ адсорбировали на подложки из свежесколотой слюды методом непосредственной адсорбции [31] из рабочего и контрольного растворов, инкубированных, как описано в предыдущем разделе ("Инкубация фермента в кавитационной воде"). АСМ-измерения проводили на приборе NTEGRA Prima (NT-MDT, Зеленоград, Россия) в режиме прерывистого контакта с использованием кантилеверов NSG-10 (TipsNano, Эстония) с радиусом иглы 10 нм. Общее число объектов, визуализированных на АСМ-изображениях для каждого образца, составляло не менее 200 шт.
СФ-измерения проводили на спектрофотометре модели 8453 (Agilent Deutschland GmbH, ФРГ) в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны 405 нм по методике, разработанной в [32].
Анализ данных
Анализ данных АСМ проводили по методике, описанной в [33]. Относительное распределение количества объектов по высотам ρ(h) рассчитывали как:
ρ(h) = (Nh/N) × 100%,
где Nh – число визуализированных на подложке частиц с высотой h, а N – общее количество визуализированных на подложке частиц.
Абсолютное число визуализированных на подложке частиц, нормированное на площадь 400 мкм2, рассчитывали по описанию в первой части нашей работы и в [33].
Активность фермента относительно его субстрата АБТС определяли, как описано нами в [22].
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рис.3 показаны типичные АСМ-изображения поверхности подложек из свежесколотой слюды, инкубированных в рабочем и контрольном образцах раствора ПХ.
Из АСМ-изображений, представленных на рис.3, видно, что как из рабочего, так и из контрольного образцов исследуемый фермент адсорбировался на поверхность свежесколотой слюды в форме компактных объектов. Для определения адсорбционных свойств ПХ и точного подсчета числа и определения высот адсорбированных на слюде частиц ПХ требуется построение относительного распределения количества визуализированных частиц по высотам ρ(h) и анализ распределения абсолютного числа визуализированных объектов по высотам N400(h). Полученные для рабочего и контрольного образцов растворов ПХ графики ρ(h) и гистограмма N400(h) представлены на рис.4 и рис.5, соответственно.
Представленные на рис.4 и рис.5 данные показывают, что высоты и число частиц ПХ, адсорбированных на слюду как из рабочего (рис.4, красная кривая; рис.5, красные столбцы), так и из контрольного образцов растворов ПХ (рис.4, синяя кривая; рис.5, синие столбцы) практически одинаково. В самом деле из рабочего раствора на слюду адсорбировалось 566 частиц/400 мкм2, а из контрольного раствора адсорбировалось 502 частицы/400 мкм2. При этом как из рабочего, так и из контрольного образцов ПХ адсорбировалась на слюду в виде смеси ее мономерной и олигомерной форм со значительным (~30%) содержанием мономерной формы, соответствующей частицам с высотами 1,0±0,2 нм [21]. Таким образом, по данным, полученным методом АСМ, можно сделать вывод об отсутствии влияния воды, подвергнутой кавитации восьми месяцев назад, на адсорбционные свойства ПХ на слюде – в отличие от случая, описанного в первой части нашего исследования.
Отметим, что ферментативная активность ПХ после трех часов инкубации образца фермента в стакане с водой, подвергнутой кавитации, была значительно снижена относительно активности фермента в контрольном образце, что отчетливо иллюстрируется полученными зависимостями A405(t), представленными на рис.6.
В самом деле, активность ПХ в контрольном образце была 134,7 ед./(мл раствора фермента), в то время как в рабочем образце активность ПХ была лишь 61,6 ед./(мл раствора фермента). То есть инкубация раствора ПХ в воде, подвергнутой кавитации восемь месяцев назад, приводила к двукратному снижению активности фермента.
ОБСУЖДЕНИЕ
В работе были проведены исследования влияния инкубации раствора ПХ в воде, подвергнутой кавитации за восемь месяцев до инкубации. Аналогично предыдущим работам [9, 10, 12–16, 21–30] использовали метод АСМ для определения адсорбционных свойств фермента на слюде и метод СФ для определения ферментативной активности ПХ. В первой части нашего исследования исследуемые растворы ПХ инкубировали в воде сразу после кавитационного воздействия на нее, что приводило к значительному изменению адсорбционных свойств фермента при сохранении его ферментативной активности.
В противоположность данным, полученным в первой части исследования, в настоящем исследовании не наблюдалось изменений адсорбционных свойств ПХ на свежесколотой слюде. В то же время после инкубации раствора ПХ в воде, подвергнутой кавитации восемь месяцев назад, его ферментативная активность снижалась в два раза по сравнению с контрольным образцом фермента. Наблюдаемый эффект можно объяснить тем, что после кавитационной обработки при 70 °С вода может переходить в новое равновесное состояние, как отмечено ранее Першиным [34]. Такое изменение состояния воды и вызывает существенные понижения активности фермента за счет того, что он может менять свою структуру после перехода воды в новое равновесное состояние.
В связи с растущим интересом к использованию кавитационных процессов в биотехнологии и биомедицине [1], обнаруженный нами эффект воздействия воды, подвергнутой кавитации восемь месяцев назад, на ферментативную активность ПХ следует учитывать в разработке технологических процессов, предполагающих использование явления кавитации в жидкости, а также биомедицинского оборудования, в котором возможно возникновение кавитации.
ВЫВОДЫ
Методом АСМ экспериментально продемонстрировано угнетение ферментативной активности ПХ после воздействия воды, подвергнутой кавитации восемь месяцев назад. А именно, активность ПХ в реакции окисления АБТС в присутствии H2O2 снижалась в два раза после трехчасовой инкубации 10–7 М раствора фермента в воде, подвергнутой кавитации восемь месяцев назад в сравнении с образцом фермента, инкубированным в водопроводной воде также в течение трех часов. При этом не наблюдалось изменений адсорбционных свойств фермента. Учитывая все возрастающий интерес к использованию кавитационных процессов в биотехнологии и пищевой промышленности, обнаруженный нами эффект следует принимать во внимание при разработке технологических процессов, предполагающих использование явления кавитации в жидкости.
БЛАГОДАРНОСТИ
Эксперименты на гидродинамическом генераторе выполнены при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (Государственное задание № 075-00269-25-00). Измерения свойств фермента методами АСМ и спектрофотометрии выполнены в рамках Программы фундаментальных научных исследований в Российской Федерации на долгосрочный период (2021–2030 годы) (№122030100168-2).
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Zheng H., Zheng Y., Zhu J. Recent Developments in Hydrodynamic Cavitation Reactors: Cavitation Mechanism, Reactor Design, and Applications. Engineering 2022. Vol. 19. PP. 180–198. https://doi.org/10.1016/j.eng.2022.04.027
Sun X., Chen S., Liu J., Zhao S., Yoon J.Y. Hydrodynamic Cavitation: A Promising Technology for Industrial-Scale Synthesis of Nanomaterials. Front. Chem. 2020. Vol. 8. P. 259. https://doi.org/10.3389/fchem.2020.00259
Petkovšek M., Mlakar M., Levstek M., Stražar M., Širok B., Dular M. A novel rotation generator of hydrodynamic cavitation for waste-activated sludge disintegration. Ultrasonics Sonochem. 2015. Vol. 26. PP. 408–414. http://dx.doi.org/10.1016/j.ultsonch.2015.01.006
Комарова Е.В., Слабунова А.В., Харитонов С.Е. Применение эффекта кавитации при очистке сточных вод животноводства. Экология и водное хозяйство. 2021. № 3 (2). С. 61–74. https://doi.org/10.31774/2658-7890-2021-3-2-61-74
Tao Y., Cai J., Huai X., Liu B., Guo Z. Application of hydrodynamic cavitation to wastewater treatment. Chem. Eng. Technol. 2016. Vol. 39 (8). PP. 1363–1376. https://doi.org/10.1002/ceat.201500362
Науменко Н.В., Малинин А.В., Цатуров А.В. Поиск путей повышения сохраняемости хлебобулочных изделий. Вестник ЮУрГУ. Серия "Пищевые и биотехнологии". 2018. № 6 (2). С. 58–66. https://doi.org/10.14529/food180208
Asaithambi N., Singha P., Dwivedi M., Singh S.K. Hydrodynamic cavitation and its application in food and beverage industry: a review. J. Food Process Eng. 2019. Vol. 42 (5). P. e13144. https://doi.org/10.1111/jfpe.13144
Кулагин В.А., Сапожникова Е.С., Стебелева О.П., Кашкина Л.В., Чжэн Ч. Ин, Ли Ц., Ли Ф.Ч. Особенности влияния эффектов кавитации на физико-химические свойства воды и стоков. Журнал Сибирского Федерального Университета. Серия: Техника и технологии. 2014. № 7 (5). С. 605–614.
Ivanov Y.D., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Romanova T.S.; Valueva A.A., Tatur V.Y., Stepanov I.N., Ziborov V.S. Investigation of the Influence of Liquid Motion in a Flow-based System on an Enzyme Aggregation State with an Atomic Force Microscopy Sensor: The Effect of Water Flow. Appl. Sci. 2020. Vol. 10 (13). P. 4560. https://doi.org/10.3390/app 10134560
Ivanov Y.D., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Larionov D.I., Repnikov V.V., Ivanova N.D., Tatur V.Yu., Stepanov I.N., Ziborov V.S. AFM and FTIR Investigation of the Effect of Water Flow on Horseradish Peroxidase. Molecules. 2021. Vol. 26(2). P. 306. https://doi.org/10.3390/molecules26020306
Ziborov V.S., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Ivanova I.A., Valueva A.A., Tatur V.Y., Negodailov A.N., Lukyanitsa A.A., Ivanov Y.D. Investigation of the Influence of Liquid Motion in a Flow-Based System on an Enzyme Aggregation State with an Atomic Force Microscopy Sensor: The Effect of Glycerol Flow. Appl. Sci. 2020. Vol. 10 (14). P. 4825. https://doi.org/10.3390/app 10144825
Ivanov Y.D., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Ivanova I.A., Ershova M.O., Tatur V.Yu., Ziborov V.S. AFM Study of the Influence of Glycerol Flow on Horseradish Peroxidase near the in/out Linear Sections of a Coil. Appl. Sci. 2021. Vol. 11(4). P. 1723. https://doi.org/10.3390/app 11041723
Ivanov Y.D., Shumov I.D., Kozlov A.F., Ershova M.O., Valueva A.A., Ivanova I.A., Tatur V.Y., Lukyanitsa A.A., Ivanova N.D., Ziborov V.S. Glycerol Flow through a Shielded Coil Induces Aggregation and Activity Enhancement of Horseradish Peroxidase. Appl. Sci. 2023. Vol. 13. P. 7516. https://doi.org/10.3390/app 13137516
Ivanov Y.D., Shumov I.D., Kozlov A.F., Ershova M.O., Valueva A.A., Ivanova I.A., Tatur V.Y., Lukyanitsa A.A., Ivanova N.D., Ziborov V.S. Stopped Flow of Glycerol Induces the Enhancement of Adsorption and Aggregation of HRP on Mica. Micromachines. 2023. Vol. 14. P. 1024. https://doi.org/10.3390/mi14051024
Ivanov Y.D., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ershova M.O., Ivanova I.A., Ableev A.N., Tatur V.Y., Lukyanitsa A.A., Ivanova N.D., Ziborov V.S. Atomic Force Microscopy Study of the Long-Term Effect of the Glycerol Flow, Stopped in a Coiled Heat Exchanger, on Horseradish Peroxidase. Micromachines 2024. Vol. 15 (4). P. 499. https://doi.org/10.3390/mi15040499
Иванов Ю.Д., Шумов И.Д., Козлов А.Ф., Ершова М.О., Валуева А.А., Иванова И.А., Татур В.Ю., Лукьяница А.А., Иванова Н.Д., Неведрова Е.Д., Зиборов В.С. АСМ-исследование пост-эффекта движения глицерина в выходной части проточной системы на адсорбционные свойства белка. Наноиндустрия 2023. № 16 (2). С. 106–113. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2023.16.2.106.113
Ivanov Y.D., Shumov I.D., Tatur V.Y., Valueva A.A., Kozlov A.F., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. AFM Investigation of the Influence of Steam Flow through a Conical Coil Heat Exchanger on Enzyme Properties. Micromachines 2022. Vol. 13. P. 2041. https://doi.org/10.3390/mi13122041
Тэнесеску Ф., Крамарюк Р. Электростатика в технике. М.: Энергия, 1980. 296 c.
Yoo D., Jang S., Cho S., Choi D., Kim D.S. A Liquid Triboelectric Series. Adv. Mater. 2023. Vol. 35 (26). P. 2300699. https://doi.org/10.1002/adma.202300699
Balmer R. Electrostatic Generation in Dielectric Fluids: The Viscoelectric Effect. In Proceedings of the WTC2005 World Tribology Congress III, Washington, DC, USA, 12–16 September 2005. Paper No. WTC2005-63806. https://doi.org/10.1115/WTC2005-63806
Ivanov Y.D., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Ivanova I.A., Valueva A.A., Tatur V.Y., Smelov M.V., Ivanova N.D., Ziborov V.S. AFM imaging of protein aggregation in studying the impact of knotted electromagnetic field on a peroxidase. Sci. Rep. 2020. Vol. 10. P. 9022. https://doi.org/10.1038/s41598-020-65888-z
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. The Effect of a Dodecahedron-Shaped Structure on the Properties of an Enzyme. J. Funct. Biomater. 2022. Vol. 13. P. 166. https://doi.org/10.3390/jfb13040166
Ziborov V.S., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Larionov D.I., Evdokimov A.N., Tatur V.Y., Aleshko A.I., Sakharov K.Y., Dolgoborodov A.Y., Fortov V.E., Archakov A.I., Ivanov Y.D. The Impact of Fast-Rise-Time Electromagnetic Field and Pressure on the Aggregation of Peroxidase upon Its Adsorption onto Mica. Appl. Sci. 2021. Vol. 11(24). P. 11677. https://doi.org/10.3390/app 112411677
Ivanov Yu.D., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Ivanova I.A., Valueva A.A., Ershova M.O., Tatur V.Yu., Stepanov I.N., Repnikov V.V., Ziborov V.S. AFM study of changes in properties of horseradish peroxidase after incubation of its solution near a pyramidal structure. Sci. Rep. 2021. Vol. 11(1). P. 9907. https://doi.org/10.1038/s41598-021-89377-z
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Repnikov V.V., Stepanov I.N., Ziborov V.S. Effect of Spherical Elements of Biosensors and Bioreactors on the Physicochemical Properties of a Peroxidase Protein. Polymers. 2021. Vol. 13(10). P. 1601. https://doi.org/10.3390/polym13101601
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. The Effect of Incubation near an Inversely Oriented Square Pyramidal Structure on Adsorption Properties of Horseradish Peroxidase. Appl. Sci. 2022. Vol. 12. P. 4042. https://doi.org/10.3390/app 12084042
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. Atomic Force Microscopy Study of the Effect of an Electric Field, Applied to a Pyramidal Structure, on Enzyme Biomolecules. J. Funct. Biomater. 2022. Vol. 13. P. 234. https://doi.org/10.3390/jfb13040234
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. The Influence of a High-Voltage Discharge in a Helicoidal Twisted-Pair Structure on Enzyme Adsorption. Electronics. 2022. Vol. 11. P. 3276. https://doi.org/10.3390/electronics11203276
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. The Effect of a Rotating Cone on Horseradish Peroxidase Aggregation on Mica Revealed by Atomic Force Microscopy. Micromachines. 2022. Vol. 13. P. 1947. https://doi.org/10.3390/mi13111947
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. Effect of a Conical Cellulose Structure on Horseradish Peroxidase Biomacromolecules. Appl. Sci. 2022. Vol. 12. P. 11994. https://doi.org/10.3390/app 122311994
Kiselyova O.I., Yaminsky I., Ivanov Y.D., Kanaeva I.P., Kuznetsov V.Y., Archakov A.I. AFM study of membrane proteins, cytochrome P 4502B4, and NADPH–Cytochrome P 450 reductase and their complex formation. Arch. Biochem. Biophys. 1999. Vol. 371. PP. 1–7. https://doi.org/10.1006/abbi.1999.1412
Sanders S.A., Bray R.C., Smith A.T. pH-dependent properties of a mutant horseradish peroxidase isoenzyme C in which Arg38 has been replaced with lysine, Eur J Biochem 1994. Vol. 224. PP. 1029–1037. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1994.01029.x
Pleshakova T.O., Kaysheva A.L., Shumov I.D., Ziborov V.S., Bayzyanova J.M., Konev V.A., Uchaikin V.F., Archakov A.I., Ivanov Y.D. Detection of hepatitis C virus core protein in serum using aptamer-functionalized AFM chips. Micromachines. 2019. Vol. 10. P. 129. https://doi.org/10.3390/mi10020129
Першин С.М. Квантовая природа значений температуры особых точек воды: -80, -42, 4, 19, 36.6, 48, 60 °С. Тезисы докладов 3й всероссийской конференции "Физика водных растворов". Москва, 14–15 декабря 2020. 56 с. С. 41. https://doi.org/10.24412/cl-35040-2020-41-41
Научная статья
ВЛИЯНИЕ КАВИТИРОВАННОЙ ВОДЫ НА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА, ИССЛЕДОВАННОЕ НА УРОВНЕ ЕДИНИЧНЫХ МОЛЕКУЛ ФЕРМЕНТА. ВРЕМЕННАЯ ЗАВИСИМОСТЬ КАВИТАЦИОННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА СВОЙСТВА ФЕРМЕНТА
Ю.Д.Иванов1, 2, д.б.н., проф., зав. лаб. ORCID: 0000-0001-5041-1914
И.Д.Шумов1, к.б.н., науч. сотр., ORCID: 0000-0002-9795-7065 / shum230988@yandex.ru
Е.Е.Важенкова1, лаб., ORCID: 0009-0001-4224-8907
А.Н.Аблеев1, вед. инж., ORCID: 0009-0004-3096-107X
А.Ф.Козлов1, вед. инж., ORCID: 0000-0002-2117-8743
А.В.Виноградова1, мл. науч. сотр., ORCID: 0009-0001-6044-3490
Е.Д.Неведрова1, мл. науч. сотр., ORCID: 0000-0003-2767-2299
О.Н.Афонин1, к.т.н., ст. науч. сотр., ORCID: 0009-0008-7947-3674
В.Ю.Татур3, исп. дир., ORCID: 0000-0002-6415-5189
А.А.Лукьяница3, 4, д.т.н., вед. науч. сотр., ORCID: 0000-0002-0517-0602
А.Л.Шишкин5, дир., ORCID: 0009-0008-2041-6368
Н.Д.Иванова6, преп., ORCID: 0000-0001-5942-8050
Д.В.Еникеев7, д.м.н., проф., хирург-уролог, ORCID: 0000-0001-7169-2209
Е.С.Юшков8, к.т.н., доц., ORCID: 0009-0002-9161-0877
М.М.Кузнецов9, д.ф.-м.н., проф., доц., ORCID: 0000-0001-5625-1560
А.Ю.Долгобородов2, д.ф.-м.н., зав. лаб., ORCID: 0000-0001-7054-7341
В.С.Зиборов1, 2, к.ф.-м.н., ст. науч. сотр., ORCID: 0000-0001-7942-3337
Аннотация. Методами атомно-силовой микроскопии (АСМ) и спектрофотометрии (СФ) исследован эффект воздействия воды, подвергнутой кавитации и выдержанной после кавитационного воздействия на нее в течение восьми месяцев, на фермент пероксидазы хрена (ПХ). В сравнении с контрольным образцом фермента, не обнаружено существенных изменений адсорбции ПХ на свежесколотой слюде. Напротив, ферментативная активность ПХ после инкубации в воде, подвергнутой кавитации восемь месяцев назад, снижалась в два раза после выдержки раствора фермента в воде, подвергнутой кавитации, по сравнению с контрольным образцом фермента. Обнаруженный эффект следует учитывать в разработке биотехнологических процессов, в которых предполагается использование кавитации жидких сред.
Ключевые слова: пероксидаза хрена, кавитация, адсорбция фермента
Для цитирования: Ю.Д. Иванов, И.Д. Шумов, Е.Е. Важенкова, А.Н. Аблеев, А.Ф. Козлов, А.В. Виноградова, Е.Д. Неведрова, О.Н. Афонин, В.Ю. Татур, А.А. Лукьяница, А.Л. Шишкин, Н.Д. Иванова, Д.В. Еникеев, Е.С. Юшков, М.М. Кузнецов, А.Ю. Долгобородов, В.С. Зиборов. Влияние кавитированной воды на физико-химические свойства пероксидазы хрена, исследованное на уровне единичных молекул фермента. Временная зависимость кавитационного воздействия на свойства фермента. НАНОИНДУСТРИЯ. 2025. Т. 18. № 3–4. С. 194–202. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.3-4.194.202.
Received: 28.03.2025 | Accepted: 3.04.2025 | DOI: https://doi.org/10.22184/1993-8578.2025.18.3-4.194.202
Original paper
THE EFFECT OF CAVITATED WATER ON THE PHYSICOCHEMICAL PROPERTIES OF HORSERADISH PEROXIDASE AS STUDIED AT THE LEVEL OF SINGLE ENZYME MOLECULES. TIME DEPENDENCE OF CAVITATION EFFECT ON ENZYME PROPERTIES
Yu.D.Ivanov1, 2, Doct. of Sci. (Biology), Prof., Head of Laboratory, ORCID: 0000-0001-5041-1914
I.D.Shumov1, Cand. of Sci. (Biology), Researcher, ORCID: 0000-0002-9795-7065 / shum230988@yandex.ru
E.E.Vazhenkova1, Laboratory assistant, ORCID: 0009-0001-4224-8907
A.N.Ableev1, Leading Engineer, ORCID: 0009-0004-3096-107X
A.F.Kozlov1, Leading Engineer, ORCID: 0000-0002-2117-8743
A.V.Vinogradova1, Junior Researcher, ORCID: 0009-0001-6044-3490
E.D.Nevedrova1, Junior Researcher, ORCID: 0000-0003-2767-2299
O.N.Afonin1, Cand. of Sci. (Tech), Senior Researcher, ORCID: 0009-0008-7947-3674
V.Yu.Tatur3, Executive Director, ORCID: 0000-0002-6415-5189
A.A.Lukyanitsa3, 4, Doct. of Sci. (Tech), Leading Researcher, ORCID: 0000-0002-0517-0602
A.L.Shishkin5, Director, ORCID: 0009-0008-2041-6368
N.D.Ivanova6, Lecturer, ORCID: 0000-0001-5942-8050
D.V.Enikeev7, Doct. of Sci. (Medicine), Prof., Urologist surgeon, ORCID: 0000-0001-7169-2209
E.S.Yushkov8, Cand. of Sci. (Tech), Docent, ORCID: 0009-0002-9161-0877
М.М.Kuznetsov9, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Prof., Docent, ORCID: 0000-0001-5625-1560
A.Yu.Dolgoborodov2, Doct. of Sci. (Physics and Mathematics), Head of Laboratory, ORCID: 0000-0001-7054-7341
V.S.Ziborov1, 2, Cand. of Sci. (Physics and Mathematics), Senior Researcher, ORCID: 0000-0001-7942-3337
Abstract. The effect of water subjected to cavitation and kept after cavitation for 8 months on the enzyme horseradish peroxidase (HRP) was studied using atomic force microscopy (AFM) and spectrophotometry (SP). No significant changes in the adsorption of HRP on freshly cleaved mica were detected compared to the control enzyme sample. On the contrary, the enzymatic activity of HRP after incubation in water subjected to cavitation 8 months ago decreased twofold. After keeping the enzyme solution in water subjected to cavitation, compared to the control enzyme sample. The detected effect should be considered in the development of biotechnological processes that involve the use of liquid media cavitation.
Keywords: horseradish peroxidase, cavitation, enzyme adsorption
For citation: Yu.D. Ivanov, I.D. Shumov, E.E. Vazhenkova, A.N. Ableev, A.F. Kozlov, A.V. Vinogradova, E.D. Nevedrova, O.N. Afonin, V.Yu. Tatur, A.A. Lukyanitsa, A.L. Shishkin, N.D. Ivanova, D.V. Enikeev, E.S. Yushkov, М.М. Kuznetsov, A.Yu. Dolgoborodov, V.S. Ziborov. The effect of cavitated water on the physicochemical properties of horseradish peroxidase as studied at the level of single enzyme molecules. Time dependence of cavitation effect on enzyme properties. NANOINDUSTRY. 2025. Vol. 18. No. 3–4. PP. 194–202. https://doi.org/
10.22184/1993-8578.2025.18.3-4.194.202.
ВВЕДЕНИЕ
В последнее десятилетие неуклонно растет число научных публикаций, посвященных изучению кавитационных процессов в жидкости и использованию этих процессов в биотехнологии [1] и синтезе наноматериалов [2]. Так, сообщается о перспективности использования кавитационных процессов для обработки шлама [3], очистки сточных вод [4, 5], в пищевой промышленности [6, 7] и биомедицине [1].
В этой связи важно отметить, что кавитационная обработка воды приводит к изменению ее физико-химических свойств [8]. Учитывая растущий интерес к использованию методов кавитационной обработки водных сред в биотехнологии [1], необходимо изучение возможных эффектов водной среды, прошедшей кавитационную обработку, на свойства ферментных систем.
Ранее на примере пероксидазы хрена (ПХ) было продемонстрировано, что движение жидкостей (как воды [9, 10], так и неводных жидкостей [11–16]) и пара [17] может влиять на свойства ферментов. Это влияние объясняется возникновением электромагнитных полей при движении жидкостей вследствие трибоэлектрического эффекта [18–20]. На самом деле внешние электромагнитные поля оказывают заметное влияние на физико-химические свойства ПХ [21–30].
В настоящей работе продолжено исследование воздействия водной среды, подвергнутой кавитационному воздействию, на свойства ПХ методами атомно-силовой микроскопии (АСМ) и спектрофотометрии (СФ). В отличие от первой части работы, в настоящем исследовании изучали эффект воздействия кавитационной воды на ПХ через восемь месяцев после кавитационной обработки воды. В этом случае инкубация пробирки с раствором ПХ в кавитационной воде не приводила к изменению адсорбционных свойств ПХ на слюде. Напротив, методом СФ было зарегистрировано существенное снижение ферментативной активности ПХ после инкубации раствора фермента в воде, подвергнутой кавитации за восемь месяцев до инкубации в ней фермента, в сравнении с контрольным образцом фермента, инкубированным в водопроводной воде.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Использованные реактивы
Как и в первой части исследования, в настоящей работе использовали фермент ПХ, выделенный из хрена (Sigma, Cat. #6782), и 2,2′-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат) (АБТС), который также был приобретен в Sigma (Cat. #A-1888). Пероксид водорода (H2O2, ч.д.а.), лимонная кислота (ос.ч.) и однозамещенный фосфат натрия (Na2HPO4, ч.д.а.) были приобретены в Реахим (Москва). 2 мМ фосфатно-солевой буфер в модификации Дульбекко (ФСБ-Д; pH 7,4) готовили путем растворения готовой смеси солей (Pierce, США) в ультрачистой деионизированной воде. Все растворы, использованные в экспериментах, готовили, используя ультрачистую воду (18.2 MОм × см), очищенную с помощью установки Simplicity UV (Millipore, Франция).
Водопроводная вода
Водопроводная вода соответствовала ГОСТ Р 51232-98 и была отобрана из водопроводной сети. ГОСТ Р 51232-98 распространяется на питьевую воду, производимую и подаваемую централизованными системами питьевого водоснабжения, и устанавливает общие требования к организации и методам контроля качества питьевой воды.
Эксперименты на гидродинамическом генераторе
Для кавитационной обработки воды использовали гидродинамический генератор (ГДГ), изготовленный в ООО ВФ "АВК-БЕТА". ГДГ состоял из статора и ротора, изготовленных из пищевой нержавеющей стали. В статоре имеется паз глубиной 9 мм и шириной 12 мм на среднем радиусе 75 мм. Через 300 мм в статоре размещены радиальные пазы шириной 12 мм. На среднем радиусе 75 мм на роторе имеется шип глубиной 9 мм и шириной 12 мм. Через 300 мм в роторе размещены также радиальные пазы шириной 12 мм. Зазор между пазом статора и шипом ротора составляет 0,3 мм. Скорость вращения ротора составляла 5400 об/мин. Поэтому средняя скорость движений воды, движущейся по пазу статора, составляла 42 м/с. Кавитационные процессы происходят в радиальных пазах статора и ротора. ГДГ работает как центробежный насос со скоростью обработки воды (при однократном пропускании) не менее 5 л/мин. Потребляемая мощность установки при работе на частоте питания 50 Гц – до 8,5 кВт. При работе ГДГ в звуковом диапазоне наблюдаются частоты выше 18 кГц. Основная несущая частота образования зон кавитации при частоте электропитания двигателя 50 Гц составляла 1,9 кГц. Температура воды составляла 70 °C. Фотоизображение ГДГ в сборе представлено на рис.1.
Инкубация фермента в кавитационной воде
Для исследования воздействия кавитационной воды на ПХ 1 мл 10–7 М раствора этого фермента в 2 мМ ФСБ-Д (рабочий раствор ПХ) помещали в одноразовую полипропиленовую пробирку с раствором белка номинальным объемом 1,7 мл. Эту пробирку помещали в стеклянный стакан объемом 2 л, наполненный водой, подвергнутой кавитации восемь месяцев назад (рис.2), и выдерживали в этом стакане при температуре 23 °С в течение трех часов.
Пробирку с контрольным образцом раствора ПХ инкубировали в стакане объемом 2 л с водопроводной водой, не подвергнутой кавитации. Стакан с водопроводной водой размещали на расстоянии 10 м от стакана с водой, подвергнутой кавитации восемь месяцев назад. Время инкубации пробирки с контрольным образцом ПХ в стакане с водопроводной водой также составляло три часа. Рабочий и контрольный образцы раствора ПХ затем исследовали методами АСМ и СФ.
Измерения физико-химических свойств ПХ
АСМ и СФ измерения проводили точно так же, как описано в первой части нашей работы и наших предыдущих статьях [9, 10, 12–16, 21–30]. Коротко, ПХ адсорбировали на подложки из свежесколотой слюды методом непосредственной адсорбции [31] из рабочего и контрольного растворов, инкубированных, как описано в предыдущем разделе ("Инкубация фермента в кавитационной воде"). АСМ-измерения проводили на приборе NTEGRA Prima (NT-MDT, Зеленоград, Россия) в режиме прерывистого контакта с использованием кантилеверов NSG-10 (TipsNano, Эстония) с радиусом иглы 10 нм. Общее число объектов, визуализированных на АСМ-изображениях для каждого образца, составляло не менее 200 шт.
СФ-измерения проводили на спектрофотометре модели 8453 (Agilent Deutschland GmbH, ФРГ) в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны 405 нм по методике, разработанной в [32].
Анализ данных
Анализ данных АСМ проводили по методике, описанной в [33]. Относительное распределение количества объектов по высотам ρ(h) рассчитывали как:
ρ(h) = (Nh/N) × 100%,
где Nh – число визуализированных на подложке частиц с высотой h, а N – общее количество визуализированных на подложке частиц.
Абсолютное число визуализированных на подложке частиц, нормированное на площадь 400 мкм2, рассчитывали по описанию в первой части нашей работы и в [33].
Активность фермента относительно его субстрата АБТС определяли, как описано нами в [22].
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рис.3 показаны типичные АСМ-изображения поверхности подложек из свежесколотой слюды, инкубированных в рабочем и контрольном образцах раствора ПХ.
Из АСМ-изображений, представленных на рис.3, видно, что как из рабочего, так и из контрольного образцов исследуемый фермент адсорбировался на поверхность свежесколотой слюды в форме компактных объектов. Для определения адсорбционных свойств ПХ и точного подсчета числа и определения высот адсорбированных на слюде частиц ПХ требуется построение относительного распределения количества визуализированных частиц по высотам ρ(h) и анализ распределения абсолютного числа визуализированных объектов по высотам N400(h). Полученные для рабочего и контрольного образцов растворов ПХ графики ρ(h) и гистограмма N400(h) представлены на рис.4 и рис.5, соответственно.
Представленные на рис.4 и рис.5 данные показывают, что высоты и число частиц ПХ, адсорбированных на слюду как из рабочего (рис.4, красная кривая; рис.5, красные столбцы), так и из контрольного образцов растворов ПХ (рис.4, синяя кривая; рис.5, синие столбцы) практически одинаково. В самом деле из рабочего раствора на слюду адсорбировалось 566 частиц/400 мкм2, а из контрольного раствора адсорбировалось 502 частицы/400 мкм2. При этом как из рабочего, так и из контрольного образцов ПХ адсорбировалась на слюду в виде смеси ее мономерной и олигомерной форм со значительным (~30%) содержанием мономерной формы, соответствующей частицам с высотами 1,0±0,2 нм [21]. Таким образом, по данным, полученным методом АСМ, можно сделать вывод об отсутствии влияния воды, подвергнутой кавитации восьми месяцев назад, на адсорбционные свойства ПХ на слюде – в отличие от случая, описанного в первой части нашего исследования.
Отметим, что ферментативная активность ПХ после трех часов инкубации образца фермента в стакане с водой, подвергнутой кавитации, была значительно снижена относительно активности фермента в контрольном образце, что отчетливо иллюстрируется полученными зависимостями A405(t), представленными на рис.6.
В самом деле, активность ПХ в контрольном образце была 134,7 ед./(мл раствора фермента), в то время как в рабочем образце активность ПХ была лишь 61,6 ед./(мл раствора фермента). То есть инкубация раствора ПХ в воде, подвергнутой кавитации восемь месяцев назад, приводила к двукратному снижению активности фермента.
ОБСУЖДЕНИЕ
В работе были проведены исследования влияния инкубации раствора ПХ в воде, подвергнутой кавитации за восемь месяцев до инкубации. Аналогично предыдущим работам [9, 10, 12–16, 21–30] использовали метод АСМ для определения адсорбционных свойств фермента на слюде и метод СФ для определения ферментативной активности ПХ. В первой части нашего исследования исследуемые растворы ПХ инкубировали в воде сразу после кавитационного воздействия на нее, что приводило к значительному изменению адсорбционных свойств фермента при сохранении его ферментативной активности.
В противоположность данным, полученным в первой части исследования, в настоящем исследовании не наблюдалось изменений адсорбционных свойств ПХ на свежесколотой слюде. В то же время после инкубации раствора ПХ в воде, подвергнутой кавитации восемь месяцев назад, его ферментативная активность снижалась в два раза по сравнению с контрольным образцом фермента. Наблюдаемый эффект можно объяснить тем, что после кавитационной обработки при 70 °С вода может переходить в новое равновесное состояние, как отмечено ранее Першиным [34]. Такое изменение состояния воды и вызывает существенные понижения активности фермента за счет того, что он может менять свою структуру после перехода воды в новое равновесное состояние.
В связи с растущим интересом к использованию кавитационных процессов в биотехнологии и биомедицине [1], обнаруженный нами эффект воздействия воды, подвергнутой кавитации восемь месяцев назад, на ферментативную активность ПХ следует учитывать в разработке технологических процессов, предполагающих использование явления кавитации в жидкости, а также биомедицинского оборудования, в котором возможно возникновение кавитации.
ВЫВОДЫ
Методом АСМ экспериментально продемонстрировано угнетение ферментативной активности ПХ после воздействия воды, подвергнутой кавитации восемь месяцев назад. А именно, активность ПХ в реакции окисления АБТС в присутствии H2O2 снижалась в два раза после трехчасовой инкубации 10–7 М раствора фермента в воде, подвергнутой кавитации восемь месяцев назад в сравнении с образцом фермента, инкубированным в водопроводной воде также в течение трех часов. При этом не наблюдалось изменений адсорбционных свойств фермента. Учитывая все возрастающий интерес к использованию кавитационных процессов в биотехнологии и пищевой промышленности, обнаруженный нами эффект следует принимать во внимание при разработке технологических процессов, предполагающих использование явления кавитации в жидкости.
БЛАГОДАРНОСТИ
Эксперименты на гидродинамическом генераторе выполнены при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (Государственное задание № 075-00269-25-00). Измерения свойств фермента методами АСМ и спектрофотометрии выполнены в рамках Программы фундаментальных научных исследований в Российской Федерации на долгосрочный период (2021–2030 годы) (№122030100168-2).
ИНФОРМАЦИЯ О РЕЦЕНЗИРОВАНИИ
Редакция благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы, а также за размещение статей на сайте журнала и передачу их в электронном виде в НЭБ eLIBRARY.RU.
Декларация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Zheng H., Zheng Y., Zhu J. Recent Developments in Hydrodynamic Cavitation Reactors: Cavitation Mechanism, Reactor Design, and Applications. Engineering 2022. Vol. 19. PP. 180–198. https://doi.org/10.1016/j.eng.2022.04.027
Sun X., Chen S., Liu J., Zhao S., Yoon J.Y. Hydrodynamic Cavitation: A Promising Technology for Industrial-Scale Synthesis of Nanomaterials. Front. Chem. 2020. Vol. 8. P. 259. https://doi.org/10.3389/fchem.2020.00259
Petkovšek M., Mlakar M., Levstek M., Stražar M., Širok B., Dular M. A novel rotation generator of hydrodynamic cavitation for waste-activated sludge disintegration. Ultrasonics Sonochem. 2015. Vol. 26. PP. 408–414. http://dx.doi.org/10.1016/j.ultsonch.2015.01.006
Комарова Е.В., Слабунова А.В., Харитонов С.Е. Применение эффекта кавитации при очистке сточных вод животноводства. Экология и водное хозяйство. 2021. № 3 (2). С. 61–74. https://doi.org/10.31774/2658-7890-2021-3-2-61-74
Tao Y., Cai J., Huai X., Liu B., Guo Z. Application of hydrodynamic cavitation to wastewater treatment. Chem. Eng. Technol. 2016. Vol. 39 (8). PP. 1363–1376. https://doi.org/10.1002/ceat.201500362
Науменко Н.В., Малинин А.В., Цатуров А.В. Поиск путей повышения сохраняемости хлебобулочных изделий. Вестник ЮУрГУ. Серия "Пищевые и биотехнологии". 2018. № 6 (2). С. 58–66. https://doi.org/10.14529/food180208
Asaithambi N., Singha P., Dwivedi M., Singh S.K. Hydrodynamic cavitation and its application in food and beverage industry: a review. J. Food Process Eng. 2019. Vol. 42 (5). P. e13144. https://doi.org/10.1111/jfpe.13144
Кулагин В.А., Сапожникова Е.С., Стебелева О.П., Кашкина Л.В., Чжэн Ч. Ин, Ли Ц., Ли Ф.Ч. Особенности влияния эффектов кавитации на физико-химические свойства воды и стоков. Журнал Сибирского Федерального Университета. Серия: Техника и технологии. 2014. № 7 (5). С. 605–614.
Ivanov Y.D., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Romanova T.S.; Valueva A.A., Tatur V.Y., Stepanov I.N., Ziborov V.S. Investigation of the Influence of Liquid Motion in a Flow-based System on an Enzyme Aggregation State with an Atomic Force Microscopy Sensor: The Effect of Water Flow. Appl. Sci. 2020. Vol. 10 (13). P. 4560. https://doi.org/10.3390/app 10134560
Ivanov Y.D., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Larionov D.I., Repnikov V.V., Ivanova N.D., Tatur V.Yu., Stepanov I.N., Ziborov V.S. AFM and FTIR Investigation of the Effect of Water Flow on Horseradish Peroxidase. Molecules. 2021. Vol. 26(2). P. 306. https://doi.org/10.3390/molecules26020306
Ziborov V.S., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Ivanova I.A., Valueva A.A., Tatur V.Y., Negodailov A.N., Lukyanitsa A.A., Ivanov Y.D. Investigation of the Influence of Liquid Motion in a Flow-Based System on an Enzyme Aggregation State with an Atomic Force Microscopy Sensor: The Effect of Glycerol Flow. Appl. Sci. 2020. Vol. 10 (14). P. 4825. https://doi.org/10.3390/app 10144825
Ivanov Y.D., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Ivanova I.A., Ershova M.O., Tatur V.Yu., Ziborov V.S. AFM Study of the Influence of Glycerol Flow on Horseradish Peroxidase near the in/out Linear Sections of a Coil. Appl. Sci. 2021. Vol. 11(4). P. 1723. https://doi.org/10.3390/app 11041723
Ivanov Y.D., Shumov I.D., Kozlov A.F., Ershova M.O., Valueva A.A., Ivanova I.A., Tatur V.Y., Lukyanitsa A.A., Ivanova N.D., Ziborov V.S. Glycerol Flow through a Shielded Coil Induces Aggregation and Activity Enhancement of Horseradish Peroxidase. Appl. Sci. 2023. Vol. 13. P. 7516. https://doi.org/10.3390/app 13137516
Ivanov Y.D., Shumov I.D., Kozlov A.F., Ershova M.O., Valueva A.A., Ivanova I.A., Tatur V.Y., Lukyanitsa A.A., Ivanova N.D., Ziborov V.S. Stopped Flow of Glycerol Induces the Enhancement of Adsorption and Aggregation of HRP on Mica. Micromachines. 2023. Vol. 14. P. 1024. https://doi.org/10.3390/mi14051024
Ivanov Y.D., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ershova M.O., Ivanova I.A., Ableev A.N., Tatur V.Y., Lukyanitsa A.A., Ivanova N.D., Ziborov V.S. Atomic Force Microscopy Study of the Long-Term Effect of the Glycerol Flow, Stopped in a Coiled Heat Exchanger, on Horseradish Peroxidase. Micromachines 2024. Vol. 15 (4). P. 499. https://doi.org/10.3390/mi15040499
Иванов Ю.Д., Шумов И.Д., Козлов А.Ф., Ершова М.О., Валуева А.А., Иванова И.А., Татур В.Ю., Лукьяница А.А., Иванова Н.Д., Неведрова Е.Д., Зиборов В.С. АСМ-исследование пост-эффекта движения глицерина в выходной части проточной системы на адсорбционные свойства белка. Наноиндустрия 2023. № 16 (2). С. 106–113. https://doi.org/10.22184/1993-8578.2023.16.2.106.113
Ivanov Y.D., Shumov I.D., Tatur V.Y., Valueva A.A., Kozlov A.F., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. AFM Investigation of the Influence of Steam Flow through a Conical Coil Heat Exchanger on Enzyme Properties. Micromachines 2022. Vol. 13. P. 2041. https://doi.org/10.3390/mi13122041
Тэнесеску Ф., Крамарюк Р. Электростатика в технике. М.: Энергия, 1980. 296 c.
Yoo D., Jang S., Cho S., Choi D., Kim D.S. A Liquid Triboelectric Series. Adv. Mater. 2023. Vol. 35 (26). P. 2300699. https://doi.org/10.1002/adma.202300699
Balmer R. Electrostatic Generation in Dielectric Fluids: The Viscoelectric Effect. In Proceedings of the WTC2005 World Tribology Congress III, Washington, DC, USA, 12–16 September 2005. Paper No. WTC2005-63806. https://doi.org/10.1115/WTC2005-63806
Ivanov Y.D., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Ivanova I.A., Valueva A.A., Tatur V.Y., Smelov M.V., Ivanova N.D., Ziborov V.S. AFM imaging of protein aggregation in studying the impact of knotted electromagnetic field on a peroxidase. Sci. Rep. 2020. Vol. 10. P. 9022. https://doi.org/10.1038/s41598-020-65888-z
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. The Effect of a Dodecahedron-Shaped Structure on the Properties of an Enzyme. J. Funct. Biomater. 2022. Vol. 13. P. 166. https://doi.org/10.3390/jfb13040166
Ziborov V.S., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Larionov D.I., Evdokimov A.N., Tatur V.Y., Aleshko A.I., Sakharov K.Y., Dolgoborodov A.Y., Fortov V.E., Archakov A.I., Ivanov Y.D. The Impact of Fast-Rise-Time Electromagnetic Field and Pressure on the Aggregation of Peroxidase upon Its Adsorption onto Mica. Appl. Sci. 2021. Vol. 11(24). P. 11677. https://doi.org/10.3390/app 112411677
Ivanov Yu.D., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Ivanova I.A., Valueva A.A., Ershova M.O., Tatur V.Yu., Stepanov I.N., Repnikov V.V., Ziborov V.S. AFM study of changes in properties of horseradish peroxidase after incubation of its solution near a pyramidal structure. Sci. Rep. 2021. Vol. 11(1). P. 9907. https://doi.org/10.1038/s41598-021-89377-z
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Repnikov V.V., Stepanov I.N., Ziborov V.S. Effect of Spherical Elements of Biosensors and Bioreactors on the Physicochemical Properties of a Peroxidase Protein. Polymers. 2021. Vol. 13(10). P. 1601. https://doi.org/10.3390/polym13101601
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Pleshakova T.O., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. The Effect of Incubation near an Inversely Oriented Square Pyramidal Structure on Adsorption Properties of Horseradish Peroxidase. Appl. Sci. 2022. Vol. 12. P. 4042. https://doi.org/10.3390/app 12084042
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. Atomic Force Microscopy Study of the Effect of an Electric Field, Applied to a Pyramidal Structure, on Enzyme Biomolecules. J. Funct. Biomater. 2022. Vol. 13. P. 234. https://doi.org/10.3390/jfb13040234
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. The Influence of a High-Voltage Discharge in a Helicoidal Twisted-Pair Structure on Enzyme Adsorption. Electronics. 2022. Vol. 11. P. 3276. https://doi.org/10.3390/electronics11203276
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. The Effect of a Rotating Cone on Horseradish Peroxidase Aggregation on Mica Revealed by Atomic Force Microscopy. Micromachines. 2022. Vol. 13. P. 1947. https://doi.org/10.3390/mi13111947
Ivanov Y.D., Tatur V.Y., Shumov I.D., Kozlov A.F., Valueva A.A., Ivanova I.A., Ershova M.O., Ivanova N.D., Stepanov I.N., Lukyanitsa A.A., Ziborov V.S. Effect of a Conical Cellulose Structure on Horseradish Peroxidase Biomacromolecules. Appl. Sci. 2022. Vol. 12. P. 11994. https://doi.org/10.3390/app 122311994
Kiselyova O.I., Yaminsky I., Ivanov Y.D., Kanaeva I.P., Kuznetsov V.Y., Archakov A.I. AFM study of membrane proteins, cytochrome P 4502B4, and NADPH–Cytochrome P 450 reductase and their complex formation. Arch. Biochem. Biophys. 1999. Vol. 371. PP. 1–7. https://doi.org/10.1006/abbi.1999.1412
Sanders S.A., Bray R.C., Smith A.T. pH-dependent properties of a mutant horseradish peroxidase isoenzyme C in which Arg38 has been replaced with lysine, Eur J Biochem 1994. Vol. 224. PP. 1029–1037. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1994.01029.x
Pleshakova T.O., Kaysheva A.L., Shumov I.D., Ziborov V.S., Bayzyanova J.M., Konev V.A., Uchaikin V.F., Archakov A.I., Ivanov Y.D. Detection of hepatitis C virus core protein in serum using aptamer-functionalized AFM chips. Micromachines. 2019. Vol. 10. P. 129. https://doi.org/10.3390/mi10020129
Першин С.М. Квантовая природа значений температуры особых точек воды: -80, -42, 4, 19, 36.6, 48, 60 °С. Тезисы докладов 3й всероссийской конференции "Физика водных растворов". Москва, 14–15 декабря 2020. 56 с. С. 41. https://doi.org/10.24412/cl-35040-2020-41-41
Отзывы читателей
